真菌毒素對腸道屏障的影響

潘佳雯，王 楠，佟晶晶，王明陽，陳新亮，龍 淼

(沈陽農(nóng)業(yè)大學(xué)畜牧獸醫(yī)學(xué)院,遼寧沈陽 110866)

真菌毒素是真菌在生長代謝過程中產(chǎn)生的有毒次級代謝產(chǎn)物[1]。在飼料或原料中的真菌毒素會嚴(yán)重影響畜禽養(yǎng)殖業(yè)及飼料工業(yè)的發(fā)展，目前已知的真菌毒素有 300多種，其中對人和動物危害相對嚴(yán)重的有脫氧雪腐鐮刀菌烯醇(DON)、玉米赤霉烯酮(ZEN)、黃曲霉毒素B1(AFB1)等毒素[2]。真菌毒素有遺傳毒性、皮膚毒性、腎臟和肝臟毒性，可致畸致癌，對人類和動物的健康存在嚴(yán)重的威脅[3]。真菌毒素還可引起人和動物的腸道疾病，包括腸上皮壞死[4]、擾亂腸屏障功能、損傷免疫應(yīng)答，并通過損害生長激素信號間接影響飼料消耗[5]。研究證明，真菌毒素可介導(dǎo)破壞腸屏障的完整性，引起上皮屏障損傷，這可能是由于真菌毒素作用于細(xì)胞，引起細(xì)胞滲透性改變和易位增加所引起[4，6-8]。正常情況下由腸道上皮細(xì)胞、黏膜及腸道菌群組成的腸道屏障系統(tǒng)，可有效防止機(jī)體受內(nèi)源性微生物及其毒素的侵害[9]。但大劑量或長期接觸真菌毒素會對腸道屏障造成損傷。

1 腸道屏障

腸屏障是指腸道能夠防止腸內(nèi)有害物質(zhì)穿過腸黏膜進(jìn)入其他組織、器官和血液循環(huán)結(jié)構(gòu)和功能的總和。腸上皮細(xì)胞、腸黏液和腸道菌群對維持腸道屏障完整性起到重要作用。

1.1 腸上皮細(xì)胞

腸上皮細(xì)胞間的連接有緊密連接(tightjunction，TJ)、橋粒(desmosome)、黏附連接(adhesion junction，AJ)、縫隙連接(gapjunction，GJ)等。其中，TJ在腸屏障中發(fā)揮著重要作用。

1.2 腸黏液

腸黏液是維持腸道內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定、發(fā)揮腸道功能的關(guān)鍵因素，腸黏液可潤滑上皮細(xì)胞、維持上皮表面內(nèi)環(huán)境、通過作用腸道免疫系統(tǒng)保護(hù)上皮、提供腸道微生物菌群生態(tài)位點(diǎn)等起到重要作用[10-12]。在人和動物胃腸道內(nèi)，黏液填滿絨毛并覆蓋它們，但不附著于上皮，還可阻止細(xì)菌或大于0.5 μm的顆粒穿透黏液層,對維護(hù)腸道完整性起到重要保護(hù)作用[13]。

1.3 腸道菌群

腸道菌群可分為共生菌、致病菌和條件致病菌。正常條件下，由于大量共生菌存在，條件致病菌并不容易大量繁殖而對腸道造成損傷[14]。腸道菌群和腸道的內(nèi)分泌與旁分泌、能量代謝與貯存等方面都息息相關(guān)，腸道菌群通過其中間產(chǎn)物、代謝能力和基因等影響著機(jī)體免疫、代謝等多方面活動。

2 真菌毒素對腸道屏障的影響

2.1 脫氧雪腐鐮刀菌烯醇對腸道屏障的影響

在鐮刀菌屬產(chǎn)生的真菌毒素中，單端胞霉烯毒素普遍存在，特別是脫氧雪腐鐮刀菌烯醇(DON)廣泛存在于谷物(小麥、玉米、燕麥等)產(chǎn)品中。DON攝入后通常導(dǎo)致動物的各種臨床癥狀，如腹瀉、嘔吐、采食量減少、體重增加量減少[15-16]。這些癥狀產(chǎn)生的主要原因是由于DON能對腸道造成嚴(yán)重影響，其作用機(jī)理主要是 DON可與腸上皮細(xì)胞的60S核糖體亞基結(jié)合，引起核糖毒性，導(dǎo)致促分裂原活化蛋白激酶(MAP)激酶活化、細(xì)胞生長周期停滯和凋亡[5]。

2.1.1 DON對腸上皮細(xì)胞的影響 研究表明，腸上皮細(xì)胞是DON的靶標(biāo)，DON通過改變細(xì)胞形態(tài)和分化以及細(xì)胞毒性作用包括調(diào)節(jié)黏膜免疫反應(yīng)、導(dǎo)致免疫抑制或刺激局部免疫細(xì)胞和釋放細(xì)胞因子來影響腸上皮完整性[4,7]。DON毒性主要是通過激活絲裂原活化蛋白激酶(MAPKs)信號通路和改變動物腸組織生理和免疫功能關(guān)鍵基因的表達(dá)，MAPKs信號通路激活導(dǎo)致腸屏障功能被破壞，并通過減少緊密連接蛋白的表達(dá)而增加通透性，特別是緊密連接蛋白[17,7]。此外，通過激活MAP激酶途徑，DON可誘導(dǎo)腸上皮細(xì)胞產(chǎn)生細(xì)胞因子或趨化因子，如IL-1α、IL-1β、IL-8、IL-17A和IL-22等，引起促炎反應(yīng)[18-19]。

2.1.2 DON對腸黏液的影響 使用人黏液分泌的體外細(xì)胞系(HT29-16E)以及豬空腸活體試驗(yàn)，來確定DON對腸黏液的影響，發(fā)現(xiàn)低劑量DON通過特異性降低膜結(jié)合黏蛋白MUC1和分泌黏蛋白MUC2、MUC3的mRNA水平，而減少腸黏蛋白的產(chǎn)生[20]。然而，用DON染毒的飼料飼喂1周～6周后，處理組和對照組動物十二指腸的上皮細(xì)胞中，覆蓋絨毛和形成隱窩的杯狀細(xì)胞數(shù)量表現(xiàn)出相似性[21]。用DON污染的飼料飼喂肉雞2周，在真菌毒素攻毒組，黏蛋白MUC2 mRNA表達(dá)水平在十二指腸中減少，在空腸和回腸中無明顯變化。盡管沒有提供試驗(yàn)證明，但黏蛋白O-連接寡糖組合物的這種變化，可能影響?zhàn)ひ簩拥耐暾圆⒄{(diào)節(jié)腸道微生物群的組成[22-23]。

2.1.3 DON對腸道微生物菌群的影響 根據(jù)試驗(yàn)定量測定結(jié)果顯示，大腸中盲腸菌群代謝DON的能力最強(qiáng)[24]；而且DON能被一種毒性較低的雞腸道微生物代謝產(chǎn)物，代謝為脫環(huán)氧-脫氧雪腐鐮刀菌烯醇(deepoxy-deoxynialenol，DOM)[25]。DON能顯著影響小鼠腸道微生物菌群多樣性及物種豐度[26]。有研究表明，包括大鼠、豬、牛和雞在內(nèi)的各種動物腸道微生物菌群均可代謝DON[5]。但最近根據(jù)16S rRNA微生物群分析表明，嚙齒動物中攝入DON污染的飲食并沒有顯著改變腸道微生物菌群的組成和多樣性[27]。根據(jù)現(xiàn)有的研究結(jié)果，DON可能會也可能不會對微生物菌群造成全局影響。

2.2 玉米赤霉烯酮(ZEN)對腸道屏障的影響

玉米赤霉烯酮(ZEN)是由鐮刀菌等真菌產(chǎn)生的次級代謝產(chǎn)物，具有類雌激素作用、致畸、致癌作用、生殖毒性，不僅能影響飼料食品安全，而且還可以通過食物鏈在人和動物體內(nèi)蓄積，進(jìn)而危害人和動物的健康[28]。ZEN具有對腸道的細(xì)胞毒性，因此它可降低淀粉酶和脂肪酶的活性，有研究表示這可能與細(xì)胞凋亡、氧化損傷和基因、蛋白質(zhì)抑制有關(guān)[29]。

2.2.1 ZEN對腸上皮細(xì)胞的影響 ZEN降低腸上皮細(xì)胞存活率，而不改變體外跨膜電阻(TEER)[30]。這種真菌毒素也上調(diào)了一些涉及細(xì)胞分化基因(TFF2，BMP4)的表達(dá)，并下調(diào)了腫瘤抑制基因DKK1，PCDH11X或TC5313860的表達(dá)[31]。用ZEN染毒的飼料飼喂豬群1周～6周后，豬腸黏膜厚度、絨毛高度和絨毛與隱窩長度的比例在處理組和對照組中表現(xiàn)出相似，說明ZEN對上皮細(xì)胞的影響并不顯著[21]。

2.2.2 ZEN對腸黏液的影響 目前僅有少數(shù)學(xué)者調(diào)查研究ZEN對腸黏液的作用。Wan L Y M等用HT29-MTX細(xì)胞與Caco-2細(xì)胞共同培養(yǎng)，在體外評估ZEN對黏液的影響，結(jié)果顯示MUC5AC和MUC5B的mRNA表達(dá)和蛋白分泌上調(diào)，但黏液樣糖蛋白的總分泌量卻減少，這表明黏液在真菌毒素的作用下逐漸減少。研究推論表明腸道黏液層的破壞很可能對宿主造成有害影響，因?yàn)槠錇椴≡w黏附和易位提供了更多機(jī)會。有研究者用ZEN染毒的飼料飼喂豬1周～6周，結(jié)果顯示豬群十二指腸的杯狀細(xì)胞百分比保持不變，這說明ZEN對豬十二指腸的黏液層沒有顯著影響[21]。

2.2.3 ZEN對腸道微生物群的影響 用含有ZEN的飼料飼喂豬群，發(fā)現(xiàn)升結(jié)腸中存在可培養(yǎng)菌群，并使用BIOLOG(單一碳源利用法)方法估算微生物多樣性和豐富性的區(qū)系結(jié)構(gòu)，數(shù)據(jù)顯示ZEN降低了可培養(yǎng)好氧菌的總量；同時(shí)試驗(yàn)結(jié)果表明，在NOAEL濃度(無可見有害作用濃度)下，豬群被ZEN染毒后會影響升結(jié)腸內(nèi)生物繁殖濃度、生物多樣性和代謝活性[33]。后續(xù)有研究者表示，ZEN在一定程度上會影響動物腸道微生物區(qū)系結(jié)構(gòu)，且真菌毒素毒性越強(qiáng)，對腸道微生物區(qū)系結(jié)構(gòu)的影響越大[34]。

2.3 黃曲霉毒素B1(AFB1)對腸道屏障的影響

黃曲霉毒素B1(aflatoxin B1，AFB1)是一組由黃曲霉、寄生曲霉等多種真菌產(chǎn)生的次級代謝產(chǎn)物，具有強(qiáng)烈毒性，可以引起動物肝臟腫大、病變甚至癌變，對人和家畜的健康產(chǎn)生極大的威脅[35]。有研究表明，AFB1會損傷動物腸道結(jié)構(gòu)，使腸道物理屏障遭到破壞，還能降低十二指腸黏膜厚度和腸絨毛高度、使腸絨毛變得短而細(xì)、破壞腸道正常微生物區(qū)系，從而影響腸道微生物的屏障功能[36]。

2.3.1 AFB1對腸上皮細(xì)胞的影響 用Caco-2細(xì)胞代替分化的小腸上皮細(xì)胞，測定黃曲霉毒素B1(AFB1)對其細(xì)胞毒性作用。細(xì)胞毒性作用測定包括細(xì)胞活力、乳酸脫氫酶(LDH)釋放、活性氧(ROS)產(chǎn)生和DNA損傷。結(jié)果顯示，AFB1降低了跨膜電阻(TEER)、抑制細(xì)胞活力和生長、增加乳酸脫氫酶(LDH)釋放和DNA損傷[37]。所有這些細(xì)胞毒性結(jié)果可能與細(xì)胞內(nèi)活性氧簇(ROS)產(chǎn)生有關(guān)，導(dǎo)致膜損傷和DNA鏈斷裂。在嚙齒動物中，AFB1在十二指腸和回腸中引起腸道損傷，其特征在于白細(xì)胞和淋巴細(xì)胞浸潤，這說明AFB1對細(xì)胞因子表達(dá)的調(diào)節(jié)有一定影響[38]。目前沒有關(guān)于腸黏液的明顯數(shù)據(jù)。

2.3.2 AFB1對腸道微生物群的影響 在大鼠體內(nèi)慢性AFB1攻毒的一項(xiàng)研究中，用16S rRNA測序，觀察到結(jié)腸中微生物多樣性減少，并注意到治療后對乳酸菌群產(chǎn)生不良影響，而AFB1和菌類的比例保持不變[39]。Galarza-Seeber R等[40]研究了暴露于AFB1肉雞盲腸中總需氧量、兼性厭氧菌(大腸埃希菌)和乳酸菌群的變化。在試驗(yàn)中AFB1最大劑量(2 mg/kg)時(shí)，大腸菌群高出10倍，而對于正在研究的其他微生物群體，僅觀察到數(shù)值不顯著的上升，這表明接觸霉菌毒素后腸道上皮屏障的完整性不受影響。

3 小結(jié)

隨著真菌毒素在人類食品和畜禽飼料中的危害頻繁發(fā)生，受到了人們越來越多的關(guān)注。腸黏膜是宿主的第一個物理、化學(xué)和生物防御系統(tǒng)，因此在真菌毒素暴露脅迫下保持腸內(nèi)穩(wěn)態(tài)起著關(guān)鍵作用。根據(jù)本文上述內(nèi)容可總結(jié)出，脫氧雪腐鐮刀菌烯醇(DON)、玉米赤霉烯酮(ZEN)、黃曲霉毒素B1(AFB1)分別通過各種機(jī)制，顯著影響著上皮細(xì)胞的功能，包括增加細(xì)胞死亡和細(xì)胞毒性、提高單層細(xì)胞通透性、減少跨膜電阻(TEER)、TJ蛋白表達(dá)受損、細(xì)胞內(nèi)定位和功能、有害應(yīng)激物，特別是細(xì)菌(共生和病原體)從腸管內(nèi)轉(zhuǎn)移到內(nèi)環(huán)境。由于這些上皮細(xì)胞靶向的改變，所以有必要揭示真菌毒素暴露，在引發(fā)炎癥反應(yīng)和臨床表現(xiàn)如腸道疾病中的意義。

上皮細(xì)胞是腸屏障主要的功能組成，越來越多的證據(jù)表明腸屏障還涉及其他成分如黏液和微生物群，這些是真菌毒素的新興靶點(diǎn)。關(guān)于黏液，DON無疑是最常見研究對象。在體內(nèi)試驗(yàn)中，DON對黏液的毒理學(xué)影響通常僅通過杯狀細(xì)胞數(shù)量測定來評估。除了這種“杯狀細(xì)胞數(shù)”標(biāo)準(zhǔn)之外，還可通過黏蛋白表達(dá)、黏蛋白或黏液組成、黏蛋白O-糖基化等其他各種指標(biāo)來評估真菌毒素與黏液相互作用。關(guān)于微生物菌群，迄今為止已經(jīng)報(bào)道的所有真菌毒素研究，證明了它的有害作用。然而，在慢性暴露作用時(shí)，腸內(nèi)真菌毒素持續(xù)存在可能被認(rèn)為是影響微生物菌群組成顯著變化、特定菌群豐度和代謝活性的重要原因。此外，使用轉(zhuǎn)錄組學(xué)/代謝組學(xué)方法評估微生物功能的變化，如信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、代謝、COM-復(fù)合糖和蛋白質(zhì)的轉(zhuǎn)運(yùn)等，可能是評估真菌毒素對健康影響的最佳選擇。腸黏膜層、腸黏液、腸道微生物菌群不僅是作為個體，而且在小腸和結(jié)腸內(nèi)是作為緊密連接的整體來確保宿主的體內(nèi)平衡。真菌毒素與腸屏障相互作用的另一個新難點(diǎn)是考慮上皮細(xì)胞、黏液和微生物菌群之間的相互影響，這可能是未來的研究熱點(diǎn)。