抗豬流行性腹瀉病毒卵黃抗體制劑的研究及其臨床應用

李桂珍, 王愛富, 李 舜, 馬春全, 付 強

(佛山科學技術學院生命科學與工程學院動物醫(yī)學系, 廣東 佛山528000)

豬流行性腹瀉(PED ) 是由豬流行性腹瀉病毒(PEDV ) 引起的一種高度接觸性急性腸道傳染病,其臨床主要特征是嚴重脫水、腹瀉、嘔吐。 該病容易感染各種年齡豬,且對哺乳仔豬具有高發(fā)病率和高致死率,尤其是7 日齡以內的哺育仔豬,感染后死亡率可達100%。 自2010 年以來,PED 在我國多個地區(qū)集中暴發(fā)流行,目前使用的傳統(tǒng)疫苗免疫效果不明顯,而市場上尚未出現(xiàn)有效的治療藥物,每年造成仔豬大量死亡,給我國養(yǎng)豬行業(yè)帶來重大經(jīng)濟損失。

卵黃抗體以其優(yōu)質高產(chǎn)、安全高效、無毒副作用和生產(chǎn)便利等諸多優(yōu)點,不僅可以應用于豬病的診斷和防治,還可作為飼料添加劑以提高豬的生產(chǎn)性能,對于增加豬場的效益、促進養(yǎng)豬業(yè)健康持久發(fā)展具有重大現(xiàn)實意義。 本試驗采用噴霧干燥技術和冷凍干燥技術研制卵黃抗體粉和卵黃抗體凍干粉,并利用原核表達的PEDV 重組S 蛋白來建立間接ELISA 檢測其抗體效價,應用于動物治療試驗,臨床效果良好,為預防和治療PED 提供了新的解決辦法。

1 材料與方法

1.1 病料樣品 仔豬小腸采自廣東省某一規(guī)?；i場,經(jīng)RT-PCR 鑒定為PEDV 陽性,-80 ℃保存。

1.2 主要試劑 TRIZol 購自Invitrogen 公司;反轉錄試劑盒、DNA Marker、Ex Taq DNA 聚合酶、pMD19 -T載體及pET-32a 表達載體,購自寶生物工程(大連)有限公司;膠回收試劑盒,購自Axygen 公司;Trans 5α 感受態(tài)細胞、BL21(DE3)感受態(tài)細胞及Ni-NTA蛋白純化柱,購自北京全式金生物技術有限公司;蛋白疫苗由佛山科學技術學院基礎獸醫(yī)研究室制備;50 只初產(chǎn)蛋雞購自,佛山三水一養(yǎng)雞場;羊抗豬酶標二抗、兔抗雞酶標二抗,購自Abcam 公司;TMB顯色液,購自天根生化科技(北京)有限公司,其余試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.3 PEDV S1 基因的克隆鑒定

1.3.1 引物設計 參考GenBank 中PEDV S1 基因序列(登錄號JN601050.1),利用Primer 5.0 軟件設計一對含酶切位點的特異性引物,即S1 - F：5′ -AGGCATTGATAGTGGCG-3′,BamH I;S1 -R：5′ - GGCATTGGCAGCGTAA - 3′,EcoR I;引物由(上海)生工生物工程技術服務有限公司合成,預期擴增產(chǎn)物大小為523 bp。

1.3.2 病毒RNA 的提取及RT -PCR 鑒定 將采集的小腸樣品反復研磨勻漿,按TRIZol 試劑使用說明書提取總RNA。 按反轉錄試劑盒說明書合成cDNA,并以此cDNA 為模板進行PCR 擴增。 擴增體系50 μL： Ex Taq DNA 混合液25 μL,上下游引物(10 μmoL/L)各2.5 μL,cDNA 模板2 μL,dH2O 18 μL。 PCR 反應條件為：95 ℃預變性5 min;94 ℃變性40 s,55 ℃退火35 s,72 ℃延伸1 min,30 個循環(huán);72 ℃再延伸10 min。 擴增產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠電泳鑒定。

1.3.3 S1 基因克隆鑒定 PCR 產(chǎn)物經(jīng)膠回收后克隆至pMD19 -T 載體中,并轉化至DH5α,涂布于氨芐抗性LB 平板上,37 ℃過夜培養(yǎng),提取陽性菌液質粒pMDTM19T-S1 -523 送往(上海)生工生物工程技術服務有限公司測序。

1.4 PEDV S1 基因表達載體構建及鑒定 將重組質粒pMDTM19T-S1 -523 與pET-32a 空載體利用BamH I 和EcoR I 雙酶切并電泳鑒定,目的片段膠回收后16 ℃連接過夜。 連接產(chǎn)物轉化至DH5α 感受態(tài)細胞,涂布于氨芐抗性LB 平板上,37 ℃過夜培養(yǎng),提取陽性菌液質粒pET32a -S1 -523 送往上海生工生物工程技術服務有限公司測序。 陽性質粒pET32a-S1 -523 轉化至BL21(DE3)感受態(tài)細胞,篩選陽性單菌落,擴大培養(yǎng),-80 ℃保存。

1.5 重組蛋白的誘導表達及純化 將鑒定正確的重組菌液pET32a-S1 -523 -BL21 于37 ℃、220 r/min擴大培養(yǎng)至OD600值約為0.4,加入終濃度為0.4 mmoL/L IPTG 誘導7 h,12 000 r/min(4 ℃)離心10 min,菌體沉淀超聲破碎后,12 000 r/min(4 ℃)離心10 min,留取上清用鎳-NTA 蛋白純化柱純化,并用SDS-PAGE 鑒定。

1.6 重組蛋白的Western Blot 鑒定 純化的重組蛋白經(jīng)SDS-PAGE 電泳后,轉印至PVDF 膜上,5%脫脂奶粉室溫搖動封閉過夜,加2 000 倍稀釋的PEDV 陽性血清室溫孵育5 h,加40 000倍稀釋的羊抗豬IgG 酶標二抗室溫孵育3 h,在ECL 化學發(fā)光顯色液中避光顯色20 min,拍照保存。

1.7 檢測卵黃抗體效價間接ELISA 方法的建立 將純化的重組蛋白稀釋成3.2 μg/mL,加入到酶標板中,100 μL/孔,37 ℃孵育2 h 后4 ℃過夜;次日用PBST 洗滌2 次,每次200 μL/孔;加5%脫脂奶粉200 μL/孔,在37 ℃封 閉2 h,用200 μL/孔 的PBST 洗3 次;加卵黃抗體等一抗倍比稀釋,37 ℃孵育45 min,用200 μL/孔的PBST 洗3 次;加兔抗雞IgY 酶標二抗1 ∶5 000 稀釋后于37 ℃孵育45 min,之后再用200 μL/孔的PBST 洗5 次;加入TMB 顯色液100 μL/孔,于37 ℃避光顯色20 min,再加入50 μL/孔的終止液終止反應,立刻用酶標儀測出OD450值。

1.8 卵黃抗體制劑的制備

1.8.1 蛋雞免疫程序 初產(chǎn)蛋雞適應性飼養(yǎng)15 d,首次用蛋白疫苗翅下胸肌多點免疫,0.5 mL/只,并于免疫后10、25、55、85 d 加強免疫,1 mL/只。

1.8.2 卵黃抗體粉的研制 將雞蛋用新潔爾滅水溶液消毒15 min,仔細分離卵黃,卵黃液攪拌混勻,加蒸餾水稀釋,加入0.1%葡萄糖、0.03%山梨酸鉀和適量鮮牛奶,于140 ℃噴霧干燥處理,卵黃粉存放在陰涼干燥處備用。

1.8.3 卵黃抗體凍干粉的研制 將雞蛋用新潔爾滅水溶液消毒15 min,仔細分離卵黃,卵黃液攪勻,加蒸餾水1∶7稀釋,調節(jié)pH 值至5.0 ～5.2,4 ℃靜置過夜,加PEG 6000 至終濃度3.5%,混勻靜置5 h,加飽和硫酸銨至終濃度40%混勻靜置5 h,10 000 r/min(4 ℃)離心10 min,將沉淀冷凍干燥,-20 ℃保存。

1.8.4 卵黃抗體制劑效價檢測 用自建的間接ELISA 方法檢測卵黃抗體制劑的效價。

1.9 動物治療試驗 應用高效價和高劑量的卵黃抗體制劑對正在發(fā)生嚴重豬流行性腹瀉的廣東某一規(guī)?；i場和北京某一規(guī)?；i場中患病仔豬進行治療試驗。 患病仔豬以自然出生欄數(shù)為單位,隨機挑取各試驗每欄仔豬數(shù)。 卵黃粉抗體組自患病仔豬出生連續(xù)3 d 口服進行治療,共治療7 欄75 頭患病仔豬。 卵黃液抗體組自患病仔豬出生連續(xù)3 d 灌服治療,共計7 欄69 頭患病仔豬。 精制卵黃抗體適量稀釋后自患病仔豬出生連續(xù)3 d 肌肉注射治療,共計6欄54 頭患病仔豬。 所有患病仔豬自治療試驗開始連續(xù)7 d 觀察仔豬的精神狀態(tài)、健康程度等,同時記錄死亡數(shù)和7 日后的健康仔豬數(shù),計算治愈率。

2 結果

2.1 PEDV S1 基因的RT -PCR 鑒定結果 抽提PEDV RNA 反轉錄合成cDNA,以此cDNA 為模板,利用S1 基因特異性引物擴增出目的條帶,大小約523 bp,與預期的目的片段大小一致(圖1)。

圖1 S1 基因PCR 擴增結果

2.2 重組質粒pET32a -S1 -523 -BL21 雙酶切鑒定結果 單酶切結果顯示,在5 000 bp 至7 000 bp間有一目的條帶,大小約6 413 bp;雙酶切結果顯示,在5 900 bp 處有一目的條帶,與pET32a( +)蛋白表達載體片段大小一致,在513 bp 處有一目的條帶,符合預期結果(圖2)。

2.3 重組蛋白純化結果 利用Ni-NTA 柱純化重組蛋白,經(jīng)SDS-PAGE 蛋白電泳分析,純化后的蛋白大小約32.8 kDa,與預期結果一致(圖3)。

2.4 重組蛋白Western Blot 鑒定結果 重組蛋白經(jīng)過Western Blot 鑒定,在PVDF 膜上有一32.8 kDa大小的目的條帶,與預期結果相符,說明重組蛋白特異性良好(圖4)

圖2 重組質粒酶切結果

圖3 純化的重組蛋白

圖4 重組蛋白的Western Blot 結果

2.5 卵黃抗體制劑效價檢測結果 卵黃抗體制劑在第3 次加強免疫后,抗體滴度均維持在較高水平(圖5)。

圖5 卵黃抗體制劑效價測定結果

2.6 動物治療試驗結果 通過對患病仔豬連續(xù)7 d的觀察,所有仔豬在出生18 h 后均出現(xiàn)水樣腹瀉。對照組總計40 頭患病仔豬,7 d 時間死亡33 頭,僅剩7 頭存活,且比較瘦弱。 卵黃抗體粉組經(jīng)過治療有56 頭恢復健康,治愈率為74.67%。 卵黃抗體液組經(jīng)過治療有54 頭恢復健康,治愈率為78.26%。卵黃抗體凍干粉組經(jīng)過治療有41 頭恢復健康,治愈率為75.93%。 說明卵黃抗體制劑的臨床應用效果良好(表1)。

表1 3 種卵黃抗體制劑治療PED 的治愈率

3 討論

1971 年在英國首次報道了PED 的流行,其臨床癥狀與豬傳染性胃腸炎相似,此后PED 在歐洲暴發(fā)[1-2]。 美國在2013 年5 月暴發(fā)PED,并迅速侵染全國乃至相鄰的墨西哥和加拿大,造成一年近千萬頭仔豬死亡,經(jīng)濟損失巨大[3-4]。 與我國相鄰的韓國、日本等也曾報道過PED 的流行情況[5]。 1984年,宣華等研究證實我國豬群中存在PED,之后一直呈散發(fā)狀態(tài),未出現(xiàn)大范圍流行。 然而2010 年以來,PEDV 在我國多個省份暴發(fā)流行[6]。 黃冬妮等通過對8 株PEDV 的ORF3 和M 基因序列比對及遺傳分析,結果顯示,OPF3 基因和M 基因與經(jīng)典毒株CV777 的親緣關系較遠,說明廣東省流行的毒株以變異的新毒株為主[8]。 羅六龍等將12 個樣本的PEDV S1 基因序列與經(jīng)典毒株CV777 序列對比發(fā)現(xiàn),僅有一個樣本氨基酸同源性為100%,證實了近年來廣東省流行毒株以變異株為主[8]。 李井春等將分離的PEDV 遼寧株測序分析后,發(fā)現(xiàn)該毒株與2013 年美國暴發(fā)毒株以及我國2010 年毒株核苷酸和氨基酸同源性較高,而與疫苗株同源性較低,表明遼寧地區(qū)PEDV 出現(xiàn)變異[9]。 專家學者們普遍認為PEDV 在我國出現(xiàn)了新的變種,導致現(xiàn)有疫苗免疫無效,每年造成大量哺乳仔豬死亡,給我國養(yǎng)豬業(yè)帶來巨大經(jīng)濟損失。

PEDV S 蛋白上的抗原決定簇能誘導機體產(chǎn)生良好的免疫反應,其697aa ～742aa 的中和表位免疫原性最強。 本研究選取S1 基因包含了697aa ～742aa 的中和表位,這使得PEDV S 蛋白在調節(jié)病毒與特定宿主細胞受體糖蛋白間發(fā)揮重要作用,并可介導病毒進入自然宿主細胞,刺激機體產(chǎn)生中和抗體[10-11]。 另外,S 蛋白的同源性非常低,在血清學上不存在交叉反應[12]。 因此PEDV S 蛋白是研制PEDV 蛋白疫苗的首選。 卵黃抗體IgY 穩(wěn)定性強、耐酸性、耐高溫,本試驗采用噴霧干燥技術和冷凍干燥技術將卵黃抗體制成卵黃抗體粉和卵黃抗體凍干粉,相比之前液態(tài)的卵黃抗體,所占空間小,更易儲存和運輸。

針對卵黃抗體的臨床應用效果,秦文等研制的抗PEDV、TGEV、RV 高免卵黃液治療以豬流行性腹瀉為主的病毒性腹瀉,其治愈率高達90.48% ～100%,應用效果顯著[13]。 崔煥忠等利用純化后的抗TGEV 與PEDV 卵黃抗體治療患病仔豬,其人工感染治愈率高達100%,臨床應用治愈率為88%,治療效果顯著[14]。本試驗采用高劑量高效價卵黃抗體制劑對患病仔豬進行治療試驗。 結果顯示,卵黃抗體粉組的治愈率為74.67%,卵黃抗體液組的治愈率為78.26%,卵黃抗體凍干粉組的治愈率為75.93%。 說明卵黃抗體對豬流行性腹瀉仔豬具有一定的治療作用,但臨床應用結果與前人研究存在一定差距,原因可能與本研究試驗豬場存在其他傳染性疾病病原有關。 本研究采用PEDV 流行毒株S1 蛋白作為免疫原免疫蛋雞制成3種卵黃抗體制劑,并將高劑量高效價的制劑初步應用于動物治療試驗,證實卵黃抗體制劑具有一定的臨床效果。 未來我們還需要進一步研究,以期為防控PED提供簡便高效的解決方法。