骨髓間充質(zhì)干細胞細胞膜片復(fù)合富血小板血漿促進種植體周圍骨組織再生的研究

劉茜 周煒 劉歡 王忠山 李雪健 趙銥民

目前，提高種植體骨結(jié)合的方法主要為通過物理、化學修飾等方法進行種植體表面改性。但放療區(qū)骨組織由于骨細胞及微血管受損而導(dǎo)致種植體周圍骨改建和再生能力降低，僅單純依賴種植體表面改性，得到的效果并不明顯。在前期的研究中，本課題組發(fā)現(xiàn)將BMSCs細胞膜片包裹于種植體周圍構(gòu)建組織工程化的種植體可促進種植體的骨結(jié)合［1］，但單純使用BMSCs細胞膜片而沒有添加促進血管生成的因子無法在放療區(qū)得到很好的促進骨組織再生的效果。將內(nèi)皮祖細胞（EPCs）與BMSCs構(gòu)建復(fù)合細胞膜片可以在促進成骨的同時促進血管的再生，包裹種植體種植于放療區(qū)可獲得較好的促進骨結(jié)合的效果［2］，但仍存在植入時膜片易脫落或膜片聚集于種植體上部而使作用范圍較小等問題［3］，并且對于缺損區(qū)的形貌維持和體積支撐很有限，當種植體周圍存在較大的骨組織缺損時則無法很好的實現(xiàn)骨組織再生，因此需要進一步研究如何優(yōu)化細胞膜片的應(yīng)用。富血小板血漿（PRP）含有大量促進成骨和成血管的細胞因子，近年來開始應(yīng)用于骨組織再生［4］。有研究表明，使用PRP處理種植體可以提高種植體的骨結(jié)合與穩(wěn)定性［5］。將BMSCs與富血小板血漿復(fù)合用于犬下頜骨種植體周圍，取得較好的骨組織再生效果［6］。PRP在鈣離子、凝血酶等的激活下可以形成凝膠狀結(jié)構(gòu)，本實驗將PRP與BMSCs細胞膜片聯(lián)合使用，構(gòu)建可注射的復(fù)合凝膠，研究其促進種植體周圍骨組織再生的可能性。

1 材料與方法

1.1 主要材料和設(shè)備

α-MEM培養(yǎng)基（Gibco，美國）；胎牛血清（FBS）、胰蛋白酶、PBS緩沖液、抗壞血酸、枸櫞酸鈉、雙抗、4%多聚甲醛固定液、戊巴比妥鈉（Sigma，美國）；CO2培養(yǎng)箱（Thermo Forma，美國）；體式顯微鏡（LEICA M205FA，德國）；正置顯微鏡成像系統(tǒng)（Nicon CX J30，日本）；場發(fā)射掃描電子顯微鏡（S-4800，Hitachi，日本）；純Ti種植體（Φ2 mm，長6 mm，西安有色金屬研究院）；β-TCP方塊（武漢華威有限公司）；小動物Micro CT（Inveon CT，Siemens AG，德國）；硬組織切片機（LEICA SP1600，德國）；6周齡BALB／c裸鼠；2周齡SD大鼠（空軍軍醫(yī)大學動物實驗中心）。

1.2 BMSCs的獲取、鑒定及細胞膜片的制備

2周大SD大鼠，過量戊巴比妥鈉注射處死，取股骨及脛骨，全骨髓法培養(yǎng)BMSCs。取第三代BMSCs用于后續(xù)實驗，倒置顯微鏡下拍照。成骨誘導(dǎo)：取第三代BMSCs，當細胞生長融合約90%后，培養(yǎng)基更換為成骨誘導(dǎo)液（15%FBS，1%雙抗，50μg／ml左旋抗壞血酸，10－7mol／L地塞米松，10 mmol／L b-甘油磷酸鈉），進行成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)，3周后茜素紅染色。成脂誘導(dǎo)：取第三代BMSCs，當細胞生長融合約90%后，培養(yǎng)基更換為成脂誘導(dǎo)液（15%FBS，1%雙抗，0.5 mmol／L IBMX，1μmol／L地塞米松，200μmol／L吲哚美辛，10μmol／L胰島素），誘導(dǎo)2周后進行油紅O染色。

細胞膜片培養(yǎng)：取第三代BMSCs，當細胞生長融合約80%，培養(yǎng)基更換為成膜誘導(dǎo)液（10%FBS，1%雙抗，50μg／ml Vc）。培養(yǎng)10～14 d至膜片形成。將BMSCs細胞膜片切割為大小約為1 mm×1 mm的顆粒。取少量膜片在體式顯微鏡下觀察并固定后做石蠟切片及HE染色。

1.3 PRP的制備

取體重300 g左右SD大鼠，1%戊巴比妥鈉麻醉后固定，備皮，于第三、第四肋間將注射器刺入心臟取動脈血，按照9∶1的體積加入3.8%檸檬酸鈉抗凝液混勻。1 700 r／min離心10min，取上清液，3 200 r／min離心5 min，棄3／4上清液，混勻，即可制得PRP。

1.4 BMSCs細胞膜片-PRP復(fù)合物的構(gòu)建及體內(nèi)移植

1.4.1 將BMSCs細胞膜片（初始細胞數(shù)量為5×106個／培養(yǎng)皿）切割后收集，離心，PBS清洗，加入250μl PRP及25μl凝血酶，混勻，迅速吸入注射器內(nèi)。30～40 s即可凝固為凝膠狀。取部分凝膠快速轉(zhuǎn)移至含有4%多聚甲醛的離心管內(nèi)，固定24 h后凍干、掃描電鏡觀察其形態(tài)結(jié)構(gòu)。

取中心有圓柱形孔隙（直徑3 mm，長4mm）的β-TCP小方塊（5 mm×5 mm×5 mm），將種植體置入其中，分別將 BMSCs膜片-PRP復(fù)合物（BMCS＋PRP組）、單純BMSCs細胞膜片碎片（BMCS組）、單純PRP凝膠（PRP組）使用16G針頭注射入種植體與材料之間的孔隙中。

1.4.2 取9只BALB／C裸鼠，腹腔注射1%戊巴比妥鈉麻醉，消毒雙側(cè)皮膚，剪開背部皮膚約2 cm，鈍性分離皮下組織，隨機將3組復(fù)合物分別植入（n＝6），縫合皮膚并消毒。

1.4.3 Micro-CT分析 飼養(yǎng)8周后取材，取樣本于4%多聚甲醛中固定24 h后進行Micro-CT掃描（分辨率為21μm），觀察種植體表面新骨形成并進行三維重建。選擇灰度為8000區(qū)分種植釘和β-TCP材料，選擇灰度為4000區(qū)分骨結(jié)構(gòu)和β-TCP，選擇灰度為1500區(qū)分骨組織與空腔。感興趣區(qū)域為β-TCP和種植體之間的空間，計算骨體積／總體積（BV／TV）。

1.4.4 不脫鈣硬組織切片及VG染色 將固定后的樣品梯度酒精脫水，置入二甲苯中透明24 h，依次轉(zhuǎn)入滲透液I、II、III中分別浸泡48 h，最后進行包埋、切片，切片厚度為50μm。對切片進行 VG染色后觀察、拍照，采用image pro plus6.0軟件分析種植體周圍骨面積（BA）。計算公式為感興趣區(qū)域內(nèi)新生骨面積／總面積，感興趣區(qū)域為種植體與β-TCP材料之間的空隙。

1.5 統(tǒng)計學分析

所有數(shù)據(jù)采用SPSS 17.0軟件進行統(tǒng)計學分析。實驗數(shù)據(jù)采用 one-way ANOVA檢驗比較組間差異；若結(jié)果有差異，采用Turkey HSD檢驗進行兩兩比較，P＜0.05時認為有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié) 果

2.1 BMSCs鑒定

BMSCs為短梭型，呈集落樣生長（圖1A）。成脂誘導(dǎo)染色可見有脂滴形成（圖1B）。成骨誘導(dǎo)染色可見紅染鈣化結(jié)節(jié)形成（圖1C）。誘導(dǎo)14 d后，可見細胞膜片形成，可揭起。將細胞膜片剪碎后，在體視顯微鏡下觀察，可見膜片呈半透明狀，大小約1 mm×1 mm（圖1D）。HE染色可見細胞膜片碎片由2～3層細胞及大量細胞外基質(zhì)構(gòu)成，厚度30～50μm（圖1E）。

2.2 BMSCs-PRP復(fù)合物的制備

BMSCs膜片顆粒與PRP、凝血酶混合后約40 s可形成淡黃色凝膠狀結(jié)構(gòu)（圖2A）。掃描電鏡下觀察可見網(wǎng)狀纖維結(jié)構(gòu)的PRP與大量BMSCs細胞聚集的膜片，PRP充填于細胞膜片所構(gòu)成的框架之間（圖2B）。將BMSCs與PRP復(fù)合凝膠注入種植體與β-TCP間后可得種植體-BMSCs膜片-PRP復(fù)合體（圖2C）。

圖1 BMSCs形態(tài)與鑒定及BMSCs膜片顆粒的形態(tài)學觀察（×100）Fig 1 Characterization of BMSCs and morphological observation of BMSCs sheet fragments （×100）

圖2 BMSCs膜片-PRP復(fù)合物的構(gòu)建Fig 2 Construction of BMSCs sheet fragments-PRP complex

2.3 Micro-CT結(jié)果

Micro-CT結(jié)果可見BMSCs＋PRP組種植體周圍有較多骨質(zhì)形成。而BMSCs組與PRP組種植體周圍幾乎無骨質(zhì)形成（圖3A）。BV／TV結(jié)果BMSCs＋PRP組為（0.122 9±0.055 65），BMSCs組為（0.010 82±0.008 37），PRP組為（0.014 63±0.003 44），BMSCs＋PRP組顯著高于BMSCs組及PRP組，具有統(tǒng)計學差異（P＜0.05）。BMSCs組與PRP組無明顯差異（圖 3B）。

2.4 硬組織切片結(jié)果

硬組織切片經(jīng)VG染色（圖4A）后可見BMSCs膜片＋PRP組種植體周圍有紅染的新生骨形成，骨內(nèi)可見骨陷窩及骨細胞。新生骨周圍可見較多尚未完全礦化的類骨質(zhì)，其中含有豐富的細胞核較大的成骨細胞及血管，并有新生骨伸向種植體與金屬表面接觸。BMSCs膜片組可見較多纖維結(jié)締組織，未見新生骨形成。PRP組僅在種植體上部有少量纖維組織。對硬組織切片種植體周圍骨面積（BA）進行分析（圖 4B），BMSCs＋PRP組 BA（0.082 6±0.006 44）顯著高于BMSCs組（0.009 3±0.002 99）及 PRP組（0.003 7±0.001 78）（P＜0.05）。BMSCs組與 PRP組無明顯差別（P＝0.316）。

3 討 論

在本實驗中，通過將BMSCs膜片與PRP混合構(gòu)建了可注射的凝膠狀結(jié)構(gòu)，注射于種植體周圍，研究發(fā)現(xiàn)了使用BMSCs與PRP復(fù)合物組在種植體周圍有更多的新生骨形成；證實了聯(lián)合使用BMSCs膜片與PRP可以促進種植體周圍骨組織再生。

圖3 Micro CT觀察及分析Fig 3 Micro CT observation and analysis

在本實驗中，使用β-TCP材料模擬種植體植入種植窩的物理狀態(tài)，以便將細胞膜片與PRP復(fù)合物置于種植體周圍，并利于取材后進行不脫鈣硬組織切片；術(shù)后8周可見CS＋PRP組產(chǎn)生了最多的新生骨；Micro-CT結(jié)果顯示在CS＋PRP組中，種植體與材料的孔隙中有較多骨質(zhì)形成；硬組織切片結(jié)果也驗證了這一點，并且可見部分新生骨沿種植體表面生長。同時，也可觀察到在紅染的新生骨周圍有較多藍紫色類骨質(zhì)及未完全骨化的纖維結(jié)構(gòu)，表明其正在礦化。單純BMSCs膜片組可見大量纖維結(jié)締組織，但并未見到有礦化的膠原及血管形成，表明單純BMSCs細胞膜片的成骨效果較差。對照組PRP組僅在種植體上部有少量纖維結(jié)締組織，可能是由于裸鼠的粘膜上皮細胞與材料接觸而形成。

圖4 β-TCP／BMSCs-PRP／種植體組織學觀察及檢測Fig 4 Histological examinations ofβ-TCP／BMSCs-PRP／implant constructs

實驗結(jié)果表明PRP在BMSCs細胞膜片成骨的過程中起到了重要的作用。PRP作為自身血液提取的富含高濃度血小板的血漿，獲取較易，沒有免疫原性，并且包含多種成骨相關(guān)的生長因子，包括PDGF、TGF-β1、VEGF、IGF-1等，在骨形成和愈合的初始階段有促進作用［7］。并且可以促進細胞的增殖，基質(zhì)的重建及血管再生［8］。PRP可以提高 BMSCs的ALP活性和COL-I型膠原的表達［9］。同時PRP可以提高BMSCs中VEGF表達，促進血管的生成，而豐富的血管可以為新生骨的形成帶來更多的營養(yǎng)與氧氣，新生血管也可以刺激成骨細胞及成骨細胞前體細胞的分化，從而獲得更好的骨組織再生［10］。有研究將PRP與BMSCs用于促進骨質(zhì)疏松模型的大鼠的骨缺損，可以獲得更好的骨組織愈合和再生［11］。對于放療區(qū)骨組織而言，放療所造成的血管損傷是造成成骨細胞、骨髓細胞等在較長時間內(nèi)數(shù)量減少及功能受損的主要原因，因此，促進血管再生在放療區(qū)骨組織再生中尤為重要［12］。在本實驗中，通過將BMSCs膜片與PRP復(fù)合，在成骨的同時可以看到更多的新生血管形成，從而實現(xiàn)更好的骨組織的再生。

BMSCs是骨組織工程中常用的種子細胞之一，已有大量研究使用BMSCs與支架材料進行骨的再生。通過Vc連續(xù)誘導(dǎo)法可以獲得具有一定厚度的BMSCs細胞膜片。有研究表明BMSCs細胞膜片因其有細胞與細胞的接觸及大量的細胞外基質(zhì)而有更好的成骨效果，在BMSCs膜片中，成骨相關(guān)基因如骨鈣素、成血管相關(guān)基因如VEGF等的表達都較BMSCs細胞更多，與PRP復(fù)合可以提高骨組織的再生和重建［13］。在本實驗中，將BMSCs細胞膜片切割為含有大量細胞及細胞外基質(zhì)的細胞聚集體，與PRP復(fù)合構(gòu)建為可注射的三維凝膠狀結(jié)構(gòu)；這種三維結(jié)構(gòu)較單純的細胞膜片可以使細胞膜片與PRP充分接觸，更好的促進細胞的增殖與分化；同時這樣具有一定流動性的凝膠狀結(jié)構(gòu)可使用注射器將注射到種植體周圍，可以解決單純使用細胞膜片包裹種植體所存在的植入時膜片脫落等問題，對于種植體周圍的骨缺損也可促進骨組織的再生。

綜上，本研究發(fā)現(xiàn)BMSCs與PRP可以促進種植體周圍骨組織的再生。為進一步證明BMSCs細胞膜片與PRP復(fù)合物在促進種植體周圍成骨的能力，在后續(xù)實驗中將進行大動物種植缺損的模型構(gòu)建及在放療等因素的影響下，BMSCs膜片與PRP復(fù)合物是否具有更好的促進種植體骨結(jié)合及周圍骨組織再生的能力。

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