動物肝損傷模型建立的研究進展

周仲強，魏恩巍

(1.吉化集團總醫(yī)院 藥劑科，吉林 吉林 132000；2.吉林大學 藥學院，吉林 長春 130021)

肝臟是人體內(nèi)主要的代謝器官，而肝損傷引起的多種肝臟疾病是嚴重影響人們的身體健康的常見疾病.造成肝損傷的原因有很多，包括化學性、代謝性、藥物性、酒精性及環(huán)境因素等，長期的肝損傷往往會進一步發(fā)展成肝纖維化、肝硬化、肝癌及肝功能衰竭[1].肝損傷是各種肝臟疾病的病變結(jié)果，對肝損傷的防治目前仍是一個嚴峻的課題.構(gòu)建恰當?shù)母螕p傷動物模型，是研究肝損傷的發(fā)病機制，探索新的治療方法的基礎(chǔ)[2].近年來對于肝損傷的治療似乎是熱點[3]，通過建立實驗性肝損傷動物模型，研究肝病發(fā)生的機制與靶點，篩選出較優(yōu)的保肝藥物，探索保肝的作用原理，是具有重要的現(xiàn)實意義.因此本文闡述了近些年動物不同肝損傷模型的概況以及相應(yīng)抗肝損傷機制，對日后關(guān)于肝損傷的研究提供理論基礎(chǔ)，具有一定的應(yīng)用價值.

1 CCl4誘導肝損傷

四氯化碳(CCl4)肝損傷動物模型是最經(jīng)典的試驗性模型.CCl4 進入體內(nèi)后,在肝細胞的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中經(jīng)細胞色素P450氧化酶的代謝,生成活潑的三氯甲基自由基和氯自由基.這些自由基可與細胞內(nèi)和細胞膜的大分子共價結(jié)合,使酶的功能喪失,細胞膜脂質(zhì)過氧化,胞漿Ca2+濃度升高,胞漿內(nèi)轉(zhuǎn)氨酶滲入血液[4],導致肝細胞損傷.

Rofiee[5]等人將文定果葉子干燥粉碎后浸泡在甲醇里72h后，取上清液濃縮

后保存在4 ℃條件下.分成3個劑量組對大鼠進行灌胃處理，其中模型組給予生理鹽水，最后一次給藥24 h后再給予50% CCl4(按1.5 mL/kg體積給藥).實驗結(jié)果表明，到第八天時，大鼠的體重逐漸降低，與正常組產(chǎn)生一定的差異；麻醉，取血，測得生化指標(ALT、AST、ALP)與正常組相比較出現(xiàn)了明顯的升高趨勢；利用代謝組學可以觀察到CCl4起到肝損傷作用的兩條途徑，一條是初級膽汁酸的生物合成.在一個健康的狀態(tài)中大部分的膽汁酸重吸收回到腸的頂端，通過鈉依賴性膽汁酸轉(zhuǎn)運(ASBT)到細胞和分泌膽汁的基底門靜脈，膽汁酸在到達基底膜后可以通過具有鈉依賴性的牛磺膽酸鈉轉(zhuǎn)運體(NTCP)再次分泌到膽囊[6].然而當肝功能受損時，由于腸肝循環(huán)周期的不充分，膽汁酸過多停留在流通期間，空腹血清膽汁酸水平的含量被認為是早期肝功能不全的檢查指標，同時伴有肝臟炎癥[7]；另一條是花生四烯酸的代謝.環(huán)氧二十碳三烯酸(EET)是花生四烯酸代謝物，它參與多種信號通路調(diào)節(jié)炎癥的發(fā)生和傳播，是疼痛和穩(wěn)態(tài)功能的一個關(guān)鍵的信號分子[8].給予四氯化碳后，肝細胞發(fā)生死亡，導致它的酶未能轉(zhuǎn)換為更為穩(wěn)定和低生物活性的EET羥基酸(DHETs).兩條代謝途徑的改變，從而釋放出大量的炎癥因子引起肝損傷.

2 D-半乳糖胺誘導肝損傷

Jia[9]等人探究氧化白藜蘆醇調(diào)節(jié)脂多糖誘導急性小鼠肝損傷的機制.采用試劑盒測定ALT、AST、CAT、SOD、 T-AOC、 iNOS和MDA等血清指標；運用Western-blot分析方法測定相關(guān)的蛋白表達；采用蘇木精-伊紅染色法對固定的肝臟進行染色，利用組織病理學熒光顯微鏡下觀察肝組織的變化.實驗結(jié)果表明，通過抑制TLR4/NF-kB通路，并且活化Keap1/Nrf2通路和PI3K/Akt的信號通路，氧化白藜蘆醇可減輕LPS/D-氨基半乳糖誘導的肝損傷，進而參與調(diào)節(jié)炎癥因子的釋放，減輕氧化應(yīng)激和減少肝細胞凋亡程度；其中關(guān)于PI3K/Akt信號通路的激活與抗凋亡的作用，是一種新的見解與發(fā)現(xiàn).蛋白水平表達的高低有助于確定藥物起到肝保護作用的相關(guān)通路，對于深入了解氧化白藜蘆醇作為一種有前途的保護肝臟天然產(chǎn)物起到了關(guān)鍵作用，同樣對于藥物的研發(fā)指引了更明確的方向.

D-半乳糖胺的致毒機理是在代謝過程中與體內(nèi)尿苷二磷酸(UDP)大量結(jié)合形成穩(wěn)定的尿苷衍生物，造成體內(nèi) UDP 耗竭，從而導致具有依賴磷酸尿苷的核酸、糖蛋白、糖元等物質(zhì)的合成減少和受阻，最終導致肝損傷甚至死亡[10].因此，研究D-半乳糖胺誘導的急性肝損傷具有重要的臨床意義.

3 乙醇誘導肝損傷

乙醇進入體內(nèi)后主要是通過肝臟來完成代謝，一旦攝入過量的乙醇，細胞色素P4502E1( CYP2E1)會被誘導參與乙醇的代謝，產(chǎn)生活性氧(ROS).ROS能夠與生物大分子反應(yīng)造成蛋白變性、酶失活、DNA 結(jié)構(gòu)改變、脂質(zhì)過氧化，從而造成肝細胞的損傷[11].

Bai[12]等人探究白樺脂醇調(diào)節(jié)乙醇誘導肝損傷的通路.白樺脂醇治療組與模型組相比都能夠降低血清中ALT、AST和TG的表達水平，初步說明了白樺脂醇是一種較為有效的抑制劑；HE分析的結(jié)果表明，模型組小鼠的肝組織與正常組相比發(fā)生嚴重的脂肪變性、炎性浸潤和纖維化，肝損傷比較嚴重；免疫組化染色分析肝纖維化的重要特征α-SMA，模型組小鼠的門靜脈區(qū)域和中央靜脈周圍的α-SMA表達強度遠遠強于正常組小鼠，而幾個治療組通過染色法分析沒有檢測出相應(yīng)的 α-SMA，并且在Western-blot也得到了一致的結(jié)果，collagen-I和α-SMA的蛋白表達水平與模型組相比降低；為了進一步確認白樺脂醇是否能夠有利于酒精在體內(nèi)的代謝，對SREBP-1(固醇調(diào)節(jié)元件結(jié)合蛋白-1)的蛋白表達水平進一步探究.結(jié)果也表現(xiàn)出模型組SREBP-1 蛋白表達水平增加，而給藥治療組則減輕了SREBP-1表達.蛋白水平表達的高低離不開相關(guān)通路的調(diào)節(jié)，利用Western-blot方法分析出，模型組中的LKB-1和AMPK的信號表達水平降低，而在給藥治療組；則恢復(fù)到了正常水平，這也說明了白樺脂醇對于乙醇誘導肝損傷的調(diào)節(jié)通路與LKB-1和AMPK相關(guān).

4 人源性肝嵌合體小鼠

通過預(yù)測人體藥物代謝和藥物動力學(PK)在藥物安全有效篩選中是重要的.常用的方法包括定性篩查評估，代謝穩(wěn)定性，細胞色素(P450)等參數(shù)的抑制和誘導.代謝物評價，包括使用人體生物樣本的體外代謝研究，如肝微粒體和肝細胞，以及使用實驗動物的體內(nèi)研究.然而由于體外和體內(nèi)結(jié)果不穩(wěn)定以及藥物代謝的種間差異，使用這些方法的預(yù)測往往是不準確的.因此，為了得到精確的預(yù)測，研究出了一個更有效的方法是開發(fā)人源化的動物，如具有人源化肝的嵌合體小鼠.人源性嵌合體小鼠是指通過將人肝細胞移植到有免疫缺陷的小鼠體內(nèi)來構(gòu)建基因改造，具有免疫缺陷的小鼠有利于將人類細胞植入小鼠肝臟并且防止移植的人類細胞產(chǎn)生排斥反應(yīng)而損傷內(nèi)源性小鼠細胞[13].小鼠肝細胞的大部分被人肝細胞取代，從而表達人類藥物代謝酶[14].因此，這些人源性嵌合體小鼠的藥物代謝和PK研究可用于改善這種藥物預(yù)測.

有三種常用的人源性嵌合體小鼠[15].第一種為尿激酶型纖溶酶原活化劑(UPA)嚴重聯(lián)合免疫缺陷人肝細胞移植(SCID)小鼠，UPA代表尿激酶型纖溶酶原激活物，是一種絲氨酸蛋白水解酶，主要作用是用于組織重建，SCID代表重癥聯(lián)合免疫缺陷，由于小鼠自身肝細胞代謝具有缺陷，所以移植的肝細胞更容易存活，并且肝細胞置換率(RI)能達到80%.但是由于刪除了原UPA而導致RI逐漸減少.為了解決這個問題，Tateno[16]等人構(gòu)建半合子基因uPA NOD/SCID小鼠，能夠使RI保持在一個較高的狀態(tài).Hasegawa[17]等人構(gòu)建了第二種TK-NOG人源性小鼠，這類小鼠具有單純皰疹病毒1型胸苷激酶的基因，在高度免疫缺陷NOG小鼠肝臟產(chǎn)生高度表達.通過更昔洛韋來消融小鼠肝細胞，隨后將肝細胞移植并保持在TK-NOG小鼠體內(nèi)的肝臟，進而構(gòu)建成人源性嵌合體小鼠.Azuma[18]等人構(gòu)建了第三種 Fah//Rag2/Il2rg/(FRG)小鼠.延胡索酰乙酰乙酸水解酶(FAH)是參與酪氨酸代謝途徑的最后一個酶，F(xiàn)ah基因缺失導致有毒產(chǎn)物的積累，進而損傷小鼠肝細胞，造成免疫缺陷后將人類的干細胞移植到小鼠體內(nèi)，并且維持一個很高的置換率.

為了檢查人類的轉(zhuǎn)運蛋白(mRNA)表達水平及其藥物代謝酶活性，通過對比人類的CYP1A1基因，結(jié)果表明人源化肝UPA/SCID小鼠的CYP1A2、CYP2C9、CYP2C19，CYP2D6和CYP3A4與供體相似；Katoh[19]等人報道了人類肝細胞中主要蛋白質(zhì)和酶的活性，結(jié)果顯示肝臟中的磺基轉(zhuǎn)移酶(SULT)、N-乙?；D(zhuǎn)移酶和谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶在人源化UPA/SCID小鼠體內(nèi)的RI接近90%，表明UPA/SCID小鼠的蛋白表達水平與人類肝臟蛋白表達是相似的.因此，人源性肝嵌合體小鼠可保留人類肝臟中具有藥物代謝功能的相關(guān)酶和轉(zhuǎn)運蛋白[20，21].

5 結(jié)語與展望

近年來，人們對肝損傷認識的不斷深入，有關(guān)肝病的起因，防治等各方面的研究也日漸增多.伴隨著肝保護作用研究的深入，對各種類型所引發(fā)的肝損傷研究有待成為熱點.為了深入地研究肝損傷及其相關(guān)疾病，就需要建立相應(yīng)的動物模型，從而篩選出治療和防止肝病的有效藥物，同時選擇一種理想的實驗動物損傷模型也是十分重要的.理想的損傷模型應(yīng)具備與人類疾病特征相似，病變有一定發(fā)展過程并且造模死亡率低和簡便易行.因此選用CCl4、D-半乳糖胺、乙醇和人源性嵌合體小鼠等其它損傷模型具有一定的優(yōu)勢.其中人源性嵌合體小鼠的使用價值非常高，盡管價格昂貴，但能夠更加準確地預(yù)測出藥物的安全性與有效性，并且能夠較好的表現(xiàn)出藥物在體內(nèi)的代謝分布，這種動物模型同小鼠損傷模型有一定的區(qū)別，主要在于肝細胞分布的酶及其相應(yīng)的蛋白表達，人源性嵌合體小鼠肝細胞能夠最大化的反映出人肝細胞所具有的酶.目前國內(nèi)很少采用人源性嵌合體小鼠的方法構(gòu)建動物損傷模型，有待于不斷探索.隨著研究的深入，動物損傷模型的建立也會更加適應(yīng)于人類自身所具有的相關(guān)條件，以此來推動藥物行業(yè)的發(fā)展，為人類的健康做出更大的進步.