PAR-2在哺乳動物腸道炎癥中的作用機制研究進展

王鳳青，張 波，張凡慶，王 曼，王婷婷，張 蕾，管 玉，朱建國

(上海交通大學(xué)農(nóng)業(yè)與生物學(xué)院/上海市獸醫(yī)生物技術(shù)重點實驗室，上海 200240)

炎性腸道疾病(inflammatory bowel diseases，IBDs)是影響腸道的主要慢性炎癥性疾病，如克羅恩病和潰瘍性結(jié)腸炎[1]。IBD的發(fā)病機制尚不清楚，可能是由遺傳、環(huán)境和免疫等因素共同影響下導(dǎo)致的疾病。目前，已有報道指出一些蛋白酶在腸炎發(fā)病過程中發(fā)揮重要的介導(dǎo)作用，如凝血酶、胰蛋白酶、類胰蛋白酶等[2]。這些蛋白酶通過激活蛋白酶激活受體(protease-activated receptors，PARs)，從而啟動一系列炎癥通路發(fā)揮作用。

蛋白酶激活受體(PARs)是7次跨膜的G蛋白偶聯(lián)受體中的1個家族，包括4個成員。作為絲氨酸蛋白酶的受體，其激活是由絲氨酸蛋白酶水解N末端序列，暴露出新的系鎖配體與第2個細胞外環(huán)相互作用引起的，被激活后的PARs可引起細胞內(nèi)一系列的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)；目前，已發(fā)現(xiàn)4個PARs的N末端的蛋白酶水解位點各不相同，凝血酶可激活PAR-1、PAR-3、PAR-4，胰蛋白酶和類胰蛋白酶是PAR-2的內(nèi)源性激動劑[3]。在PARs 4個成員中，關(guān)于PAR-2的功能研究比較廣泛，它參與了腸道離子轉(zhuǎn)運、炎癥反應(yīng)、細胞遷移、細胞分泌活動及過敏性疾病等[3-7]。目前研究認為在腸道炎癥中PAR-2可發(fā)揮促炎和抗炎雙重作用，但它參與的具體機制尚不清楚。

1 蛋白酶激活受體2在腸道中的表達及活化

1994年Nystedt S等首次克隆出小鼠PAR-2的基因序列，并在小鼠的腎、胃、眼睛和小腸檢測到其表達，隨后證明PAR-2能被胰蛋白酶和由6個氨基酸組成的小肽(SLIGRL)激活，而凝血酶不能將其激活[8-9]。人PAR-2的基因序列在1995年首次被克隆出，它在人的多個組織中均有表達，在腎、肝、胰腺、小腸和結(jié)腸中高表達，在心臟、肺、前列腺和氣管中適度表達，但在大腦和骨骼肌中沒有檢測到表達[10]。

檢測正常人和患腸易激綜合征(irritable bowel syndrome，IBS)病人的結(jié)腸活檢樣本中PAR-2在mRNA和蛋白水平的表達量，發(fā)現(xiàn)雖然兩組病人結(jié)腸組織中PAR-2在mRNA水平?jīng)]有顯著差別，但是患病病人結(jié)腸組織中的類胰蛋白酶和胰蛋白酶的表達高于對照組；免疫組化結(jié)果顯示PAR-2在上皮細胞表面、隱窩、固有層淋巴細胞、內(nèi)皮細胞和平滑肌細胞都有表達，但在兩組組織樣本之間的表達沒有顯著差異[11-12]。這些研究結(jié)果顯示，雖然PAR-2的表達量沒有顯著改變，但類胰蛋白酶和胰蛋白酶的表達升高，引起PAR-2的活化，參與了IBS患者的發(fā)病。在產(chǎn)腸毒素大腸埃希菌引起的斷奶仔豬腹瀉的胃腸道組織中，PAR-2在mRNA水平大量表達，隨著腹瀉嚴重程度的增加，雖然胃組織中PAR-2的表達變化不顯著，但是回腸和結(jié)腸中PAR-2的表達量隨著腹瀉的加重而顯著升高；在蛋白水平檢測到PAR-2在胃、十二指腸、空腸、回腸、盲腸和結(jié)腸的黏膜組織中廣泛表達，與正常仔豬相比，腹瀉組的腸黏膜和固有層中PAR-2表達更強[13]，該結(jié)果為進一步研究PAR-2在仔豬腹瀉發(fā)生過程中的作用提供了一定的依據(jù)。

2 蛋白酶激活受體2在腸炎發(fā)生過程中的作用

2.1 蛋白酶激活受體2對腸炎發(fā)生過程中微觀及宏觀損傷程度的影響

以PAR-2激動劑(SLIGRL-NH2)活化PAR-2的小鼠模型是研究PAR-2的活化在腸炎發(fā)生過程中發(fā)揮作用的有效方法，經(jīng)過SLIGRL-NH2處理的小鼠腸道可觀察到明顯的損傷、腸壁增厚、髓過氧化物酶(myeloperoxidase,MPO)活性增加；組織學(xué)觀察顯示SLIGRL-NH2處理組小鼠的腸道黏膜下水腫、上皮糜爛，但經(jīng)過SLIGRL-NH2處理的PAR-2敲除小鼠組腸道變化不明顯；此外PAR-2的激活也增加了結(jié)腸的細胞通透性，促進上皮細胞損傷[14]。

為了研究內(nèi)源性PAR-2敲除對結(jié)腸炎發(fā)生過程的影響，分別對PAR-2敲除小鼠和野生型小鼠制作葡聚糖硫酸鈉(dextran sodium sulfate,DSS)、三硝基苯磺酸(trinitrobenzene sulfonic acid,TNBS)、惡唑酮(oxazolone,OXZ)誘導(dǎo)的3種不同的結(jié)腸炎小鼠模型，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與未誘導(dǎo)組小鼠相比，PAR-2敲除小鼠和野生型小鼠的結(jié)腸紅斑、水腫、黏連明顯嚴重，但PAR-2敲除小鼠的損傷程度顯著輕于野生型小鼠；野生型小鼠腸道內(nèi)細胞浸潤、上皮細胞損傷程度也比PAR-2敲除小鼠嚴重[2]。

2.2 蛋白酶激活受體2對腸炎發(fā)生過程中腸道分泌和腸黏膜通透性的影響

艱難梭菌能引起腹瀉和結(jié)腸炎，在感染過程中產(chǎn)生的毒素A可介導(dǎo)腸炎應(yīng)答，在毒素A誘導(dǎo)的小鼠腸炎模型中，PAR-2敲除小鼠與未敲除小鼠相比，腸道對毒素A的炎癥反應(yīng)減弱，表現(xiàn)為腸道分泌減少，組織和腸腔液體的MPO活性下降，腸道完整性改善；用抑制劑將激活PAR-2的蛋白酶抑制以后也能減輕毒素A誘導(dǎo)的回腸炎[15]。肥大細胞分泌類胰蛋白酶激活腸上皮細胞基底側(cè)的PAR-2以后，可引起連接蛋白的重排、細胞旁通透性增加，破壞細胞屏障，改變腸黏膜通透性，使腸道屏障功能喪失[16-18]。由此可見，在腸道炎癥發(fā)生過程中激活PAR-2的蛋白酶和PAR-2通過促進腸道分泌、破壞腸黏膜通透性導(dǎo)致腸道屏障功能受損，對炎癥有一定的促進作用。

2.3 蛋白酶激活受體2對腸炎發(fā)生過程中腸道運動的影響

PAR2不僅參與了腸道屏障功能的調(diào)節(jié)，還與腸道平滑肌的運動有關(guān)。在DSS誘導(dǎo)的結(jié)腸炎模型中，促炎性細胞因子白細胞介素1β(interleukin-1β,IL-1β)、腫瘤壞死因子α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)及誘導(dǎo)型一氧化氮合酶(inducible nitric oxide synthase,iNOS)的表達上調(diào)，一氧化氮(nitric oxide,NO)增加；IL-1β、TNF-α刺激大鼠結(jié)腸后，蛋白酶誘導(dǎo)的結(jié)腸平滑肌松弛作用受到抑制，PAR-2表達下調(diào)，iNOS表達上調(diào)；相反，抑制一氧化氮合酶(nitric oxide synthase,NOS)使PAR-2表達上調(diào)，基本能消除IL-1β、TNF-α對PAR-2的抑制作用，抑制NOS后對平滑肌松弛的抑制效果減弱，平滑肌的松弛可部分恢復(fù)[19]。所以，在腸炎發(fā)生過程中，促炎性細胞因子上調(diào)iNOS的表達，產(chǎn)生并釋放NO，下調(diào)PAR-2，從而抑制平滑肌松弛。PAR-2被SLIGRL-NH2激活以后，胃腸動力顯著提高，促進胃腸道排空[20]。

2.4 蛋白酶激活受體2對腸炎發(fā)生過程中細胞因子及黏附分子等的影響

有研究報道,PAR-2被SLIGRL-NH2激活以后顯著減輕TNBS誘導(dǎo)的小鼠結(jié)腸炎，表現(xiàn)為存活率增加，宏觀炎癥表現(xiàn)得到改善，通過下調(diào)輔助性T細胞1型細胞因子的表達，降低MPO活性，從而發(fā)揮抗炎作用[21]。在DSS誘導(dǎo)的小鼠結(jié)腸炎模型中，分析機體停用DSS的結(jié)腸修復(fù)反應(yīng)時發(fā)現(xiàn)PAR2敲除組Yes相關(guān)蛋白(yes-associated protein,YAP)表達及入核減少，炎癥恢復(fù)變慢，減緩了小鼠的組織修復(fù)[22]。

然而，在SLIGRL-NH2誘導(dǎo)的小鼠腸炎模型中，PAR-2被激活以后，引起TNF-α、IL-1β和γ干擾素(interferon-γ,INF-γ)顯著上調(diào)表達，白細胞介素4(interleukin-4,IL-4)和白細胞介素10(interleukin-10,IL-10)的表達沒有顯著變化，此外還引起小鼠結(jié)腸中輔助性T細胞1型細胞因子的表達上調(diào)，肥大細胞脫顆粒比率上升[16]。PAR-2的敲除顯著減弱由DSS、TNBS、OXZ誘導(dǎo)的3種不同結(jié)腸炎小鼠模型中的炎癥[2]；PAR-2被抑制后，肥大細胞脫顆粒減少[23]；此外，PAR-2上調(diào)促炎性細胞因子IL-6的表達，與白細胞介素8(interleukin-8,IL-8)、環(huán)氧合酶2(cyclooxygenase-2,COX-2)的表達也密切相關(guān)[24-26]。GB88(一種PAR-2拮抗劑)的使用有效減輕SLIGRL-NH2和TNBS分別誘導(dǎo)的結(jié)腸炎，對小鼠機體起保護作用[27]。活體顯微鏡觀察TNBS和OXZ誘導(dǎo)的結(jié)腸炎小鼠與未誘導(dǎo)小鼠腸靜脈中滾動和黏附的白細胞數(shù)，發(fā)現(xiàn)結(jié)腸炎小鼠滾動和黏附的白細胞數(shù)增多，黏附分子表達下調(diào)；而TNBS和OXZ誘導(dǎo)的PAR-2敲除小鼠與PAR-2未敲除小鼠相比滾動和黏附的白細胞數(shù)顯著降低，黏附分子表達下調(diào)[2]。這些結(jié)果顯示PAR-2在腸炎發(fā)生過程中通過調(diào)節(jié)細胞因子和黏附分子的表達而發(fā)揮促炎作用。

PAR-2的激活還與多種癌細胞的增殖、遷移密切相關(guān)，且已被作為抑制乳腺癌細胞快速轉(zhuǎn)移的靶點之一進行研究[28]；但它通過多個方面參與腸道炎癥的發(fā)生、發(fā)展從而扮演促炎或抗炎的角色，尤其是在不同細菌或病毒引起的腸道炎癥中PAR-2參與的具體機制尚需深入研究。

3 展望

綜上所述，PAR-2在腸道炎癥發(fā)生過程中參與腸道的分泌、運動、腸黏膜通透性、細胞因子和黏附分子表達的調(diào)節(jié)，被SLIGRL-NH2激活以后在促炎作用和抗炎作用兩方面都有報道，但是由于PAR-2分布廣泛、激動劑和拮抗劑種類較多且關(guān)于內(nèi)源性PAR-2被抗體阻斷后引起的機體內(nèi)變化的研究較少，有報道稱在小鼠哮喘模型中PAR-2被單克隆抗體阻斷以后氣道炎癥顯著減輕，因此可能在不同的發(fā)病階段PAR-2發(fā)揮的作用不盡相同，關(guān)于PAR-2在腸道炎癥發(fā)生過程中參與的具體機制需要深入研究，內(nèi)源性抗體的應(yīng)用無疑會有很大幫助。

目前主要是針對人和小鼠PAR-2發(fā)揮作用的研究，對于PAR-2在仔豬腹瀉過程中是否也能起到關(guān)鍵作用的研究很少。斷奶仔豬腹瀉是一種嚴重影響?zhàn)B豬業(yè)生產(chǎn)的疾病，死亡率在仔豬死亡總數(shù)中占有較高比例，即使能存活下來也會存在體質(zhì)下降、生長緩慢等問題。結(jié)合現(xiàn)有的關(guān)于PAR-2的研究，暗示它在斷奶仔豬腹瀉過程中也發(fā)揮一定作用，而其可能參與的致病機制以及治療方法都是未來需要研究的方面。