紅細(xì)胞存儲損傷影響因素研究進(jìn)展

楊麗麗，李 姝，張麗華，蘇 燕

（包頭醫(yī)學(xué)院生物化學(xué)與分子生物學(xué)教研室，內(nèi)蒙古包頭014040）

輸血是臨床重要的搶救和治療措施，紅細(xì)胞(red blood cells，RBCs)是輸血治療中使用最廣、用量最多的血液成分。存儲RBCs的能量和ATP消耗所導(dǎo)致RBCs形態(tài)及生物化學(xué)等方面的變化稱為RBCs存儲損傷。存儲損傷會影響血液保存質(zhì)量，降低RBCs運(yùn)輸和釋放氧氣的能力，產(chǎn)生潛在有害物質(zhì)，給臨床輸血帶來安全隱患。了解影響RBCs存儲損傷的因素對于安全輸血具有重要意義。

1 存儲前變異

存儲前變異是從血液采集到血液儲存階段所涉及的變異，包括獻(xiàn)血者的個(gè)體差異和血液采集及成分制備過程的變異，是影響RBCs存儲損傷最復(fù)雜、最難測量的因素。

1.1 獻(xiàn)血者的個(gè)體差異

獻(xiàn)血者個(gè)體差異是影響RBCs質(zhì)量的主要原因[1]。首先獻(xiàn)血者的生活方式會影響RBCs存儲損傷：飲食、體育鍛煉、吸煙、酗酒等會影響RBCs抗氧化能力；患高脂血癥獻(xiàn)血者的RBCs溶血率明顯增加 、膜流動性改變、氧化應(yīng)激和炎癥標(biāo)志增加；高脂飲食可能不會引起血漿脂質(zhì)增高，但可能會引起RBCs功能障礙；體育鍛煉的頻率、強(qiáng)度也會影響RBCs存儲損傷。其次獻(xiàn)血者所患遺傳病也會影響RBCs存儲損傷：例如遺傳性血色病(hereditary haemochromatosis，HH)獻(xiàn)血者體內(nèi)鐵超載容易導(dǎo)致RBCs氧化損傷[2]；鐮狀RBCs病癥獻(xiàn)血者的RBCs溶血率和輸注后RBCs清除率增加[3]；葡萄糖-6-磷酸脫氫酶(glucose-6-phosphate dehydrogenase，G6PD)缺乏的獻(xiàn)血者由于RBCs受氧化應(yīng)激影響易發(fā)生溶血[4]。另外，獻(xiàn)血者的個(gè)體差異也可能會影響輸血效果。有研究認(rèn)為女性獻(xiàn)血者的RBCs彈性好，溶血率低[5]，然而加拿大的縱向隊(duì)列研究發(fā)現(xiàn)輸注女性或年齡在30歲以下年輕獻(xiàn)血者的RBCs會增加死亡率[6]，但是瑞典和丹麥的回顧性研究沒有發(fā)現(xiàn)獻(xiàn)血者年齡對受血者30 d或1年死亡率有影響[7]；法國的回顧性隊(duì)列研究也沒有發(fā)現(xiàn)獻(xiàn)血者年齡、性別和存儲時(shí)間對受血者1年死亡率有影響[8]。Matthews K等[9]對存儲RBCs的變形性進(jìn)行分析，結(jié)果表明RBCs初始質(zhì)量及變形能力與獻(xiàn)血者個(gè)體差異相關(guān)。

1.2 血液采集和成分制備的過程

不同血液采集和成分分離的過程會影響RBCs存儲損傷。血液采集后英國、加拿大和澳大利亞等國要求血液中白細(xì)胞應(yīng)該在室溫保存24 h內(nèi)濾除，然而美國則要求血液中白細(xì)胞應(yīng)在8 h內(nèi)濾除，否則必須冷凍。白細(xì)胞在血液內(nèi)保留時(shí)間過長會影響RBCs的生化特性[10]。加拿大的研究發(fā)現(xiàn)不同血液成分分離過程會影響RBCs特性及輸血效果[11]。Eckstein M等[12]比較了從室溫(RTH)保存24 h的全血中分離的RBCs與從快速冷卻(RC)全血中分離的RBCs，測試了它們的經(jīng)典代謝和氧化損傷標(biāo)記，結(jié)果顯示，與RC-RBCs相比，RTH-RBCs第1天鉀(1.98±0.26對5.23±65.5 mmol/l)和2,3-二磷酸甘油酸(2,3-diphosphoglycerate，2,3-DPG)濃度降低；RTH-RBCs第42天的溶血率高于RC-RBCs(0.52±0.13對0.37±0.12%)；RTH-RBCs的磷脂酰絲氨酸表達(dá)量為0.25±20.20%，而RC-RBCs的為0.07±0.12%；血紅蛋白修飾在兩組間沒有差異；RTH-RBCs在第29天和第42天丙二醛(malondialdehyde，MDA)濃度略高。因此，RC-RBCs和RTH-RBCs只有經(jīng)典體外參數(shù)的微小差異，抗氧化能力和氧化血紅蛋白修飾間無明顯差異。Patel R M等[13]用Nordion Gamma輻射器，以每袋25Gy的劑量照射RBCs，比較了6組RBCs照射和非照射后，其代謝模式的改變，結(jié)果顯示，存儲7 d內(nèi)照射組與對照組RBCs的代謝組型相似，而存儲大于10 d的RBCs則顯示出不同的代謝組型(以儲存時(shí)間和照射為函數(shù))。照射使這些差異隨血液存儲時(shí)間的延長而明顯。在生化水平，照射加速了存儲RBCs的代謝老化，細(xì)胞膜的代謝物受到顯著影響，這可能成為評價(jià)RBCs存儲損傷的有用生物標(biāo)志。

2 存儲過程

作為RBCs保存的外部環(huán)境和營養(yǎng)成分的主要來源，RBCs保護(hù)液的組成成分及理化性質(zhì)的微小變化均可以影響RBCs代謝，進(jìn)而引起RBCs內(nèi)和保護(hù)液中代謝產(chǎn)物的組成發(fā)生改變，進(jìn)一步影響RBCs代謝和保存質(zhì)量。

2.1 保護(hù)液成分

不同保護(hù)液成分會影響存儲RBCs的質(zhì)量。

2.1.1 磷酸鹽- 腺嘌呤-葡萄糖-鳥苷-葡萄糖酸-甘露醇對存儲RBCs的影響 Lagerberg J W等[14]認(rèn)為存儲在磷酸鹽- 腺嘌呤-葡萄糖-鳥苷-葡萄糖酸-甘露醇(phosphate-adenine-glucose-guanosine-gluconate-mannitol，PAG3M)、低滲添加液(Erythro-Sol5，E-Sol5)和添加劑溶液-7(additive solution，AS-7)中的RBCs乳酸鹽、三磷酸腺苷(adenosine triphosphate，ATP)和總腺苷酸增加。在鹽水-腺嘌呤-葡萄糖-甘露醇(saline-adenine-glucose-mannitol，SAGM)和磷酸鹽-腺嘌呤-葡萄糖-鳥苷-鹽水-甘露醇(phosphate-adenine-glucose-guanosine-saline-mannitol，PAGGSM)中儲存，RBCs內(nèi)2,3-二磷酸甘油酸(2,3-bisphosphoglycerate，2,3-BPG)水平迅速下降。在E-Sol 5和AS-7中儲存的RBCs內(nèi)2,3-BPG的下降被抑制，而在PAG3M中，2,3-BPG水平直到第35天仍然保持初始水平，到第56天仍可以檢測到。存儲在SAGM中的RBCs，其溶血率高于存儲在其他AS中的RBCs。 與SAGM相比，儲存在PAGGSM、PAG3M、E-Sol5和AS-7中的RBCs能夠更好地保持其形態(tài)特征。Radwanski K等[15]認(rèn)為E-Sol5可以減緩RBCs存儲損傷，并提高整個(gè)儲存過程中RBCs的質(zhì)量。Burger P等[16]認(rèn)為，在PAG3M中存儲的RBCs，35 d內(nèi)2,3-DPG和ATP水平穩(wěn)定，但是存儲的前21 d葡萄糖消耗量、乳酸產(chǎn)量、果糖-1,6-二磷酸酯和磷酸二羥丙酮水平均較高。

2.1.2 添加劑溶液7對存儲RBCs的影響 Cancelas J A等[17]發(fā)現(xiàn)，存儲在添加劑溶液7(additive solution，AS-7)中第42天和56天，RBCs溶血率和含蛋白質(zhì)微泡的脫落與存儲在AS-1中的RBCs相比顯著降低。存儲在AS-7中的RBCs自體體內(nèi)回收率在第42天(n=27)為88±5%，在第56天(n=27)為82±3%，超過了目前所使用溶液的RBCs回收率。 因此，AS-7可以改善長期儲存損傷,使體內(nèi)RBCs活力顯著增加。Veale M F等[18]認(rèn)為AS-7可以改善ATP和2,3-DPG水平，保持較高pH，增加耐滲透性，減少血型糖蛋白A(glycophorin A，GPA)和微粒(microparticles,MPs)的數(shù)量。D'Alessandro A等[19]將RBCs重新懸浮于對照組AS-3或試驗(yàn)組AS-7中，利用超高效液相色譜-質(zhì)譜對229種代謝物進(jìn)行分析和相對定量檢測，結(jié)果表明，RBCs在AS-3和AS-7中有許多類似的存儲代謝趨勢，AS-7中儲存的RBCs在儲存第1周內(nèi)代謝活性更高，AS-7可以加速磷酸戊糖途徑，使總谷胱甘肽含量增高。此外，AS-7由于無氯化物和碳酸氫鹽負(fù)荷，因此在存儲早期可以改善存儲RBCs能量和氧化還原代謝，但在第42天，差異雖然減少，但仍然比較顯著。

2.1.3 鹽水-腺嘌呤-葡萄糖-甘露醇對存儲RBCs的影響 能量代謝和游離脂肪酸可能成為存儲RBCs結(jié)構(gòu)和功能的重要決定因素。在檸檬酸鹽-磷酸鹽-葡萄糖中收集的RBCs可以在4℃的鹽水-腺嘌呤-葡萄糖-甘露醇(saline-adenine-glucose-mannitol，SAGM)中儲存42 d。在這種受控的但仍然是人造的離體衰老過程中，RBCs積累了可逆或不可逆的損傷。Bardyn M等[20]在71 d內(nèi)每周追蹤RBCs 濃縮物、量化細(xì)胞外葡萄糖和乳酸濃度、檢測總抗氧化能力以及細(xì)胞內(nèi)還原和氧化型谷胱甘肽水平，評估微囊泡、溶血百分比和血液學(xué)參數(shù)，最后使用無標(biāo)記數(shù)字全息顯微鏡記錄RBCs 形態(tài)學(xué)變化和膜波動。結(jié)果顯示，抗氧化能力以及細(xì)胞內(nèi)谷胱甘肽濃度首先升高，在1周和2周后分別達(dá)到最大值；在第5周出現(xiàn)不可逆形態(tài)學(xué)改變，細(xì)胞開始轉(zhuǎn)變?yōu)闀簳r(shí)的棘細(xì)胞和最終的球狀細(xì)胞；同時(shí)，囊泡和溶血率開始呈指數(shù)增長；6周(有效期)后，RBCs內(nèi)谷胱甘肽降低25%，說明氧化應(yīng)激增加；膜波動顯示RBCs從棘狀向球狀細(xì)胞轉(zhuǎn)變時(shí)振幅降低。生物化學(xué)和細(xì)胞水平的各種病變在儲存過程中不斷積累，可能也會影響RBCs輸注后的體內(nèi)恢復(fù)。Mittag D等[21]研究發(fā)現(xiàn)與AS-1相比，存儲在SAGM中的RBCs對氧化和體外輸血相關(guān)應(yīng)激的敏感性更高。

2.1.4 其他保護(hù)液對存儲RBCs的影響 Lagerberg J W等[14]認(rèn)為在磷酸鹽-腺嘌呤-葡萄糖-鳥苷-鹽水-甘露醇(phosphate-adenine-glucose-guanosine-saline-mannitol ，PAGGSM)中儲存，RBCs內(nèi)2,3-二磷酸甘油酸(2,3-bisphosphoglycerate，2,3-BPG)水平迅速下降。在E-Sol 5中儲存的RBCs內(nèi)2,3-BPG的下降被抑制。 Radwanski K等[15]認(rèn)為E-Sol5可以減緩RBCs存儲損傷，并提高整個(gè)儲存過程中RBCs的質(zhì)量。

2.2 存儲條件

保存液的pH會影響存儲RBCs的質(zhì)量。Chang A L等[22]研究了保存液pH對RBCs存儲損傷和輸注后RBCs存活的影響。將小鼠濃縮RBCs(packed RBCs，pRBCs)分別儲存在標(biāo)準(zhǔn)條件(pH 5.8)、酸性(pH4.5)或堿性(pH8.5)AS-3中，儲存期結(jié)束時(shí)測定血紅蛋白、微囊泡產(chǎn)生、磷脂酰絲氨酸外翻、乳酸蓄積和脂質(zhì)過氧化的副產(chǎn)物。將羧基熒光素標(biāo)記的RBCs 輸入健康小鼠以確定細(xì)胞存活，與標(biāo)準(zhǔn)AS-3中存儲的pRBCs相比，儲存在堿性溶液中的RBCs溶血率、磷脂酰絲氨酸外翻、微囊泡生成和脂質(zhì)過氧化均降低；而乳酸水平較高，說明pRBCs仍然具有較高的代謝活性。與標(biāo)準(zhǔn)AS-3儲存相比，堿性儲存增加RBCs 循環(huán)半衰期，而酸性儲存則降低RBCs 循環(huán)半衰期。

2.3 存儲時(shí)間

存儲RBCs大多數(shù)生物變量，例如細(xì)胞變形性、溶血、pH、乳酸鹽、丙二醛和8-異前列烷素等炎癥脂質(zhì)，在存儲期間隨時(shí)間延長而改變，所以儲存時(shí)間成為評價(jià)RBCs存儲損傷的主要參數(shù)。然而，對RBCs存儲損傷的評價(jià)不應(yīng)僅局限于RBCs本身的損傷，更應(yīng)該關(guān)注臨床輸注效果。但是由于方法上的限制，有關(guān)存儲RBCs損傷的臨床意義仍然有爭議。

2.3.1 存儲時(shí)間不影響輸血效果 來自新生兒和接受心臟手術(shù)患者的隨機(jī)對照試驗(yàn)表明[23]，RBCs儲存時(shí)間與患者的不良臨床后果無關(guān)，但是由于方法上的限制，有關(guān)存儲RBCs損傷的臨床意義仍然有爭議。Halmin M等[24]通過觀察性研究發(fā)現(xiàn)RBCs的存儲時(shí)間與患者死亡率之間沒有關(guān)聯(lián)。Desmarets M等[25]通過回顧性隊(duì)列研究發(fā)現(xiàn)RBCs的存儲時(shí)間對受血者1年生存率沒有影響。

2.3.2 存儲時(shí)間影響輸血效果 與上述研究結(jié)果不同，Chadebech P等[26]抽取存儲3 d～8 d(稱為新鮮RBCs)和38 h～42 h(舊RBCs)的11個(gè)存儲RBCs樣本，并分別與嚴(yán)重膿毒癥患者和健康志愿者的血漿共同培養(yǎng)，37℃保存24 h或48 h，檢測衰老標(biāo)記(磷脂酰絲氨酸暴露、鈣流入、活性氧以及RBCs體積)。結(jié)果證實(shí)，影響嚴(yán)重膿毒癥患者輸血效果的主要原因是RBCs存儲時(shí)間，而不是受血者的臨床狀態(tài)。Almizraq R J等[27]利用流式細(xì)胞儀(flow cytometer，F(xiàn)C)和動態(tài)光散射(dynamic light scatting，DLS)分別檢測存儲第3天、7天、21天、42天少白RBCs濃縮物(leukoreduced red cell concentrates，RCCs)中細(xì)胞外囊泡(extracellular vesicles，EVs)的含量和大小。TRPS檢測結(jié)果表明，<200 nm的EVs濃度在整個(gè)儲存期間顯著增加。FC或DLS受到分辨粒度能力<200 nm限制，不能用于EVs濃度檢測。 TRPS和FC檢測結(jié)果顯示，與存儲第3天EVs相比，存儲第42天/43天，≥200 nm的EVs濃度顯著增加。利用DLS測量懸浮液中顆粒的平均尺寸時(shí)，觀察到儲存期間EVs平均尺寸增加，說明存儲時(shí)間會影響 EV的大小和濃度。

3 展望

近年來對存儲損傷的不斷研究使人們越來越多地認(rèn)識到存儲損傷不僅僅是“存儲”引起，存儲前的變異也會引起損傷，而且有理由認(rèn)為存儲前變異是影響存儲損傷最重要也是最難測量的因素。雖然這方面已經(jīng)有大量的研究結(jié)果，但由于方法和地域的局限性，試驗(yàn)結(jié)果仍無法達(dá)到共識。此外，由于臨床用血的需求量大，設(shè)立更多的獻(xiàn)血者篩選條件是不現(xiàn)實(shí)的，因此，今后將從改進(jìn)成分分離工藝和保存液成分著手,將RBCs存儲損傷的危害降至最低，保障輸血安全。