長鏈非編碼RNA linc-01135對靜態(tài)牽張力作用下人炎癥牙周膜干細(xì)胞成骨分化的影響

鄒宛樺 秦文 徐悅?cè)?秦再秀 劉佳 金作林

牙周膜干細(xì)胞（periodontal ligament stem cells，PDLSCs）是牙周組織再生領(lǐng)域最重要的種子細(xì)胞之一［1－2］，其對力有高度敏感性，適宜的機(jī)械刺激可促進(jìn)其增殖、成骨等生物學(xué)功能［3］。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)［4］，牙周病的炎癥微環(huán)境會(huì)影響PDLSCs對力學(xué)刺激的應(yīng)答反應(yīng)：12%的靜態(tài)牽張力（SMS）是促進(jìn)健康來源PDLSCs（H-PDLSCs）成骨分化的最佳力值，但炎癥來源的PDLSCs（P-PDLSCs）對該力值的耐受性下降，表現(xiàn)為促成骨作用的顯著降低，其相關(guān)機(jī)制尚未見報(bào)道。

長鏈非編碼RNA（long non-coding RNA，lncRNA）是一類轉(zhuǎn)錄本長度大于200 nt的非編碼RNA，其通過對基因表達(dá)的調(diào)控影響機(jī)體生長、發(fā)育等重要生命活動(dòng)以及炎癥、腫瘤等疾病的發(fā)展和轉(zhuǎn)歸［5－6］。linc-01135是一條定位于Chr1：58785151-58899712，長度為994 nt的基因間lncRNA。我們前期的lncRNA基因芯片檢測結(jié)果顯示，linc-01135在P-PDLSCs中的表達(dá)較H-PDLSCs明顯下調(diào)。本研究將進(jìn)一步驗(yàn)證linc-01135在HPDLSCs和P-PDLSCs中的表達(dá)情況，并探討其對12%SMS作用下P-PDLSCs成骨分化能力的影響。

1 材料與方法

1.1 主要試劑和儀器

α-MEM培養(yǎng)基、1 000 U／ml青霉素、1 000 U／ml鏈霉素（Gibco，美國）；胰蛋白酶、β-甘油磷酸鈉、地塞米松、抗壞血酸（Sigma，美國）；胎牛血清（四季青，浙江天杭生物科技公司）；慢病毒（上海吉?jiǎng)P基因）；茜素紅、Trizol Regent（Life Technologies，美國）；PrimeScriptTMRT-PCR kit逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、Syber Green熒光定量PCR試劑盒（Takara，日本）；Bioflex 6孔板、FX-4000T Tension Plus System（Flexcell，美國）；Real-Time PCR儀（Biosytems 7500，美國）。

1.2 方法

1.2.1 H-PDLSCs和 P-PDLSCs的分離、培養(yǎng)及鑒定

1.2.1.1 H-PDLSCs和 P-PDLSCs的分離、培養(yǎng) 收集因正畸治療需要拔除的健康牙齒及牙周炎的牙齒，PBS沖洗至牙根潔凈，刮取根中1／3的牙周膜組織，加入3 mg／ml I型膠原酶，37℃消化1 h。等體積含10% 胎牛血清（FBS）的 α-MEM終止消化，800 r／min，離心5 min，棄上清液。加入α-MEM培養(yǎng)基（含10%FBS、100 U／ml青霉素，100 U／ml鏈霉素）后接種于6孔板，置于恒溫37℃、5%CO2孵箱中培養(yǎng)。待細(xì)胞匯合達(dá)80%時(shí)采用低密度培養(yǎng)法篩選純化細(xì)胞。

1.2.1.2 H-PDLSCs和 P-PDLSCs間充質(zhì)干細(xì)胞表面標(biāo)記物檢測 取第3代細(xì)胞，以5×105個(gè)／200μl密度轉(zhuǎn)移至1.5 ml EP管中，PBS沖洗2次，分別加入2μl鼠抗人CD29、CD105、CD45、CD34抗體，4℃避光孵育1 h，PBS沖洗3次，流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞表面標(biāo)志物的表達(dá)情況。

1.2.2 靜態(tài)牽張力加載系統(tǒng)的構(gòu)建 取第3代細(xì)胞，以3×105個(gè)／孔密度接種于Bioflex 6孔板，同步化處理后置于FX-4000T牽張力加載系統(tǒng)上SMS加載（力值 12%，頻率0.1 Hz，12 h）。

1.2.3 慢病毒轉(zhuǎn)染 取第3代P-PDLSCs，接種密度為4×104個(gè)／ml。根據(jù)慢病毒轉(zhuǎn)染說明書進(jìn)行轉(zhuǎn)染，轉(zhuǎn)染后72 h熒光顯微鏡下觀察轉(zhuǎn)染情況，待轉(zhuǎn)染后細(xì)胞匯合達(dá)80%進(jìn)行12%SMS加載。

1.2.4 RT-PCR 收樣后用 Trizol一步法抽提總RNA，RNA質(zhì)檢合格后采用PrimeScriptTMRT-PCR kit試劑盒逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA，以actin為內(nèi)參檢測相關(guān)基因表達(dá)水平。

1.2.5 成骨分化能力檢測 將需成骨誘導(dǎo)的樣品培養(yǎng)基更換為成骨誘導(dǎo)液（含10%FBS的α-MEM，地塞米松10 mol／L，維生素 C 50μg／ml，β-磷酸甘油 10 mmol／L），培養(yǎng)21 d后進(jìn)行茜素紅染色，60%異丙醇室溫固定5 min，ddH2O水化處理細(xì)胞2 min，染色1 min，ddH2O沖洗2次，大體及鏡下觀察礦化結(jié)節(jié)形成情況并進(jìn)行定量分析。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

用SPSS 16.0統(tǒng)計(jì)軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，2組間比較用兩獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，各組間比較采用Oneway ANOVA檢驗(yàn)，結(jié)果以±s表示，檢驗(yàn)水準(zhǔn)α＝0.05。

2 結(jié) 果

2.1 H-PDLSCs和P-PDLSCs表面標(biāo)記物鑒定

流式細(xì)胞儀檢測結(jié)果顯示，H-PDLSCs和 PPDLSCs均強(qiáng)陽性表達(dá)間充質(zhì)干細(xì)胞表面標(biāo)記物CD29，CD105，陰性表達(dá)造血系統(tǒng)來源細(xì)胞表面標(biāo)記物CD45，CD34，表明所分離培養(yǎng)的細(xì)胞為間充質(zhì)來源干細(xì)胞（圖 1）。

2.2 12%SMS對 H-PDLSCs和 P-PDLSCs成骨分化能力的影響

RT-PCR結(jié)果顯示，H-PDLSCs在12%SMS加載后成骨基因RUNX2、ALP的表達(dá)上升，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01），P-PDLSCs中成骨基因的表達(dá)上升不明顯（圖2A）。茜素紅染色所示趨勢與PCR結(jié)果一致（圖 2B、2C）。

2.3 linc-01135在 H-PDLSCs和P-PDLSCs中表達(dá)情況的影響及其與成骨基因RUNX2表達(dá)量相關(guān)性

RT-PCR檢測結(jié)果顯示P-PDLSCs中 linc-01135的表達(dá)量較 H-PDSLCs下降約 2.32倍（0.431±0.078，P＜0.05）（圖 3A）。成骨誘導(dǎo) 1、3、7、14 d中l(wèi)inc-01135表達(dá)量與成骨基因RUNX2表達(dá)量呈相關(guān)關(guān)系（圖3B）。

2.4 P-PDLSCs慢病毒轉(zhuǎn)染效率檢測

熒光視野下觀察P-PDLSCs已成功轉(zhuǎn)染慢病毒（圖4A、4B）。RT-PCR結(jié)果顯示P-PDLSCs轉(zhuǎn)染linc-01135慢病毒后，表達(dá)量上調(diào)約3.87倍（3.869 46±0.258 12，P＜0.001），轉(zhuǎn)染 linc-01135-RNAi慢病毒后，表達(dá)量降低約2.74倍（0.364 51±0.084 78，P＜0.01），表明轉(zhuǎn)染有效（圖 4C）。

圖1 流式細(xì)胞儀檢測H-PDLSCs和P-PDLSCs表面標(biāo)記物表達(dá)情況Fig 1 Mesenchymal stem cell phenotype examination by flow cytometric analysis

圖2 12%SMS對H-PDLSCs和P-PDLSCs成骨分化能力的影響Fig 2 The evaluation of osteogenesis differentiation capability of H-PDLSCs and P-PDLSCs after 12%SMS loading

圖3 linc-01135在H-PDLSCs和P-PDLSCs中表達(dá)情況與成骨基因RUNX2相關(guān)性分析Fig 3 The expression level of linc-01135 and the correlation with RUNX2 in H-PDLSCs and P-PDLSCs

圖4 轉(zhuǎn)染效率檢測Fig 4 Transfection efficiency examination

圖5 上調(diào)及下調(diào)linc-01135表達(dá)對P-PDLSCs在12%SMS作用下成骨分化能力的影響Fig 5 The evaluation of osteogenesis differentiation capability of P-PDLSCs after 12%SMS loading with up-regulation and down-regulation of linc-01135

2.5 上調(diào)及下調(diào) linc-01135表達(dá)對 P-PDLSCs在12%SMS作用下成骨分化能力的影響

RT-PCR結(jié)果顯示，上調(diào)linc-01135的表達(dá)后進(jìn)行12%SMS加載，RUNX2、ALP、OPG的表達(dá)較對照組明顯上升；下調(diào)linc-01135的表達(dá)后進(jìn)行12%SMS加載，RUNX2、ALP、OPG的表達(dá)較對照組下降，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＜0.001）（圖5A）。茜素紅染色所示趨勢與PCR結(jié)果一致（圖5B、5C）。

3 討 論

牙周膜干細(xì)胞是牙周組織中的間充質(zhì)干細(xì)胞，其對牙周組織的功能維持和修復(fù)再生有重要作用［1］。在炎癥微環(huán)境中，大量炎性因子的產(chǎn)生會(huì)降低PDLSCs的增殖和遷移能力，并影響其對機(jī)械刺激的應(yīng)答反應(yīng)［7－8］。目前，表觀遺傳學(xué)是干細(xì)胞生物學(xué)功能研究領(lǐng)域的熱點(diǎn)［9－10］。作為表觀遺傳的重要調(diào)控分子，lncRNA對干細(xì)胞分化的調(diào)控作用正逐漸受到關(guān)注，但目前僅有少數(shù)的lncRNA在PDLSCs成骨分化過程中的作用機(jī)制被闡明［11－12］，而 lncRNA在 PDLSCs對機(jī)械應(yīng)力介導(dǎo)的成骨分化中的調(diào)控作用迄今尚無相關(guān)報(bào)道。

在臨床正畸治療中我們發(fā)現(xiàn)，牙周炎患者對正常正畸力的反應(yīng)較緩慢，而輕力能更快的實(shí)現(xiàn)其牙齒移動(dòng)。課題組前期研究已證實(shí)12%SMS是促進(jìn) HPDLSCs成骨分化的最佳力值，但該力值對P-PDLSCs的促成骨作用較弱，在部分樣本中出現(xiàn)抑制作用。本研究結(jié)果中，P-PDLSC在12%SMS加載后成骨基因的表達(dá)較前期研究高可能與本研究所選取樣本年齡以及細(xì)胞代數(shù)均較前期研究小有關(guān)，成骨基因的基線表達(dá)水平較高，在對機(jī)械刺激的應(yīng)答上也較衰老樣本積極，該變化趨勢與Zhang等［13］的報(bào)道一致。但在本研究中12%SMS對P-PDLSCs的促成骨效應(yīng)與H-PDLSCs相比顯著降低，也說明了炎癥微環(huán)境減弱了PDLSCs對力學(xué)刺激的應(yīng)答反應(yīng)，在正常力值的刺激下PPDLSCs無法表現(xiàn)出與H-PDLSCs相似的牙周改建效果。為研究其中的調(diào)控機(jī)制，我們通過構(gòu)建lncRNA基因芯片并對在H-PDLSCs和 P-PDLSCs中差異表達(dá)的lncRNA進(jìn)行篩選后發(fā)現(xiàn)，linc-01135在P-PDLSCs中的表達(dá)較H-PDLSCs明顯下調(diào)，同時(shí)在成骨誘導(dǎo)后其表達(dá)量與成骨基因表達(dá)呈相關(guān)關(guān)系，其很有可能參與了對P-PDLSCs的成骨分化調(diào)控。本研究通過慢病毒上調(diào)及下調(diào)linc-01135的表達(dá)，觀察到linc-01135對P-PDLSCs在12%SMS作用下的成骨分化有積極的調(diào)控作用，有效上調(diào)其表達(dá)后P-PDLSCs在12%SMS加載后的成骨分化能力明顯提高，可能為改善炎癥條件下牙周組織對正畸力介導(dǎo)的組織改建提供新的思路。

隨著對lncRNA調(diào)控機(jī)制研究的逐步深入，目前已證實(shí)基因間lncRNA可作為競爭性內(nèi)源RNA，與核心轉(zhuǎn)錄因子和microRNA一起構(gòu)成調(diào)控網(wǎng)絡(luò)［14］。通過對linc-01135進(jìn)行ceRNA分析發(fā)現(xiàn)，其存在與miR-17-5p、miR-106b-5p等參與成骨基因調(diào)控的microRNA的結(jié)合位點(diǎn)，其可能通過招募染色質(zhì)修飾復(fù)合物來影響其鄰近區(qū)域相關(guān)成骨基因啟動(dòng)子來實(shí)現(xiàn)表觀遺傳干預(yù)作用，也有可能發(fā)揮“microRNA sponge”功能調(diào)控目標(biāo)microRNA在靶mRNA上的分布［15］，但其具體調(diào)控機(jī)制仍有待進(jìn)一步研究。

lncRNA的發(fā)現(xiàn)對闡明炎癥和疾病發(fā)展與轉(zhuǎn)歸中的科學(xué)現(xiàn)象提供了新的思路，探索lncRNA對 PPDLSCs在機(jī)械應(yīng)力刺激應(yīng)答中的調(diào)控機(jī)制，可為改善牙周炎患者的組織修復(fù)能力及正畸牙齒移動(dòng)效率提供潛在的干預(yù)靶點(diǎn)。

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