青風藤正丁醇萃取物對肝癌細胞增殖影響的研究

摘 要：為驗證青風藤正丁醇萃取物（BESA）體外抗肝癌活性，研究了BESA對人肝癌細胞株HepG2、SMMC-7721形態(tài)變化、細胞周期、細胞凋亡和細胞增殖的影響。結(jié)果顯示BESA對HepG2、SMMC-7721肝癌細胞均有抑制作用，其半數(shù)抑制濃度（IC50）分別為 18.23 μg/mL，23.45 μg/mL，且呈劑量效應關(guān)系；經(jīng)BESA處理后，HepG2細胞形態(tài)變化很大，細胞出現(xiàn)核皺縮、貼壁性差、細胞裂解等現(xiàn)象，以20 μg/mL的BESA處理HepG2細胞48 h后，流式細胞術(shù)檢測到BESA對HepG2細胞周期的干預能力不強；但在誘發(fā)HepG2細胞發(fā)生凋亡方面效果明顯，說明BESA能誘導HepG2細胞的凋亡達到抑制腫瘤細胞增殖的作用。

關(guān)鍵詞：青風藤；人肝癌細胞HepG2；人肝癌細胞SMMC-7721；抑制作用

中圖分類號：R284.2

文獻標識碼： A

青風藤（Sinomenium acutum），又名清風藤、扶風藤、尋風藤，為防己科植物青藤sinomenium acutum（Thunb.）Rehd.et Wils.和毛青藤sinomenium scutum（Thunb.）Rehd.etWils.var.cinereum Rehd.et Wils.的干燥藤莖[1]。青風藤味苦性平，有祛風濕、通經(jīng)絡(luò)、利水止痛的功效，用于治療風濕麻痹痛、關(guān)節(jié)腫痛、瘙癢、水腫、腳氣等[2]。目前，對青風藤的研究集中于化學成分的分析及藥理活性的研究[3]。青風藤的莖和根中富含的青藤堿是研究者重點研究的活性成分[4]，在降血壓[5]、抗炎[6]、免疫抑制[7]、鎮(zhèn)痛[8]等方面青藤堿具有良好的藥理作用。課題組前期研究發(fā)現(xiàn)青風藤乙醇提取物具有良好的體外抑制肝癌HepG2細胞增殖的活性；調(diào)研更多的文獻發(fā)現(xiàn)青風藤的主要成分——青藤堿對卵巢癌細胞[9]、膠質(zhì)瘤細胞[10]、腎癌細胞[11]、乳腺癌細胞[12]等腫瘤細胞的增殖具有明顯的抑制作用。眾所周知，中藥是一個成分極其復雜的體系，所含的某些微量成分往往具有很強的生理活性；因此課題組擬開展青風藤可能含有的微量抗癌新化合物的挖掘工作。在接下來的研究工作中，課題組首先采用了極性由小至大的溶劑萃取策略。即利用石油醚、氯仿、乙酸乙酯、正丁醇對青風藤乙醇提取物依次萃取。再對各個萃取部位抑制肝癌HepG2細胞增殖的活性進行檢測。實驗結(jié)果發(fā)現(xiàn)青風藤正丁醇萃取物對肝癌細胞的抑制效果明顯好于其他極性部位。因此，在本文中課題組將重點從細胞增殖、細胞形態(tài)變化、細胞周期、細胞凋亡四個方面對青風藤正丁醇萃取物的體外抗癌效應做出評價，為青風藤中微量抗癌新化合物的深度挖掘做前期準備工作。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 實驗材料

人肝癌HepG2、SMMC-7721細胞購于中國科學院典型培養(yǎng)物保藏委員會細胞庫；青風藤產(chǎn)地為四川，由醫(yī)學與生物學研究中心宋長偉博士鑒定。

1.1.2 實驗試劑

胎牛血清（以色列BI公司）；RPMI-1640 培養(yǎng)基、鏈霉素、青霉素（美國 Gibco 公司）；DMSO、胰蛋白酶、Tris（北京索萊寶科技有限公司）；磺酰羅丹明B（美國 Sigma 公司）；ANNEXIN V-FITC/PI凋亡檢測試劑盒（上海碧云天生物技術(shù)有限公司）、DNA含量（細胞周期）檢測試劑盒（北京索萊寶科技有限公司）；其余試劑均為國產(chǎn)分析純。96 孔板、6孔板、25 cm2培養(yǎng)瓶（美國康寧公司）。

1.1.3 實驗儀器

SENCOR-201型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（上海中順生物科技有限公司）；細胞培養(yǎng)箱（德國賀利氏公司），UR-4100型酶標儀（上海拜格生物科技發(fā)展有限公司），GTR21-1高速冷凍離心機（美國賽默飛公司）；倒置相差顯微鏡（日本奧林巴斯公司）；超凈工作臺（蘇州安泰空氣技術(shù)公司）；FACS Calibur 流式細胞儀（美國BD公司）；超純水制備系統(tǒng)（美國密理博公司產(chǎn)品）。

1.2 實驗方法

1.2.1 青風藤正丁醇萃取物的制備

青風藤全株風干、粉碎、過60目篩。稱取粉末 100 g加1 L 95%乙醇，3 h回流提取兩次，合并兩次抽濾的提取液，減壓濃縮去除溶劑。干燥后至恒重得青風藤醇提物，依次用石油醚、氯仿、醋酸乙酯、正丁醇洗脫，收集各段洗脫液，濃縮。用SRB法對各萃取部位進行抗腫瘤活性的粗篩，發(fā)現(xiàn)青風藤正丁醇萃取物對肝癌HepG2、SMMC-7721細胞的增殖具有明顯的抑制活性，故選取青風藤正丁醇萃取物（以下簡稱BESA）進行后續(xù)實驗。稱取正丁醇提取物10 mg，100 μL DMSO 溶解后，臨用前用培養(yǎng)基稀釋成所需濃度，室溫保存。

1.2.2 肝癌細胞的培養(yǎng)

從液氮中取出凍存HepG2細胞的凍存管， 37 ℃的雙蒸水快速解凍，然后取出置于含10%胎牛血清（內(nèi)含青霉素 100 U/mL，鏈霉素 100 U/mL）的 RPMI-1640 完全培養(yǎng)基中。將培養(yǎng)瓶置于37 ℃、5% CO2飽和濕度的培養(yǎng)箱培養(yǎng)，12 h后換液，待細胞長滿培養(yǎng)瓶底部，棄培養(yǎng)液，PBS沖洗，0.25%胰蛋白酶消化，以1∶3傳代培養(yǎng)，每日更換新鮮培養(yǎng)基。SMMC-7721細胞培養(yǎng)方法同上。

1.2.3 SRB法測定BESA對肝腫瘤細胞增殖的影響

取HepG2（或SMMC-7721）細胞，以200 μL 8000個/孔接種于96孔板中，每種細胞接種一塊實驗板（T）和一塊對照板（T0）。培養(yǎng) 20 h 后，對照板每孔加入50 μL 4 ℃預冷的三氯乙酸（TCA）溶液；實驗板換入200 μL 含BESA的培養(yǎng)基使其終濃度分別為 1.25、2.5、5、10、20、40 μg/mL，每種濃度設(shè)5個重復，另設(shè)置陰性對照組（C）和溶劑對照組，繼續(xù)培養(yǎng)48 h加入50 μL 4℃預冷的TCA溶液，靜置5 min移入4 ℃冰箱中固定1 h，取出用雙蒸水沖洗5遍，室溫晾干。每孔加入70 μL 0.4%的SRB染液，10 min后用1%醋酸沖洗5次，晾干后加入100 μL 10 mmol/L的緩沖Tris堿液溶解，在酶標儀上采用波長530 nm測吸光度值。按照下列公式計算腫瘤細胞生長抑制率。改良寇氏法計算半數(shù)抑制濃度（IC50），公式為

1.2.4 BESA對細胞形態(tài)的影響

將約長滿培養(yǎng)瓶的HepG2細胞用0.25%胰蛋白酶消化后，以1×104個/孔接種到24孔培養(yǎng)板中培養(yǎng)，24 h后，棄培養(yǎng)液。每孔分別加入含一定體積BESA的細胞培養(yǎng)基使其藥物處理濃度分別為5 μg/mL、10 μg/mL和20 μg/mL，空白對照組加入對應體積的DMSO，每組設(shè)3個復孔。48 h后于倒置顯微鏡下觀察HepG2細胞形態(tài)的變化情況并拍照。

1.2.5 細胞周期和細胞凋亡的檢測

取HepG2細胞以2×104 個/瓶接種到六孔板中，培養(yǎng)24 h后，棄去培養(yǎng)液，加入含一定體積的BESA的細胞培養(yǎng)基使其藥物處理終濃度分別為5 μg/mL、10 μg/mL和20 μg/mL，空白對照組加入對應體積的DMSO，每組設(shè)3個復孔。繼續(xù)培養(yǎng)48 h。隨后收集所有細胞，按照碧云天細胞周期或細胞凋亡試劑盒的使用說明進行待測樣品的制備，最后上機檢測。

1.2.6 統(tǒng)計學處理實驗數(shù)據(jù)

采用 SPSS13.0統(tǒng)計軟件，組間比較采用單因素方差分析，P<0.05表示差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 BESA對肝癌細胞增殖的影響

BESA對肝癌SMMC-7721、HepG2細胞增殖的抑制作用如表 1 所示。BESA濃度分別為1.25、 2.5 μg/mL時，對兩種細胞的抑制率較低；隨著濃度的升高，其抑制作用也逐漸增強。當BESA濃度為40 μg/mL時，對SMMC-7721、HepG-2的抑制率分別為60.32%、58.59%。經(jīng)改良寇氏法計算其IC50分別為18.23、23.45 μg/mL。

2.2 BESA對人肝癌細胞HepG2形態(tài)的影響

由表1可知，本實驗中BESA對肝癌HepG2細胞增殖的抑制效果較好，因此選取肝癌HepG2細胞進行后續(xù)實驗，繼續(xù)考察BESA對HepG2肝癌細胞的作用。如圖1所示，空白對照組細胞生長正常，接近于長滿培養(yǎng)皿；終濃度為10 μg/mL的BESA作用48 h后，細胞變圓且突起，細胞數(shù)目減少，細胞與鄰近細胞分離，貼壁能力下降，形態(tài)異常的細胞增多。當作用濃度提高到20 μg/mL時，細胞密度顯著減小，細胞形態(tài)不規(guī)則，出現(xiàn)細胞核皺縮的現(xiàn)象，顯示出很強的抑制作用。

2.3 BESA對HepG2細胞周期分布的影響

終濃度為5 μg/mL、10 μg/mL和20 μg/mL的BESA作用于HepG2細胞48 h后，檢測其細胞周期變化，結(jié)果見表2。給藥后G0/G1期細胞數(shù)下降，S期的細胞數(shù)增加，G2/M期細胞數(shù)也略有增加，綜合來看BESA對HepG2細胞周期分布的影響不大。

2.4 BESA對HepG2細胞凋亡的影響

終濃度為5、10、20 μg/mL（IC50）的BESA作用于肝癌HepG2細胞48 h后，檢測其細胞凋亡的變化情況，結(jié)果如圖2所示：與未給藥的對照組比較，BESA能誘導肝癌HepG2細胞發(fā)生早期凋亡，凋亡現(xiàn)象明顯；且誘發(fā)凋亡的程度與劑量呈正相關(guān)關(guān)系。

3 討論

原發(fā)性肝癌是一種常見惡性腫瘤，其發(fā)病率和死亡率均居惡性腫瘤的第三位[13]。青風藤原本是一味用于治療風濕性及類風濕性關(guān)節(jié)炎的傳統(tǒng)民間中藥，但現(xiàn)代藥理學研究發(fā)現(xiàn)其主要成分——青藤堿具有抑制腫瘤細胞增殖和誘導腫瘤細胞凋亡的生理活性[14-15]。由于中藥是一個多成分多靶點的復雜體系，某些未知微量成分往往具有更強的生理活性[16-17]；課題組認為青風藤中極有可能含有活性更強的新化合物，開展青風藤微量抗癌新化合物的挖掘工作非常有意義。

實現(xiàn)上述目標的前提是從多個角度確認青風藤活性部位是否具有明確的抑癌效應。在前期的研究中，課題組采用SRB法對其抗腫瘤活性的有效部位進行了初篩，發(fā)現(xiàn)青風藤乙醇提取物的正丁醇萃取部分對肝癌細胞的增殖有較強的抑制作用。本實驗首先以人肝癌細胞株HepG2和SMMC-7721為研究對象，發(fā)現(xiàn)BESA對人肝癌細胞株HepG2和SMMC-7721的抑制作用呈劑量效應關(guān)系，其IC50分別為18.23 μg/mL和23.45 μg/mL。由IC50可知，BESA對人肝癌細胞株HepG2的抑制作用較強。因此，在后續(xù)實驗中又以HepG2細胞為重點實驗對象，通過顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn)，經(jīng)BESA作用后的HepG2細胞出現(xiàn)細胞核皺縮、細胞貼壁性差、細胞裂解等現(xiàn)象。

由于腫瘤的發(fā)生常與細胞的異常增殖有密切的關(guān)系，腫瘤細胞的周期阻滯劑可能成為抑制癌癥的有效物質(zhì)[18]；青風藤中是否含有此類造成細胞周期阻滯的物質(zhì)呢？為了回答這個問題，本研究考察了BESA對HepG2細胞周期的影響，實驗結(jié)果提示BESA對肝癌HepG2細胞周期干預的能力較弱。在接下來的實驗中，我們檢測了BESA誘導肝癌HepG2細胞凋亡的能力，實驗結(jié)果顯示20 μg/mL濃度的BESA就能造成10%以上的HepG2細胞發(fā)生早期凋亡，BESA誘發(fā)細胞凋亡的能力非常強；提示：BESA中含有誘導腫瘤細胞凋亡的物質(zhì)，值得進一步深度挖掘?；诒疚牡难芯拷Y(jié)果，在后續(xù)研究中課題組將利用現(xiàn)代色譜技術(shù)對青風藤正丁醇萃取物中所含有的微量成分進行分離純化，再輔以現(xiàn)代波譜分析技術(shù)進一步確定活性化合物的結(jié)構(gòu)，為合理利用青風藤這一傳統(tǒng)中藥材，以及后期的新藥創(chuàng)制提供實驗依據(jù)。

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（責任編輯：江 龍）