不同蒙藥對牛源致病性大腸桿菌體外抑菌效果的篩選

郭雪梅 內蒙古農業(yè)大學動物科學學院 010018

王純潔 內蒙古農業(yè)大學獸醫(yī)學院 010018

斯木吉德 阿日查 張 劍 敖日格樂 內蒙古農業(yè)大學動物科學學院 010018

賀志英 內蒙古烏蘭察布市卓資縣獸醫(yī)站 012300

大腸桿菌病是由某些血清型菌株引起的一類疾病的總稱[1]。致病性大腸桿菌不僅是全球性腹瀉的主要病因，而且可導致出血性結腸炎等多種疾病。大腸桿菌的致病性與其侵襲的方法、途徑、毒力、數(shù)量和種類有關。不同菌株由于感染體的途徑或病原體的毒力和數(shù)量不同，導致病原體侵入機體后所造成的感染類型不相同。致病性大腸桿菌的毒力因子包括黏附素、毒素和外膜蛋白等，這些毒力因子相互協(xié)調，導致宿主入侵后機體免疫力低下，引起多種疾病[3]。

隨著抗生素、化學合成藥和促生長劑等藥物在養(yǎng)殖業(yè)上的廣泛應用，越來越多的病原菌產生了耐藥性，而且耐藥性也發(fā)生了轉移，同時由于藥物的毒副作用，藥物殘留導致的畜產品安全問題也愈來愈突出。我國傳統(tǒng)中草藥在防治細菌性疾病方面積累了許多寶貴經(jīng)驗，君臣佐使配合，互相協(xié)調作用，即可達到補氣升陽、扶正祛邪和標本兼治的治療效果。黃芩、大黃、蒲公英等多味中草藥的抗菌活性較強，可以作為治療大腸桿菌病的首選藥。另外有研究表明，生物制劑治療法和大蒜素治療法對大腸桿菌病的治療也有一定的療效[6]。因此,本研究通過9味蒙藥對致病性E.coli O78進行了體外抑菌作用的測定，篩選出抑菌作用良好的菌株，旨在為對大腸桿菌病的預防和治療提供科學的理論依據(jù)。

1 試驗材料

（1）試驗藥品。黃連、甘松、瞿麥、草烏葉、黑云香、姜黃、柯子、大黃和多葉棘豆等9味蒙藥均購自內蒙古京遠大藥房。

（2）供試菌株。牛源致病性E.coli O78由內蒙古農業(yè)大學動物科學學院牛生產實驗室提供，從呼和浩特周邊地區(qū)荷斯坦奶牛直腸糞便中提取出來。

（3）試驗試劑。麥康凱瓊脂培養(yǎng)基、營養(yǎng)肉湯和營養(yǎng)瓊脂，購自廣東環(huán)凱生物科技有限公司；NaOH、HCL、蒸餾水、生理鹽水、TTC溶液配制（0.01gTTC購自上海經(jīng)科化學科技有限公司，0.04g琥珀酸鈉用2mL生理鹽水混勻）。

（4）試驗材料。10mL離心管、96孔板、涂布棒、移菌槍、玻璃培養(yǎng)皿、槍頭、移液槍 （1000uL、10uL和200uL）、酒精燈、三角瓶、燒杯和量筒。

（5）試驗儀器。YXQ-LS-50S11立式壓力蒸汽滅菌器，購自上海博訊實業(yè)有限公司醫(yī)療設備廠；D2-1萬用電爐，購自北京中興偉業(yè)儀器有限公司；YC-2602醫(yī)用冷藏箱，購自中科美麥低溫科技有限責任公司；SW-CJ-20雙人單面垂直送風凈化工作臺，購自蘇州泊萊爾凈化設備有限公司；Y1-LRH-400-d生化培養(yǎng)箱，購自北京中西遠大科技有限公司；76新銳可見分光光度計，購自北京普析通用儀器有限責任公司。

2 試驗方法

（1）藥液制備。分別稱取黃連、甘松、瞿麥、草烏葉、黑云香、姜黃、柯子、大黃和多葉棘豆各50g放入紗布包中，置于500mL蒸餾水室溫浸泡過夜，煮沸1.5小時，過濾藥液。濾渣加205mL水，煮沸1小時過濾。2次藥液小火濃縮至50mL（即藥液中所含生藥量為1g/mL），121℃滅菌，4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

（2）E.coli O78菌液制備。將實驗室保存的牛源致病性E.coli O78在營養(yǎng)肉湯-麥康凱瓊脂-伊紅美蘭瓊脂-營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基中，37℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)18～24小時后，接種于營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基中恒溫搖床中，110r/分鐘，37℃培養(yǎng)到對數(shù)期[9]。采用平板菌落計數(shù)法計算菌數(shù)，將菌液渦旋震蕩混勻，取10mL用生理鹽水10倍稀釋10個梯度，每個梯度吸取100uL菌液涂布于營養(yǎng)瓊脂板上，37℃培養(yǎng)18小時，每個梯度做3個重復，進行菌落計數(shù)。選取菌落數(shù)在30～300個之間的瓊脂板取平均值進行計數(shù)。吸取10mL菌液，經(jīng)過5000r/分鐘離心10分鐘，棄上清，留沉淀。用高壓滅菌的生理鹽水洗滌3次，最后用無菌生理鹽水菌液濃度調整為1×107 CFU/mL備用。

（3）小鼠致病性的試驗。選取20±2g的昆明系小鼠，雌雄各半，設置對照組和試驗組，每組10只，分別腹腔注射0.3mL無菌生理鹽水和牛源致病性E.coli O7810倍稀釋液，72小時內觀察牛源致病性E.coli O78對小鼠的致死率。

（4）抑菌圈的測定。將致病性E.coli O78菌液調整為1×107 CFU/mL，用涂布棒均勻地涂布于營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基上，37℃培養(yǎng)1小時，用滅菌的小懾子夾起滅菌好的牛津杯放到涂布好的培養(yǎng)基上，加入200uL藥液，重復3次，在37℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)18～24小時后觀察，用游標卡尺測量抑菌圈直徑。直徑大于15mm為極度敏感，大于10mm、小于15mm為高度極敏，大于8mm、小于10mm為敏感，小于8mm為不敏感[8]。

（5）最小抑菌濃度（MIC）測定。采用二倍稀釋法，將甘松 、瞿麥、草烏葉、黑云香、姜黃、柯子、大黃和多葉棘豆用肉湯依次2倍稀釋，分別稀釋11個梯度，加入96孔板的前11孔中，每孔加200uL，隨后接入50uL對數(shù)期E.coli O78菌液，菌數(shù)為1×107 CFU/mL。第12孔加入200uL肉湯和50uL純菌液作為空白對照。37℃培養(yǎng)18小時后，加入5uL配好的TTC，2小時后觀察顏色變化。試驗組加入染色劑后，沒有被染為紅色的最低藥物濃度即為該藥物的最小抑菌濃度（MIC）。

3 結果與分析

（1）小鼠致病性試驗結果。試驗組小鼠在腹腔注射致病性E.coli O78后72小時內全部死亡，空白組小鼠全部健活；小鼠注射致病性E.coli O78后可見昏睡、厭食和被毛蓬松，少數(shù)可見黃色拉稀和嘴鼻流出黃色液體。迅速剖檢死亡小鼠，可見胸腔和腹腔內有大量黏液滲出；腸道發(fā)生腫脹，腸腔內充滿腥臭、黃色稀薄的內容物；肝臟、脾臟和腎臟腫大，肝表面及切面出現(xiàn)灰白色的壞死灶；肺腫脹、充血、水腫。

（2）體外抑菌試驗結果。黃連的抑菌作用最好，抑菌直徑平均值為18.6mm，表現(xiàn)為極敏，其中最大值達到了22.0mm；其次為甘松、草烏葉、大黃和瞿麥，抑菌直徑分別為14.0mm、13.8mm、13.2mm和12.4mm,均表現(xiàn)為高敏；姜黃的抑菌直徑為7.6mm，表現(xiàn)為不敏；多葉棘豆和柯子沒有抑菌圈產生。

不同蒙藥對致病性E.coli O78的MIC測定結果，黃連的MIC最低為0.0039g/mL，其次為大黃和甘松，MIC分別為0.0625g/mL和0.125g/mL，瞿麥、草烏葉、姜黃的MIC為0.25g/mL，黑云香的MIC為0.5g/mL，而柯子和多葉棘豆沒有MIC的產生。表明除柯子和多葉棘豆外，其余7味蒙藥都對致病性E.coli O78有不同程度的抑菌作用，黃連和大黃的抑菌效果較好。

4 討論

我國的草藥資源相當豐富,人們對中成藥的療效和安全性都比較信任，所以草藥市場的開發(fā)空間十分廣闊。但是目前對草藥抗菌活性的研究仍處于探索階段，蒙藥方面更是鮮有報道。關于中草藥體外抑菌的研究有許多報道，常用的抑菌研究方法有紙片法和杯碟法，這些方法大多是定性分析而非定量分析。紙片法和杯碟法的優(yōu)點是在一個瓊脂平板上可同時進行多種藥物或多種濃度的同一種藥物的試驗,缺點是藥物濃度不一，即定量測定不準。紙片法雖然簡易操作,但是藥液成分復雜,藥量的準確性很難控制,敏感度較低。而牛津杯法可定性反映致病菌對藥物的敏感程度。微量稀釋法不但能夠定量測定藥物對病原菌的最小抑菌濃度，還可以直觀反映細菌在藥物作用下的生長狀況[10]。鑒于此,本試驗采取牛津杯法和2倍稀釋法對9味不同蒙藥對致病性E.coli O78的體外抑菌活性進行了測定。將兩種抑菌試驗方法相結合，避免了單獨采用一種方法造成試驗結果的片面性[11]。

不同蒙藥對大腸桿菌的抑菌圈和MIC均有不同，試驗中9味蒙藥體外抑菌試驗結果顯示,只有黃連對致病性E.coli O78抑菌圈表現(xiàn)為極敏，MIC最低；甘松、草烏葉、大黃和瞿麥對致病性E.coli O78的抑菌直徑表現(xiàn)為高敏，柯子、多葉棘豆既沒有抑菌圈的產生也沒有MIC的產生。其中大黃抑菌圈直徑小于甘松和草烏葉，但MIC卻低于兩者，猜測出現(xiàn)這種差異的原因主要與單味藥的成分有關，不同藥物的體外抑菌作用存在一定差異，所使用的藥物源、質量和提取方法都與抑菌試驗結果有關[12]。

5 結論

將牛津杯法與二倍稀釋法聯(lián)合使用，有效地篩選出9味蒙藥中黃連對致病性E.coli O78的抑菌效果最好，其次為大黃、甘松、草烏葉和瞿麥，而柯子和多葉棘豆對致病性E.coli O78沒有抑菌作用。表明蒙藥在細菌性疾病防治方面有巨大的開發(fā)潛力，可以為蒙藥的開發(fā)和利用提供更為科學的理論依據(jù)。