豬流行性腹瀉病毒檢測(cè)方法研究進(jìn)展

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劉風(fēng)光 長(zhǎng)陽(yáng)土家族自治縣動(dòng)物衛(wèi)生監(jiān)督所（湖北宜昌） 443500

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豬流行性腹瀉(Porcine Epidemic Diarrhea,PED)是由冠狀病毒科豬流行性腹瀉病毒 (Porcine Epidemic Diarrhea Virus,PEDV)引起的，可導(dǎo)致豬嘔吐、水樣腹瀉、脫水和仔豬高致死率為特征的高度接觸性消化道傳染病。該病一年四季均有發(fā)生，但是多發(fā)生于冬春季節(jié)。1971年該病首次報(bào)道于英國(guó)，隨后許多國(guó)家相繼報(bào)道[1]，我國(guó)于1976年發(fā)現(xiàn)該病[2]，各日齡的豬均可感染PEDV發(fā)病，其中哺乳仔豬受到的危害最嚴(yán)重，給生豬養(yǎng)殖造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失[3,4]。分子生物學(xué)檢測(cè)方法以檢測(cè)速度快、靈敏度高和特異性好等特點(diǎn)已經(jīng)廣泛應(yīng)用于細(xì)菌及病毒病的檢測(cè)，并展示出了良好的應(yīng)用前景。本文就目前國(guó)內(nèi)外PEDV檢測(cè)的分子生物學(xué)方法的最新研究進(jìn)展進(jìn)行綜述，為豬流行性腹瀉的診斷和防控提供參考。

1 巢式PCR檢測(cè)方法

劉琪等研究人員[5]根據(jù)GenBank中豬流行性腹瀉病毒（PEDV）的基因序列分別設(shè)計(jì)2對(duì)引物，在完成最佳條件的篩選、特異性和敏感性試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，建立了一種快速區(qū)分PEDV疫苗毒株與野毒株的巢式PCR檢測(cè)方法。建立的PCR快速檢測(cè)方法能夠分別對(duì)PEDV疫苗毒株和野毒株擴(kuò)增出特異性片段，片段大小分別為774bp和150bp。該方法對(duì)傳染性胃腸炎病毒（TGEV）、輪狀病毒(RV)、豬瘟病毒（HCV）和偽狂犬病病毒（PRV）則不能擴(kuò)增出特異性片段。該方法具有快速、靈敏、特異和通用等特點(diǎn)，可用于實(shí)驗(yàn)室的快速診斷、分子流行病學(xué)的調(diào)查和野毒株的分離鑒定。

2 多重RT-PCR檢測(cè)方法

秦毅斌等[6]根據(jù)GenBank中PEDV變異毒株、經(jīng)典毒株及弱毒疫苗株的S基因和ORF3基因，設(shè)計(jì)合成2對(duì)特異性擴(kuò)增引物，通過(guò)目的片段的數(shù)量和片段大小來(lái)判斷PEDV的毒株類型，建立了檢測(cè)不同PEDV毒株類型的雙重RT-PCR鑒別檢測(cè)方法，該方法中PEDV變異毒株能同時(shí)擴(kuò)增出234bp和826bp2條目的條帶，PEDV經(jīng)典毒株只能擴(kuò)增出1條234bp的目的條帶，弱毒疫苗株只能擴(kuò)增出1條185bp的目的條帶，該方法檢測(cè)A群豬輪狀病毒（PRoVA）、豬瘟病毒（CSFV）、豬繁殖與呼吸綜合征病毒（PRRSV）、豬細(xì)小病毒 （PPV）、偽狂犬病病毒 （PRV）、豬嵴病毒（PKV）、豬乙型腦炎病毒 （JEV）、豬圓環(huán)病毒2型（PCV2）和豬細(xì)環(huán)病毒（TTV）均為陰性，能檢測(cè)到的最低核酸濃度為2.3×10-4ng/μl，該方法檢測(cè)91份臨床腹瀉樣品，變異毒株陽(yáng)性感染率為62.64%（57/91），經(jīng)典毒株陽(yáng)性感染率為3.30%（3/91），弱毒疫苗株陽(yáng)性率為4.40%（4/91）。該多重RT-PCR鑒別檢測(cè)方法能夠特異性區(qū)分PEDV變異毒株、經(jīng)典毒株和弱毒疫苗株，可用于PEDV經(jīng)典株、變異株和疫苗株的臨床快速鑒別檢測(cè)和流行病學(xué)調(diào)查。

施開創(chuàng)等[7]針對(duì)PEDV的S基因和ORF3基因序列設(shè)計(jì)3對(duì)特異性引物，經(jīng)過(guò)反應(yīng)條件的優(yōu)化，建立了能夠同時(shí)檢測(cè)并區(qū)分PEDV經(jīng)典株、變異株和疫苗株的三重RT-PCR方法，該方法中能夠同時(shí)擴(kuò)增出429bp和198bp者為經(jīng)典株，能夠同時(shí)擴(kuò)增出274bp和198bp者為變異株，能夠同時(shí)擴(kuò)增出429bp和148bp者為疫苗株。該方法利用3對(duì)特異性引物實(shí)現(xiàn)了在同一個(gè)擴(kuò)增反應(yīng)中鑒別檢測(cè)PEDV3種不同毒株的目標(biāo)，為PEDV變異毒株的鑒別診斷與流行病學(xué)調(diào)查提供了可靠的技術(shù)手段。

顏邦斌等[8]為了建立一種快速鑒別檢測(cè)豬流行性腹瀉病毒(PEDV)變異毒株的方法，試驗(yàn)采用特異性試驗(yàn)、敏感性試驗(yàn)和臨床應(yīng)用等方法對(duì)鑒別診斷PEDV變異毒株的一步法雙重RT-PCR方法進(jìn)行了研究。結(jié)果表明∶該方法對(duì)PEDV變異毒株能夠擴(kuò)增出大小為870bp和543bp的2條特異性條帶，對(duì)PEDV經(jīng)典毒株和疫苗株均只能擴(kuò)增出大小為543bp的1條特異性條帶；對(duì)豬傳染性胃腸炎病毒(TGEV)、豬輪狀病毒(RV)、豬瘟病毒 (CSFV)、豬繁殖與呼吸綜合征病毒(PRRSV)、豬乙型腦炎病毒(JEV)、豬細(xì)小病毒(PPV)、豬偽狂犬病毒(PRV)和豬圓環(huán)病毒2型(PCV－2)均無(wú)任何擴(kuò)增條帶；對(duì)變異毒株、經(jīng)典毒株、疫苗株的檢測(cè)靈敏度分別達(dá)0.75ng、0.80ng、0.09ng的RNA含量。用該方法檢測(cè)136份豬腹瀉病料樣品，共檢測(cè)出陽(yáng)性樣品72份，其中變異毒株陽(yáng)性樣品65份，變異毒株陽(yáng)性率達(dá)47.79%，與基于S基因單重RT-PCR方法和基于ORF3基因單重RT-PCR方法的符合率均為100%。說(shuō)明雙重RT-PCR鑒別檢測(cè)方法具有良好的特異性和敏感性，操作簡(jiǎn)單，可以準(zhǔn)確、快速鑒別診斷出PEDV變異毒株。

3 RT-LAMP檢測(cè)方法

環(huán)介導(dǎo)等溫核酸擴(kuò)增 (Loop-mediated isothermal amplification，LAMP)技術(shù)依賴6條特異引物和1種具有鏈置換特性的DNA聚合酶，在等溫條件下快速、高效、高特異和高靈敏地?cái)U(kuò)增靶序列。逆轉(zhuǎn)錄環(huán)介導(dǎo)等溫核酸擴(kuò)增(RT-LAMP)是在原反應(yīng)液中加入一定量的逆轉(zhuǎn)錄酶，可以實(shí)現(xiàn)RNA的一步擴(kuò)增。田野等[9]建立起RT-LAMP技術(shù)，對(duì)實(shí)驗(yàn)室送檢的40份仔豬腹瀉病料進(jìn)行檢測(cè)，同時(shí)使用常規(guī)RT-PCR方法和膠體金試劑盒進(jìn)行檢測(cè)并比較試驗(yàn)結(jié)果。RT-LAMP的陽(yáng)性檢出率30%要比膠體金試劑盒檢測(cè)(10%)和PCR(12.5%)高。而且該技術(shù)的最大優(yōu)點(diǎn)就是無(wú)需精密的儀器，操作簡(jiǎn)單快捷，因此適合中小型豬場(chǎng)對(duì)病原的快速診斷。

4 TaqMan熒光定量PCR檢測(cè)方法

桑益旸等[10]基于豬流行性腹瀉病毒（porcine epidemic diarrhea virus，PEDV）的 N 基因，建立了 PEDV的TaqMan探針RT-PCR檢測(cè)方法。以標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒繪制log10拷貝數(shù)與Ct之間標(biāo)準(zhǔn)曲線的線性相關(guān)系數(shù)值為0.996，檢測(cè)靈敏度為100拷貝/μl，對(duì)傳染性胃腸炎病毒的檢測(cè)結(jié)果均為陰性，批內(nèi)和批間的變異系數(shù)均小于1%，表明該方法具有良好的特異性、靈敏性和穩(wěn)定性。對(duì)不同代次細(xì)胞培養(yǎng)上清液中的病毒樣品進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果表明該方法能夠滿足PEDV野毒株分離過(guò)程中的病毒定量檢測(cè)需要。

5 病毒抗體ELISA檢測(cè)方法

趙玉龍等[11]為檢測(cè)豬血清中豬流行性腹瀉病毒(PEDV)抗體水平，以純化的PEDV作為包被抗原，優(yōu)化ELISA反應(yīng)條件，建立了檢測(cè)PEDV血清IgG抗體的診斷方法。當(dāng)血清OD（450nm）值＞0.31時(shí)，判定陽(yáng)性；當(dāng) OD（450nm）值小于 0.26時(shí)，判定陰性；當(dāng) OD（450nm）值介于兩者之間判定可疑。結(jié)果表明，試驗(yàn)建立的ELISA抗體檢測(cè)方法可用于檢測(cè)豬血清中豬流行腹瀉病毒抗體、監(jiān)測(cè)豬流行腹瀉病的流行情況和評(píng)價(jià)相關(guān)疫苗的免疫效果。孫冰等[12]以原核表達(dá)的豬流行性腹瀉病毒AH2012株N蛋白為包被抗原，通過(guò)條件優(yōu)化建立了一種快速的間接酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）檢測(cè)方法。利用該ELISA檢測(cè)豬流行性腹瀉病毒血清時(shí)為陽(yáng)性，而與豬繁殖與呼吸綜合征病毒、偽狂犬病病毒、豬傳染性胃腸炎病毒、口蹄疫病毒，豬圓環(huán)病毒2型、豬呼吸道冠狀病毒的陽(yáng)性血清均無(wú)交叉反應(yīng)；批內(nèi)和批間重復(fù)性試驗(yàn)的變異系數(shù)均小于5.55%；該方法與中和試驗(yàn)檢測(cè)結(jié)果總符合率為88.75%。本研究建立的方法可以應(yīng)用于我國(guó)豬流行性腹瀉病毒的診斷、流行病監(jiān)測(cè)以及疫苗研發(fā)時(shí)抗體水平的檢測(cè)，為該病的防控提供一種有效的檢測(cè)工具。

6 實(shí)時(shí)熒光RPA等溫檢測(cè)方法

呂繼洲等[13]基于PEDV病毒M基因保守序列，設(shè)計(jì)一系列擴(kuò)增引物及其熒光探針，以包含PEDV病毒M基因片段的PUC57質(zhì)粒為模板，同時(shí)以包含豬傳染性胃腸炎病毒（TGEV）、豬繁殖與呼吸綜合征病毒（PRRSV）、豬圓環(huán)病毒 2型（PCV2）及古典豬瘟病毒（CSFV）等病毒膜蛋白或核衣殼蛋白基因序列的質(zhì)粒作為對(duì)照，建立了一種PEDV實(shí)時(shí)熒光重組酶聚合酶擴(kuò)增（RPA）等溫檢測(cè)方法，測(cè)定了方法的特異性與敏感性。結(jié)果表明，該實(shí)時(shí)熒光RPA方法可在39℃恒溫反應(yīng)20分鐘。特異性擴(kuò)增PEDV病毒M基因，與TGEV、PRRSV等對(duì)照病毒基因無(wú)交叉反應(yīng)，其檢測(cè)限為10拷貝/μl。應(yīng)用該實(shí)時(shí)熒光RPA方法可有效檢測(cè)出血漿及血漿蛋白粉中的PEDV核酸。本研究建立的實(shí)時(shí)熒光RPA檢測(cè)方法簡(jiǎn)單、快速、靈敏度高，可為PEDV的檢測(cè)防控提供一種新的、可靠的技術(shù)支持。

7 實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR檢測(cè)方法

楊峰等[14]為建立了一種特異、靈敏、量化、快速的豬流行性腹瀉病毒（PEDV）檢測(cè)方法，設(shè)計(jì)1對(duì)PEDV N基因的特異性引物，建立Eva Green染料的實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR的檢測(cè)方法，并對(duì)疑似PEDV感染的臨床樣品進(jìn)行檢測(cè)。結(jié)果顯示，所建立的實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR方法的標(biāo)準(zhǔn)曲線具有良好的線性關(guān)系，線性相關(guān)系數(shù)R2=0.999；不與豬傳染性胃腸炎病毒（TGEV）、豬瘟病毒（CSFV）、豬繁殖與呼吸綜合征病毒（PRRSV）發(fā)生交叉反應(yīng)，具有較強(qiáng)的特異性；靈敏度比常規(guī)RT-PCR方法高100倍；重復(fù)性試驗(yàn)的變異系數(shù)均小于5%，重復(fù)性良好。對(duì)43份臨床樣品進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果比普通PCR多檢出2份陽(yáng)性。結(jié)果表明，本研究建立的實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR檢測(cè)方法在特異性、靈敏度和重復(fù)性方面都很好，可用于臨床PEDV檢測(cè)。

8 雙抗體夾心ELISA檢測(cè)方法

王晨燕等[15]采用特異性好的鼠源抗豬流行性腹瀉病毒（PEDV）單克隆抗體為捕獲抗體，兔源多克隆抗體為檢測(cè)抗體，建立PEDV雙抗體夾心ELISA檢測(cè)方法。結(jié)果顯示，該方法的最佳反應(yīng)條件為：抗PEDV單克隆抗體 E1包被質(zhì)量濃度 4.40μg·ml-1，37℃包被 2小時(shí)，采用5%BSA封閉液封閉1小時(shí)，兔抗PEDV抗體工作質(zhì)量濃度為5.91μg·ml-1，酶標(biāo)二抗稀釋度為1∶2000，以O(shè)D(450nm)≥0.381作為陽(yáng)性判定標(biāo)準(zhǔn)。該ELISA方法對(duì)豬輪狀病毒和豬傳染性胃腸炎病毒無(wú)交叉反應(yīng)。敏感度可達(dá)30μg·ml-1；重復(fù)性變異系數(shù)小于10%。采用該方法和RT-PCR方法同時(shí)檢測(cè)臨床樣品42份，陽(yáng)性樣品符合率為92.30%，表明建立的PEDV雙抗體夾心ELISA檢測(cè)方法具有特異性好、敏感性高和方便快捷等優(yōu)點(diǎn)，可用于PEDV快速檢測(cè)。

9 套式PCR檢測(cè)方法

套式PCR方法是設(shè)計(jì)內(nèi)、外2對(duì)引物，通過(guò)2次擴(kuò)增對(duì)樣品檢測(cè)，該方法能夠節(jié)省時(shí)間和試劑用量，而且敏感性較高。王金良等[16]根據(jù)已發(fā)表的PEDV N基因核苷酸序列，設(shè)計(jì)合成2對(duì)引物，建立了檢測(cè)PEDV的套式RT-PCR方法，其中外引物擴(kuò)增片段長(zhǎng)度為297bp，內(nèi)引物擴(kuò)增片段長(zhǎng)度為212bp。