基因編輯技術(shù)在頂復(fù)門寄生蟲研究中的應(yīng)用

丁瑩瑩，李 嬌，鮑 麗，段 萍，姜 寧，馮 穎，桑曉宇，王 瑤，郭曉改，邢蒙恩，李佳祺，李承桓，武安和，楊 娜*

(1.沈陽農(nóng)業(yè)大學(xué)，遼寧沈陽 110866；2.遼寧省血液中心，遼寧沈陽 110000)

頂復(fù)門寄生蟲是一類專性胞內(nèi)寄生蟲。一些重要的頂復(fù)門寄生蟲疾病傳播速度非常快，例如由蜱蟲和蚊子為媒介引起的泰勒蟲和瘧原蟲疾病[1]。如果對這些疾病不加以控制，將會(huì)嚴(yán)重危害人類的健康。近年來，通過基因編輯這一方法，將有助于鑒定寄生蟲編碼的途徑以及某些基因在生命階段中的調(diào)節(jié)作用，從而合理設(shè)計(jì)新型控制方法。

1 頂復(fù)門寄生蟲基因組的保守序列

頂復(fù)門寄生蟲中基因組的保守序列，可以成為基因操作技術(shù)的靶向目標(biāo)。由頂端復(fù)合體分泌并負(fù)責(zé)介導(dǎo)宿主細(xì)胞內(nèi)的附著，入侵和增殖的蛋白質(zhì)，均為保守序列。例如，在有性生殖、裂殖體侵入階段，其棒狀體和微線體分泌的MIC-1，AMA-1和TRAP1致密顆粒[2]；在瘧原蟲、弓形蟲、艾美耳球蟲和新孢子蟲中保守微粒蛋白質(zhì)SPATR有助于細(xì)胞入侵[3]；在巴貝斯蟲、泰勒蟲編碼有性生殖階段的幾個(gè)功能蛋白質(zhì)基因也是保守序列，包括HAP2、CCp和6-cys蛋白[4]；此外，具有調(diào)控機(jī)制的關(guān)鍵基因也為保守序列，例如由編碼轉(zhuǎn)錄因子的Ap2、HMG和Myb基因家族編碼序列[5]。通過分析頂復(fù)門寄生蟲基因組保守序列的功能研究和基因操作技術(shù)可確定參與入侵階段的關(guān)鍵分子[6]。

2 基因編輯技術(shù)

基因編輯技術(shù)是指通過某種特定的途徑使機(jī)體內(nèi)的基因失活或缺失的技術(shù)。1980年，胚胎干細(xì)胞的分離和體外培養(yǎng)的成功為基因編輯技術(shù)奠定了技術(shù)基礎(chǔ)。1985年，首次證明了哺乳動(dòng)物細(xì)胞中同源重組的存在為基因編輯技術(shù)奠定了理論基礎(chǔ)。1987年，Thompsson建立了完整的胚胎干細(xì)胞基因敲除的小鼠模型。2007年度諾貝爾生理學(xué)或醫(yī)學(xué)獎(jiǎng)授予了美國科學(xué)家Smithie O[7]和Capecchi M R[8]，表彰他們在有關(guān)應(yīng)用胚胎干細(xì)胞進(jìn)行小鼠特定基因修飾方面的一系列突破性發(fā)現(xiàn)。最傳統(tǒng)的遺傳操作方法包括基于使用同源重組機(jī)制外源DNA導(dǎo)入真核細(xì)胞的經(jīng)典轉(zhuǎn)染，但近年興起的CRISPR/CAS9技術(shù)與之前的技術(shù)相比，其成本低、操作簡單、快捷高效，最重要的是它能夠在活細(xì)胞中快速有效地編輯任何基因[9]。

3 基因編輯技術(shù)在頂復(fù)門寄生蟲中的應(yīng)用

3.1 經(jīng)典轉(zhuǎn)染技術(shù)及其應(yīng)用

轉(zhuǎn)染技術(shù)可用于蛋白表達(dá)、基因調(diào)控的研究以及疫苗的開發(fā)。根據(jù)外源基因在細(xì)胞內(nèi)表達(dá)時(shí)間的長短可將胞內(nèi)轉(zhuǎn)染技術(shù)分為瞬時(shí)轉(zhuǎn)染和永久轉(zhuǎn)染兩大類。瞬時(shí)轉(zhuǎn)染時(shí)，外源 DNA/RNA不整合到宿主染色體中，表達(dá)水平高，但持續(xù)時(shí)間很短[10]，轉(zhuǎn)染到胞內(nèi)的遺傳物質(zhì)可能隨著細(xì)胞分化或外界環(huán)境的改變而丟失。相反，穩(wěn)定轉(zhuǎn)染時(shí)，外源DNA/RNA可整合到宿主細(xì)胞染色體上，并且宿主細(xì)胞可以長期表達(dá)目的基因及蛋白[11]。因此，可根據(jù)試驗(yàn)?zāi)康膩磉x擇瞬時(shí)轉(zhuǎn)染或永久轉(zhuǎn)染。細(xì)胞轉(zhuǎn)染的主要目的是通過增強(qiáng)或抑制細(xì)胞內(nèi)特定基因的表達(dá)來研究基因產(chǎn)物或重組蛋白的功能[12]。瞬時(shí)轉(zhuǎn)染應(yīng)用與頂復(fù)門原蟲，觀察其細(xì)胞中分子的表達(dá)程度，可篩選到階段特異性表達(dá)的強(qiáng)啟動(dòng)子，從而可以推測出頂復(fù)門原蟲在各個(gè)發(fā)育階段發(fā)揮主要的功能基因和管家基因。例如，剛地弓形蟲Tubulin1微管蛋白啟動(dòng)子能調(diào)控標(biāo)記分子持續(xù)性表達(dá)，說明Tubilln1在弓形蟲完整的發(fā)育過程中發(fā)揮功能。此外，通過瞬時(shí)轉(zhuǎn)染技術(shù)，可以測定許多種間特異性或種間保守的啟動(dòng)子和3′端轉(zhuǎn)錄終止調(diào)控序列，為進(jìn)一步穩(wěn)定轉(zhuǎn)染和功能基因組學(xué)研究提供更多可選擇的優(yōu)秀轉(zhuǎn)錄表達(dá)調(diào)控序列。

3.2 CRISPR/Cas9基因敲除技術(shù)及其應(yīng)用

CRISPR系統(tǒng)是由細(xì)菌和古細(xì)菌通過不斷進(jìn)化的一種免疫系統(tǒng)改造而成[13]，根據(jù)Cas蛋白的同源性，可將該系統(tǒng)可分為Ⅰ型、Ⅱ型和Ⅲ型。Gasiunas G等[14]首次確定了TypeⅡ型Cas9核酸酶家族可以定向剪切外源DNA。CRISPR/Cas系統(tǒng)作用機(jī)制為：當(dāng)外源DNA入侵噬菌體時(shí)，Cas基因編碼的蛋白復(fù)合物首先識(shí)別噬菌體核酸序列的短間隔序列，然后將該序列整合到自身DNA的CRISPR基因座5′重復(fù)序列中，再將新的CRISPR基因座轉(zhuǎn)錄成前體crRNA(CRISPR RNA)，然后crRNA、tracrRNA (trans-activating crRNA)和Cas9內(nèi)切酶形成一個(gè)復(fù)合物[15]，Cas9內(nèi)切酶在crRNA的引導(dǎo)下識(shí)別保守的間相鄰基序，繼而對結(jié)合位點(diǎn)進(jìn)行切割。此外，CRISPR/Cas9系統(tǒng)需要Cas9核酸酶和向?qū)NA(guide RNA,gRNA)的共同作用才能發(fā)揮基因編輯功能[16]。近年來，CRISPR/Cas系統(tǒng)可應(yīng)用與多種頂復(fù)門寄生蟲中[17]，提高了其編輯效率。過去幾十年中，研究人員已經(jīng)采用了多種基因編輯方法修飾瘧原蟲基因，但耗時(shí)久，且靶向不準(zhǔn)確。例如，瘧原蟲在人體內(nèi)寄生，引起的瘧疾可導(dǎo)致每年約60多萬人死亡[18]，對人類的健康造成極大的威脅，Sollelis等[19]利用該系統(tǒng)編輯了惡性瘧原蟲基因，利用線性質(zhì)粒破壞了egfp外源性位點(diǎn)。Zhang C等[20]利用CRISPR/Cas9系統(tǒng)編輯了約氏瘧原蟲基因，實(shí)現(xiàn)了高效的基因刪除和敲入等位基因置換的試驗(yàn)。弓形蟲的亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)能分泌與入侵相關(guān)的保守蛋白，尤其是在入侵宿主細(xì)胞階段分泌的ROPs被認(rèn)為是保護(hù)寄生蟲入侵和繁殖的重要分子。Shen B等[21]利用CRISPR/Cas9系統(tǒng)成功構(gòu)建rop18基因缺陷的弓形蟲GT1株，通過毒力試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)該蟲株毒力下降，證明ROP18在弓形蟲GT1株毒力表達(dá)有差異。Shen B等[22-23]利用此系統(tǒng)研究棒狀體球蛋白，發(fā)現(xiàn)ROM4可使微線體蛋白脫落，對蟲體侵入宿主細(xì)胞有重要意義；隱孢子蟲可導(dǎo)致患者發(fā)生嚴(yán)重的腹瀉，Vinayak R J等[24]通過CRISPR/Cas9技術(shù)將隱孢子蟲的靶啟動(dòng)子的特定片段插入到熒光素酶表達(dá)序列前方，使隱孢子蟲對氨基糖苷類藥物產(chǎn)生耐藥性，并能感染小鼠或體外培養(yǎng)的細(xì)胞，為治療隱孢子蟲病的藥物篩選和疫苗的研發(fā)提供了重要的分子基礎(chǔ)。杜氏利什曼原能夠引起嚴(yán)重的人和動(dòng)物疾病，目前，米替福星是治療杜氏利什曼病的唯一藥物。Zhang W W等[25]利用CRISPR/Cas9系統(tǒng)，檢測到杜氏利什曼原蟲的ldmt基因與米替福星抗性有關(guān)，為杜氏利什曼原蟲藥物抗性的研究提供了新的分子基礎(chǔ)。Peng等報(bào)道了應(yīng)用CRISPR/Cas9系統(tǒng)實(shí)現(xiàn)了內(nèi)源性基因敲除方法， 重新編輯了克氏錐蟲的基因，對3條向?qū)NA依次進(jìn)行瞬時(shí)轉(zhuǎn)染，從而破壞了含有60多個(gè)基因成員的基因家族，證明該基因家族與克氏錐蟲表面的黏蛋白、黏液素相關(guān)蛋白的表達(dá)有關(guān)[26]。綜上所述，CRISPR/Cas9已經(jīng)通過外源基因插入，基因標(biāo)記，增加了靶向位點(diǎn)等。這些都證明了該系統(tǒng)可以提高寄生蟲的編輯效率。

4 展望

基因編輯技術(shù)可有效地鑒定寄生蟲中的靶向分子，經(jīng)典轉(zhuǎn)染的使用讓研究人員對基因與功能關(guān)系的研究打開新的局面，而CRISPR/Cas9技術(shù)的引入，對研究頂復(fù)門寄生蟲基因發(fā)揮了重要的作用，大大提高了基因編輯效率，并加快了特異性疫苗的研究進(jìn)展。雖然CRISPR/Ca9系統(tǒng)依然存在一些弊端，但隨著研究人員對該系統(tǒng)的優(yōu)化和升級(jí)，CRISPR/Ca9技術(shù)將會(huì)更好的幫助科學(xué)家們在基因水平上認(rèn)識(shí)寄生蟲，從而有效防治寄生蟲病，保障人類和動(dòng)物健康。