流產(chǎn)衣原體熒光定量PCR方法的建立及小鼠感染菌體載量測定

，，，

流產(chǎn)衣原體(Chlamydophila.abortus)是專性細(xì)胞內(nèi)寄生的革蘭氏陰性菌，主要造成山羊、綿羊等小型反芻動物的流產(chǎn)性疾病[1-2]。C.abortus還可以感染牛、豬及造成懷孕婦女的流產(chǎn)，是一種非常重要的人獸共患傳染病[3]。

我國對于流產(chǎn)衣原體的預(yù)防主要采用中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院蘭州獸醫(yī)研究所研發(fā)的流產(chǎn)衣原體卵黃囊甲醛滅活油佐劑疫苗，此疫苗多年前在青海、甘肅、新疆等省份推廣使用[4]?？梢詾閯游锾峁┖芎玫拿庖弑Ｗo(hù)效果，達(dá)到預(yù)防流產(chǎn)的目的。然而，在疫苗制備過程中，小鼠作為理想的模式動物已經(jīng)被用于流產(chǎn)衣原體滅活疫苗的效價(jià)檢測[5]。效檢方法主要是對免疫組小鼠和對照組小鼠的臟器進(jìn)行姬姆薩染色涂片，通過普通光學(xué)顯微鏡檢查衣原體原生小體(EB)為主[5]，其結(jié)果判定往往受主觀因素的影響，無法從科學(xué)的角度來說明衣原體滅活疫苗的質(zhì)量保證[6]。因此，本研究擬建立針對C.abortus的富含半胱氨酸的胞質(zhì)蛋白(envB)基因?qū)崟r定量PCR方法，以期通過檢測小鼠臟器C.abortus菌體載量，為流產(chǎn)衣原體滅活疫苗的效檢提供科學(xué)可靠的方法。

1　材料與方法

1.1菌株及DNA流產(chǎn)衣原體、布魯氏菌DNA、均來自本實(shí)驗(yàn)室，弓形蟲DNA由周東輝博士提供。

1.2主要試劑及儀器pMD19-T simple vector、2×Premix ExTaqTM 、DL 2000 DNA Marker、Trans2KPlus II DNA Marker、MiniBEST Universal Genomic DNA Extraction Kit、MiniBEST Agarose Gel DNA extraction kit、MiniBEST Plasmid purification kit、SYBR Premix EX TaqTMⅡ及感受態(tài)細(xì)胞DH5α均購自 TaKaRa 公司。

1.3引物的設(shè)計(jì)與合成envB基因引物設(shè)計(jì)參考GenBank的C.abortusenvB基因序列(登錄號NC_004552.2)，利用Premier 5.0 軟件設(shè)計(jì)envB基因引物CloneF/CloneR和envB基因real-time PCR引物(表1)。兩對引物均由上海生工有限責(zé)任公司合成。

表1引物的序列
Tab.1Nucleotide sequences of primers and probe

名稱Names序列(5′?3′)Sequences長度/bpLengthClone?FGTTCATTTGCCAGCGGGAAGATAGAGG27Clone?RAGAACCACGGTTTGTTACACAAATACGG28Env?FAACCTCAGATAGCAAATTAATCTGG25Env?RATTTGGTATAAGAGCGAAGTTCTGGGGGG25

1.4重組質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品的構(gòu)建按照MiniBEST Universal Genomic DNA Extraction Kit說明書提取流產(chǎn)衣原體(SX5)標(biāo)準(zhǔn)株的核酸作為模板，進(jìn)行PCR擴(kuò)增目的基因。按照MiniBEST Agarose Gel DNA extraction kit說明書步驟，回收純化PCR產(chǎn)物后克隆至pMD19-T載體中構(gòu)建重組質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品。利用分光光度計(jì)測定重組質(zhì)粒的OD260nm/OD280nm濃度，根據(jù)公式：陽性質(zhì)粒copies(copies/μL)=(質(zhì)粒濃度×10-9×稀釋倍數(shù)×6.02×1023)/(660 道爾頓/堿基×堿基數(shù))，計(jì)算標(biāo)準(zhǔn)品的copies。

1.5熒光定量PCR反應(yīng)條件的優(yōu)化以構(gòu)建的EnvB-PMD19T陽性質(zhì)粒為模板，Env-F/Env-R為引物，建立25 μL的反應(yīng)體系，優(yōu)化熒光定量PCR反應(yīng)條件。分別對退火溫度(58 ℃、 60 ℃、 62 ℃、64 ℃)進(jìn)行優(yōu)化，確定最佳退火溫度。

1.6標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立將構(gòu)建的EnvB-PMD19T陽性質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行10倍倍比稀釋，選取1×102copies/μL～1×106copies/μL 5個梯度的陽性重組質(zhì)粒作為模板，同時實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)陰性對照，每個稀釋度分別做3次重復(fù)，按照已經(jīng)優(yōu)化的反應(yīng)條件進(jìn)行熒光定量PCR反應(yīng)。

1.7靈敏度實(shí)驗(yàn)10倍倍比稀釋(1×101copies/μL ～1×105copies/μL)的重組質(zhì)粒為模板，同時實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)陰性對照，進(jìn)行熒光定量PCR反應(yīng)，確定該方法的最低檢測限度。

1.8特異性實(shí)驗(yàn)采用優(yōu)化過的熒光定量PCR體系和條件對流產(chǎn)衣原體、弓形蟲、布魯氏菌DNA進(jìn)行特異性試驗(yàn)檢測。同樣設(shè)立陰性對照。來驗(yàn)證熒光定量PCR引物的特異性。

1.9重復(fù)性實(shí)驗(yàn)檢測以10倍倍比稀釋的重組質(zhì)粒(1×103copies /μL～1×106copies /μL)為模板，進(jìn)行組內(nèi)重復(fù)性試驗(yàn)，每個濃度進(jìn)行3次重復(fù)，分析各濃度組內(nèi)Ct值的變異系數(shù)和標(biāo)準(zhǔn)差；實(shí)驗(yàn)操作重復(fù)3次，分析各濃度組間Ct值的變異系數(shù)和標(biāo)準(zhǔn)差。

1.10菌體載量檢測將實(shí)驗(yàn)室保存的流產(chǎn)衣原體菌株分別以腹腔注射、消化道的方法注入Balb/c小鼠體內(nèi)，每只接種200 μL稀釋菌液(IFU=1.6×106)[7]，對照組注射無菌的PBS 200 μL。在感染后7、14、21、28 d采集小鼠的子宮、脾臟、肝臟、十二指腸，利用優(yōu)化后的熒光定量PCR體系和條件檢測流產(chǎn)衣原體的載量。

2　結(jié)　果

2.1envB基因的PCR 擴(kuò)增及重組質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品的制備 以提取的流產(chǎn)衣原體基因組為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測，顯示目的片段約為1 358 bp(圖1)。將其克隆至pMD19-T載體中，構(gòu)建重組質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品大小(圖2)。利用分光光度計(jì)測定OD260nm/OD280nm的濃度42.5 ng/μL，經(jīng)計(jì)算copies數(shù)約為1×1010copies /μL。

M: DL 2000 DNA Marker; 1: Negative control; 2: The product of C.abortus圖1　envB基因PCR擴(kuò)增片段Fig.1　PCR amplification of target fragment of the C.abortus genome

M: Plus II DNA Marker ; 1: Negative control; 2: EnvB-PMD19T圖2　EnvB-PMD19T質(zhì)粒PCR擴(kuò)增片段Fig.2　The plasmid of EnvB-PMD19T

2.2熒光定量PCR反應(yīng)條件的優(yōu)化以構(gòu)建的EnvB-PMD19T陽性質(zhì)粒為模板，Env-F/Env-R為引物，建立了25 μL的反應(yīng)體系，經(jīng)過反復(fù)試驗(yàn)，最佳的反應(yīng)體系：12.5 μL SYBR Premix EX TaqTMⅡ，引物Env-F和Env-R各1 μL (10 μmol/L)、2 μL DNA模板，8.5 μL的DEPC水。二步法最佳反應(yīng)溫度梯度：95 ℃/30 s；40個循環(huán)95 ℃/5 s；60 ℃/30 s。PCR 反應(yīng)后的溶解曲線溫度梯度：95 ℃/15 s；60 ℃/60 s；95 ℃/15 s。

2.3標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立以倍比稀釋的重組質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品為模板，進(jìn)行熒光定量PCR擴(kuò)增。流產(chǎn)衣原體的標(biāo)準(zhǔn)曲線以熒光強(qiáng)度的對數(shù)值為橫坐標(biāo)，循環(huán)數(shù)為縱坐標(biāo)作圖。結(jié)果顯示，流產(chǎn)衣原體擴(kuò)增方程為：Y=-3.405 Log(x)+39.71，相關(guān)系數(shù)R2=0.99，擴(kuò)增效率達(dá)到97%(圖3)。表明該檢測方法具有高擴(kuò)增效率，并且重組質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品的Ct值與其各自的稀釋倍數(shù)之間具有良好的相關(guān)性。

1×106 copies/μL～1×102 copies/μL圖3　流產(chǎn)衣原體熒光定量PCR擴(kuò)增曲線和標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.3　Amplification curves,standard curves of the real-time PCR assay

2.4靈敏度試驗(yàn)將6個不同稀釋梯度的重組質(zhì)粒(1×101copies/μL～1×105copies/μL)作為模板，進(jìn)行熒光定量PCR擴(kuò)增。結(jié)果顯示，該方法的最低檢出限為10 copies/μL(圖4)，表明該方法具有較高的靈敏度。

1×106 copies/μL～1×101 copies/μL圖4　流產(chǎn)衣原體熒光定量PCR靈敏度Fig.4　Sensitivity of the real-time PCR assay

圖5　流產(chǎn)衣原體熒光定量PCR特異性擴(kuò)增曲線Fig.5　Specific amplification curve of the real-time PCR assay

2.5特異性試驗(yàn)采用優(yōu)化過的熒光定量PCR體系和條件對流產(chǎn)衣原體、弓形蟲、布魯氏菌進(jìn)行特異性試驗(yàn)檢測，顯示流產(chǎn)衣原體具有擴(kuò)增曲線，呈現(xiàn)陽性結(jié)果；弓形蟲、布魯氏菌則無擴(kuò)增曲線，呈陰性結(jié)果(圖5)。重復(fù)性試驗(yàn)結(jié)果顯示組內(nèi)和組間重復(fù)試驗(yàn)變異系數(shù)為1.1174%～1.5510%，均小于2%，表明該方法具有良好的穩(wěn)定性和重復(fù)性(表1)。

2.6重復(fù)性試驗(yàn)分別以不同濃度(1×103copies/μL～1×106copies /μL)的重組質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品為模板。

表2熒光定量PCR組內(nèi)和組間重復(fù)性實(shí)驗(yàn)結(jié)果
Tab.2Reproducibility test of intra- and inter-assay of the real-time PC

模板濃度ConcentrationofStandardplasmid(copies/μL)重復(fù)數(shù)(n)組內(nèi)變異實(shí)驗(yàn)Intra?coefficientofvariation組間變異實(shí)驗(yàn)Inter?coefficientofvariation平均數(shù)x±s變異系數(shù)CV(%)平均數(shù)x±s變異系數(shù)CV(%)1×106318．89±0．10060．532818．69±0．20161．0791×105323．72±0．26501．117423．74±0．03900．16451×104326．23±0．17520．668026．64±0．36851．38311×103329．95±0．19000．634430．46±0．47241．5510

2.7菌體載量檢測將實(shí)驗(yàn)室保存流產(chǎn)衣原體菌株分別以腹腔注射、消化道的方式注入Balb/c小鼠體內(nèi)(IFU=1.6×106)。在感染后7、14、21、28 d采集小鼠的子宮、肝臟；7、14、28 d采集脾臟、十二指腸、利用優(yōu)化后的熒光定量PCR體系和條件檢測流產(chǎn)衣原體的載量。不同途經(jīng)感染小鼠的相同器官在同一時間內(nèi)的IFU以消化道感染小鼠最高(圖6)。無論是腹腔感染還是消化道感染，各臟器在感染14 d時的IFU均高于其他的臟器采集點(diǎn)(圖6)。小鼠消化道感和腹腔感染染14 d時，十二指腸、肝臟、脾臟、子宮的IFU分別是：1.77×105IFU、0.615×105IFU、0.465×105IFU、0.531×105；2.58×105IFU、3.21×105IFU、1.64×105IFU、0.67×105IFU。14 d過后IFU呈下降趨勢。兩種途經(jīng)感染小鼠的不同器官在各時間內(nèi)的IFU普遍存在一個規(guī)律：十二指腸和肝臟的IFU要高于子宮和脾臟。

用優(yōu)化后的熒光定量PCR檢測流產(chǎn)衣原體組織菌體載量，數(shù)據(jù)顯示平均菌體載量水平的比率(±SEM)，**P<0.01；*P<0.005。The C.abortus strain was injected into Balb/c mice by abdominal cavity and alimentary canal.The bacterial load was detected by optimized fluorescent quantitative PCR.The bacterial load of uterus was average cell load level (±SEM),**P<0.01; *P<0.05.圖6　Balb/c小鼠感染流產(chǎn)衣原體的組織菌體載量圖Fig.6　Tissue bacterial load

3　討　論

對于動物感染C.abortus的診斷方法有涂片染色、病原分離、血清學(xué)檢測、DNA檢測[8]。由于其具有傳染性，病原菌的直接分離，純化的衣原體原生小體(EB)或衣原體感染細(xì)胞的血清學(xué)檢測都是具有危害性[9]。并且這些實(shí)驗(yàn)都需要專門的實(shí)驗(yàn)室以及專業(yè)知識人員。因此，C.abortus的微生物學(xué)檢測只能在設(shè)備良好的實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行。各種DNA 擴(kuò)增的方法已被開發(fā)用于檢測流產(chǎn)衣原體[9]。但上述的這些方法只能對衣原體進(jìn)行定性而不能定量。然而，實(shí)時定量PCR 不僅可作為C.abortus有效的檢測方法，還可以對C.abortus進(jìn)行精確的定量，甚至菌體載量的變化。

已有文獻(xiàn)報(bào)道小鼠可用作流產(chǎn)衣原體疫苗效檢的模型動物[5,10]。但需要借助病理組織切片或免疫熒光染色切片、姬姆薩染色切片，普通光學(xué)顯微鏡檢查衣原體原生小體(EB)[11-12]。病理組織切片或免疫熒光染色切片、姬姆薩染色切片都需要專業(yè)的知識人員操作和判定，這在某種程度上限制了技術(shù)的廣泛應(yīng)用。同時，這種判定不僅會有主觀因素的存在，而且對衣原體的判定只是定性的，而不是定量的。如果以此來評價(jià)流產(chǎn)衣原體疫苗的效檢結(jié)果顯然有不足之處。

對本研究建立的實(shí)時熒光定量PCR方法進(jìn)行優(yōu)化反應(yīng)條件，建立標(biāo)準(zhǔn)曲線，結(jié)果顯示標(biāo)準(zhǔn)曲線在1×102copies/μL～1×106copies/μL 內(nèi)呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系，擴(kuò)增效率為97%，可以針對流產(chǎn)衣原體進(jìn)行快速的大規(guī)模臨床篩查。靈敏度試驗(yàn)表明，該檢測方法的最低檢出限低至10 copies/μL。組內(nèi)、組間重復(fù)性試驗(yàn)的變異系數(shù)均小于2%，具有良好的重復(fù)性和穩(wěn)定性。利用NCBI基因序列比對的生物信息學(xué)技術(shù)預(yù)測，設(shè)計(jì)的envB基因引物還可以檢測C.felis、C.caviae，與其他物種沒有交叉反應(yīng)。小鼠試驗(yàn)結(jié)果顯示4種臟器在各時間點(diǎn)消化道感染的菌體載量均高于腹腔感染的載量。近幾年有研究報(bào)道衣原體可以通過生殖道感染快速且長期定殖于小鼠的胃腸等消化道粘膜[13-15]，更有報(bào)道稱將鼠衣原體感染小鼠的粘膜后，衣原體可以快速定殖與腸道[16]。本實(shí)驗(yàn)的消化道感染屬于粘膜感染。消化道感染也是對自然狀態(tài)下衣原體感染途徑的一種模仿[17]。無論是腹腔感染還是消化道感染，脾臟、子宮、肝臟、十二指腸在感染14 d時的流產(chǎn)衣原體菌體載量均高于其他的臟器采集點(diǎn)。兩種途經(jīng)感染小鼠的各個器官，同一時間內(nèi)的IFU基因組拷貝數(shù)存在一定差異，但C.abortus在相同組織器官中的定植和繁殖規(guī)律完全相同，表明C.abortus對各組織器官的噬性有明顯的規(guī)律。這為衣原體在小鼠臟器中的組織嗜性提供了科學(xué)的依據(jù)。這些結(jié)果表明，本試驗(yàn)建立的熒光定量PCR能夠?yàn)榱鳟a(chǎn)衣原體滅活疫苗的效檢提供可靠檢測方法。利用本研究建立的實(shí)時熒光定量PCR對導(dǎo)致家畜流產(chǎn)的布魯氏菌、弓形蟲也進(jìn)行了擴(kuò)增，結(jié)果表明無任何條帶出現(xiàn)，表明建立的熒光定量PCR特異性很好。本研究建立的實(shí)時熒光定量PCR對衣原體進(jìn)行特異性的擴(kuò)增，且能檢測感染小鼠的組織器官中衣原體的載量和變化，為對衣原體滅活疫苗小鼠模型的建立奠定了科學(xué)的基礎(chǔ)。

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