豬圓環(huán)病毒2 型吉林分離株的全基因組序列分析

苗麗娟, 劉東旭, 尹柏雙

(1.吉林農(nóng)業(yè)科技學(xué)院動(dòng)物科技學(xué)院, 吉林 吉林132101 ;2.預(yù)防獸醫(yī)學(xué)吉林省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 吉林 吉林132101)

豬圓環(huán)病毒2 型(PCV2 ) 隸屬于圓環(huán)病毒科(Circoviridae)圓環(huán)病毒屬成員,是迄今為止發(fā)現(xiàn)的最小的動(dòng)物病毒之一[1],是斷奶仔豬多系統(tǒng)衰竭綜合征(PMWS)、豬皮炎腎病綜合征(PDNS)等相關(guān)疾病的主要病原[2],PCV2 可引起免疫抑制,繼發(fā)其他疾病感染,給養(yǎng)豬業(yè)造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失。

PCV2 包括不同亞型,有PCV -2a,PCV -2b,PCV-2c,PCV -2d[3]四種亞型,試驗(yàn)表明,病理癥狀的不同,毒株之間的差異比亞型之間的差異更重要。 PCV2 隱性感染一直存在,本課題組主要進(jìn)行豬病毒病的分子診斷,對(duì)于送檢的陽(yáng)性病料進(jìn)行分離培養(yǎng),2017 年3 月從送檢到我實(shí)驗(yàn)室的陽(yáng)性豬體上分離出一株P(guān)CV2,命名為PCV2 -2017。 本試驗(yàn)通過(guò)對(duì)PCV2 基因組序列的測(cè)序分析,為該病的防治提供理論依據(jù)和參考。

1 材料與方法

1.1 毒株 2017 年從吉林省某豬場(chǎng)送檢的病豬分離出1 株P(guān)CV2,命名為PCV2 -2017。

1.2 主要試劑 DNA 提取試劑盒、質(zhì)粒提取試劑盒,購(gòu)自康為世紀(jì)生物科技有限公司;Taq DNA 聚合酶(含10 ×Buffer 25 mmo1/L MCl2)、 dNTP、pMD18-T 寶生物工程(大連)有限公司。

1.3 方法

1.3. 1 引物的設(shè)計(jì)與合成 根據(jù)GenBank 中PCV2 保守區(qū)進(jìn)行全基因組序列,設(shè)計(jì)了4 對(duì)引物,引物序列見(jiàn)表1,引物由長(zhǎng)春庫(kù)美生物工程有限公司合成。

1.3.2 PCV2 DNA 的提取 按照Universal Genomic DNA Kit 試劑盒操作說(shuō)明書(shū),從細(xì)胞培養(yǎng)液中提取病毒基因組中DNA,用適量的TE 溶解, -20 ℃,保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.3 PCV2 全基因組的擴(kuò)增、克隆和測(cè)序 應(yīng)用Oligo 6.24 軟件設(shè)計(jì)的PCV2 4 對(duì)引物, PCR 的反應(yīng)體系為25 μL,1 μL 的up/low(20 pmol/μL)、3 μL dNTP(2. 5 mmol/μL),2. 5 μL 的10 × Buffer、0.25 μL的r Taq 酶、14.25 μL 的滅菌水,反應(yīng)條件為35 個(gè)cycle,預(yù)變性94 ℃5 min 后,進(jìn)入循環(huán)94 ℃50 s,56 ℃1 min 30 s,72 ℃50 s,72 ℃延伸7 min。 0.8% 瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)擴(kuò)增條帶,將目的基因與pMD -18T 載體連接轉(zhuǎn)化,將鑒定后陽(yáng)性菌送長(zhǎng)春庫(kù)美生物工程有限公司測(cè)序。

表1 擴(kuò)增PCV2 全基因序列的引物

1.3.4 PCV2 全基因組、Rep、Cap 和ORF3 基因的序列比對(duì)分析 采用DNAStar 軟件進(jìn)行序列拼接,使用MegAlign 將PCV2 -2017 與GenBank 中收錄的PCV2 的國(guó)內(nèi)外參考毒株的全基因組序列、ORF1、ORF2 基因、ORF3 基因變異性和同源性進(jìn)行分析,分析其遺傳進(jìn)化關(guān)系,參考毒株見(jiàn)表2。

表2 進(jìn)化分析采用的參考毒株

2 結(jié)果

2.1 全基因組序列分析 用DNAStar 軟件將測(cè)得的序列進(jìn)行拼接,結(jié)果表明,PCV2 -2017 毒株全長(zhǎng)1 767 bp。 核酸同源性分析表明,與法國(guó)株AF055394同源性最高,可達(dá)99 %,與美國(guó)株AF055391、四川株HM102350 同源性最低,為96%。 用MegAlign 分析PCV2-2017 毒株與GenBank 中收錄的其他PCV2 毒株的遺傳進(jìn)化關(guān)系,結(jié)果見(jiàn)圖1,由圖1 可以看出,PCV2 毒株可以分為2 個(gè)分支,其中1 個(gè)分支中AY322001、AB426905 和國(guó)內(nèi)GU370064、AY691169、AY969004、DQ180393 毒株親緣關(guān)系較近;PCV2 -2017 新分離株與HM102350、JQ809464、GU124593、AF055394、AF055391、GU325757、JX512856 組成第2個(gè)分支,與法國(guó)株AF055394 親緣關(guān)系最近,同屬于PCV-2b 亞型,與JQ809464、HM102350、GU124593 親緣關(guān)系也較近。

2.2 ORF1 和ORF3 基因序列變化和同源性分析 PCV2 -2017 毒株中ORF1 基因全長(zhǎng)946 bp,編碼Rep 蛋白,GenBank 上核酸和氨基酸同源性分析,結(jié)果同源性都為99%,在867 nt C 變?yōu)門(mén),導(dǎo)致丙氨基酸變?yōu)槔i氨基酸。

PCV2 -2017 毒株中ORF3 基因長(zhǎng)為315 bp,核酸同源性比對(duì)結(jié)果為100%,ORF3 編碼的蛋白,與病毒在機(jī)體內(nèi)的致病性和病毒誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡有關(guān),說(shuō)明該蛋白比較保守。

圖1 部分PCV2 基因組序列構(gòu)建的遺傳進(jìn)化分析PCV2 -2017 本試驗(yàn)新分離株

2.3 ORF2 基因的序列變化和分析 PCV2 -2017新分離株中Cap 基因長(zhǎng)度為702 bp,編碼Cap 蛋白,在GenBank 中進(jìn)行核酸同源性比對(duì),核苷酸同源性在96% ～99%之間;氨基酸同源性比對(duì),同源性在94% ～99%之間,說(shuō)明PCV2 變異主要發(fā)生在ORF2區(qū),共有12 個(gè)點(diǎn)突變,突變主要集中在670 nt ～680 nt 之間,有4 個(gè)位點(diǎn)突變,其余分散于ORF2 的其他位置,部分結(jié)果如圖2 所示。 導(dǎo)致相應(yīng)的氨基酸也發(fā)生改變,這是否導(dǎo)致抗原性發(fā)生改變還需要進(jìn)一步研究。

圖2 PCV2 -2017 吉林株ORF2 核酸序列部分對(duì)比結(jié)果

3 討論與分析

通過(guò)本試驗(yàn)獲取吉林新分離株P(guān)CV2 -2017,并對(duì)全基因組結(jié)構(gòu)進(jìn)行序列分析。 本次獲得PCV2 基因組全長(zhǎng)1 767 bp,與PCV-2b 亞型參考株AF055394親緣關(guān)系最近,所以屬于PCV-2b 亞型,2003 年以前PCV-2a 為主要的流行毒株,現(xiàn)在PCV-2b 為流行的主要毒株[4-6]。

PCV2 -2017 ORF1 經(jīng)過(guò)測(cè)序拼接后長(zhǎng)度為946 bp, ORF1 編碼Rep 蛋白,僅在867 nt 位置C 變?yōu)門(mén),導(dǎo)致272 aa 變異,由丙氨基酸變?yōu)槔i氨基酸,對(duì)其功能是否有影響還需要進(jìn)一步探究,Rep 蛋白與病毒的復(fù)制相關(guān),比較保守;ORF3 長(zhǎng)度為315 bp,編碼的蛋白與病毒的致病性有關(guān),能誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡;ORF2 測(cè)序拼接后長(zhǎng)度為702 bp,編碼Cap 蛋白,Cap 蛋白是PCV2 的主要結(jié)構(gòu)蛋白,與病毒的致病性和抗原表位有關(guān),具有較大的變異性,是刺激機(jī)體產(chǎn)生免疫保護(hù)應(yīng)答的重要靶抗原。