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    一種經(jīng)皮種植體抗菌肽控釋涂層的構(gòu)建及性能研究

    2018-04-12 22:12:32苗強(qiáng)夏雨凝蒙萌張征宇馬楚凡
    關(guān)鍵詞:納米管植入物抗菌肽

    苗強(qiáng) 夏雨凝 蒙萌 張征宇 馬楚凡

    經(jīng)皮鈦種植體在臨床上應(yīng)用廣泛,如骨錨式助聽器、牙科植入物、頜面贗復(fù)體、心室輔助裝置等等,但由于皮膚結(jié)構(gòu)和組成特殊性,如皮脂腺和毛囊的存在,同時(shí)體表為有菌環(huán)境,使經(jīng)皮種植體在皮膚整合過程中有著遠(yuǎn)高于口內(nèi)種植體的感染率與失敗率[1-2]。

    為了解決經(jīng)皮種植體感染率高的問題,許多學(xué)者嘗試改變植入物的表面形貌、增大表面積從而增強(qiáng)植入物與經(jīng)皮部位的整合,維持表皮屏障,以減少細(xì)菌的侵入、定植,降低感染風(fēng)險(xiǎn)[3-4]。

    研究表明,微米級(jí)表面可以在植入物與皮膚結(jié)合處形成機(jī)械鎖扣結(jié)構(gòu),阻止上皮下行,從而促進(jìn)皮膚整合[3];而納米管結(jié)構(gòu)有助于植入物與皮膚的整合,而且可以裝載藥物,納米管結(jié)構(gòu)本身也有一定的抗菌性能[5]。但是,增大植入物表面積的同時(shí)也增加了病原體粘附幾率,不利于感染控制。因此即使經(jīng)過嚴(yán)格的消毒與感染控制,經(jīng)皮種植手術(shù)之后細(xì)菌侵襲仍然常有發(fā)生,經(jīng)皮部位感染主要由金黃色葡萄球菌,凝固酶陰性葡萄球菌引起[6-7],且種植體經(jīng)皮部位在愈合過程中處于有菌狀態(tài),因此僅僅依靠改變種植體經(jīng)皮段或經(jīng)皮基臺(tái)的表面形貌不足以滿足抗菌需求。

    在種植體穿皮膚段進(jìn)行藥物裝載,提高抗感染能力的同時(shí)促進(jìn)與皮膚的整合,是一種非常有前景的方法。但目前常用的銀離子、化學(xué)藥物、抗生素等還存在細(xì)胞毒性、耐藥性等問題[8-11]??咕氖且活惿餀C(jī)體產(chǎn)生的自我防御性的小分子多肽,具有高效、廣譜的抗菌性能,且具有較好的生物安全性以及不易產(chǎn)生耐藥性等優(yōu)勢(shì)[12];其中抗細(xì)菌肽HHC-36具有良好的應(yīng)用前景。直接在植入體表面加載藥物雖然可以提高抗菌能力,但由于藥物會(huì)在很短時(shí)間流失、代謝掉,難以在術(shù)后的高危感染期保持最小的抑菌濃度,使用效果不佳。因此需要使用高分子聚合物、高分子微球如聚(乳酸-乙醇酸)(PLGA)、聚乳酸乙醇酸酯(PGLA)、聚蘋果酸、石墨烯微膠囊等等作為緩釋劑,來抑制藥物突釋,實(shí)現(xiàn)藥物的持續(xù)釋放。其中PDLLA生物相容性好,可降解為對(duì)機(jī)體無毒、無刺激性的物質(zhì),是目前最常用的一類緩釋劑[13]。

    因此,為解決目前經(jīng)皮鈦種植體感染率高的問題,本試驗(yàn)使用鈦納米管為載體,研究在其表面構(gòu)筑PDLLA緩釋的HHC-36抗菌涂層的方法,并測(cè)試涂層的體外藥物緩釋效果和抗菌性能。

    1 材料與方法

    1.1 主要試劑與儀器

    所有試劑均為分析純,購自西安飛揚(yáng)生物科技有限公司,抗菌肽由上海生工生物工程股份有限公司合成,金黃色葡萄球菌由第四軍醫(yī)大學(xué)口腔醫(yī)院微生物實(shí)驗(yàn)室提供,穩(wěn)壓電源 (TPR6010S,深圳市安泰信科技有限公司),紫外分光光度計(jì) (UV-1600,上海美譜達(dá)儀器有限公司)。

    1.1.1 TiO2納米管的制備及抗菌肽裝載 采用陽極氧化法制備二氧化鈦納米管。直徑10 mm、厚1 mm純鈦片,在400ml去離子水中加入5ml HF,一定速度磁力攪拌下,陽極放入鈦片,陰極為碳棒,20 V電壓下陽極氧化處理4 h。

    采用溶劑澆鑄法在制備好的二氧化鈦納米管表面加載藥物。精確秤取2.0 g PDLLA,充分溶解于乙酸乙酯中,加入0.1 g抗菌肽,超聲振蕩,形成5%分散均勻的懸濁液,將試件載藥面浸沒在濁液中2 min,取出靜置晾干后再次浸入,重復(fù)3次,室溫下過夜干燥,乙酸乙酯揮發(fā)后獲得載藥試件。

    1.1.2 緩釋性能的測(cè)定 將載藥試件放入1×PBS中,37℃水浴,在不同時(shí)間點(diǎn)取出2 ml PBS并補(bǔ)充,第1天0~5 h共取6次,第2~15天每日11:00 AM取樣,通過回歸方程測(cè)定取出液中抗菌肽濃度,記錄釋放量。

    1.1.3 抗菌性能測(cè)試 試件抑菌圈測(cè)定:選用金黃色葡萄球菌為指示菌,試驗(yàn)前將冷凍保存的菌種劃線接種至平板培養(yǎng)基,37℃培養(yǎng)24 h;挑單菌落接種至100 ml液體培養(yǎng)基,37℃、200 r/min搖床培養(yǎng)過夜,菌液備用。使用預(yù)加菌液傾注平板法制備試驗(yàn)平板,往已冷卻至50℃左右的瓊脂平板培養(yǎng)基中注入一定量的菌液,混合均勻,傾注平板 (約20 ml/平板),水平靜置凝固后備用。

    抗菌試驗(yàn)的試件分為3組,1組為PDLLA復(fù)合抗菌肽涂層的試驗(yàn)組,2組為只加載PDLLA的對(duì)照組,3組為未載藥的空白對(duì)照組。,以環(huán)氧乙烷消毒,置入含金黃色葡萄菌的MH瓊脂平板中心位置,載藥面對(duì)培養(yǎng)基。37℃恒溫箱培養(yǎng)24 h,取出,觀察抑菌效果,并用游標(biāo)卡尺測(cè)量抑菌圈大小。

    2 結(jié) 果

    2.1 TiO2納米管表面形貌觀察

    樣品掃描電鏡觀察結(jié)果(圖1A),可見有序排列的納米管陣列,20 V管徑約為80~120 nm。

    載藥后電鏡結(jié)果(圖1B),可見管口藥物覆蓋。

    圖1 TiO2納米管表面形貌(掃描電鏡,×50 000)Fig 1 Surface form of the TiO2 nanotube(SEM,×50 000)

    2.2 緩釋性能的測(cè)定

    按實(shí)驗(yàn)方法中所述取樣,結(jié)果見表1。

    2.3 抗菌性能測(cè)試

    在金黃色葡萄球菌平板上裝載試件,獲得了清晰明顯的抑菌圈,且10 d后再次測(cè)定,抑菌圈大小基本沒有變化且無細(xì)菌長入,抑菌圈大小約15 mm(圖2)。

    3 討 論

    TiO2納米管制備設(shè)備和工藝簡單,適宜于在形狀復(fù)雜的物體如種植體表面形成涂層[14]。表面的納米管結(jié)構(gòu)可以提高細(xì)胞粘附與增殖[15],從而更好的與皮膚整合,促進(jìn)經(jīng)皮封閉[16-17],納米管結(jié)構(gòu)本身具有一定的藥物裝載能力,同時(shí)也具有一定的抗菌性能。

    表1 緩釋實(shí)驗(yàn)吸光度及累計(jì)釋放百分比Tab 1 Absorbance and cumulated release percent

    圖2 抑菌實(shí)驗(yàn)結(jié)果Fig 2 Diameter of the inhibition zone

    術(shù)后植入物表面不可避免的會(huì)有細(xì)菌定植并形成細(xì)菌生物膜,由于菌膜的存在,生物膜中的細(xì)菌耐藥性更高,常規(guī)抗生素治療通常無法減少術(shù)后種植體周圍感染率[18-19]。理想的方式是在植入體表面構(gòu)建載藥涂層,使藥物從生物膜內(nèi)部緩釋并持續(xù)作用一段時(shí)間,植入體本身雖然有一定的載藥能力,然而其一般沒有控釋能力,難以在術(shù)后一定時(shí)間的高危感染期保持最小抑菌濃度。HHC-36是一種具有廣譜抗菌能力的抗菌肽,已有實(shí)驗(yàn)證明可以有效殺死經(jīng)皮感染中常見的金黃色葡萄球菌及革蘭氏陽性菌[20]。PDLLA作為植入物涂層的緩釋材料,不僅有良好的生物相容性,且機(jī)械穩(wěn)定性良好,具有良好的抗血栓能力[13]。

    經(jīng)皮種植體所處皮膚環(huán)境易于細(xì)菌附著,有證據(jù)表明即使經(jīng)過嚴(yán)格的消毒與感染控制,經(jīng)皮種植手術(shù)之后細(xì)菌侵襲仍然常有發(fā)生,經(jīng)皮部位感染主要由金黃色葡萄球菌,凝固酶陰性葡萄球菌引起[6-7]。抗菌肽是一類非常有前景的生物活性抗菌劑,通常為兩親性陽離子肽,抗菌譜廣,其抗菌機(jī)制主要為使細(xì)菌細(xì)胞膜紊亂、抑制其生物大分子合成與表達(dá)[21]。Menghan等[22]使用真空輔助的物理吸附方法在80 nm管徑的納米管表面構(gòu)建了HHC-36抗菌肽涂層,HHC-36抗菌活性測(cè)試表明其可以有效殺死金黃色葡萄球菌與格蘭氏陽性菌,加載于TiO2納米管表面后周圍細(xì)菌滅殺率達(dá)到99.9%,且可以有效降低4 h后附著與表面的細(xì)菌總數(shù),抗菌肽還有著幾乎不產(chǎn)生耐藥性的特點(diǎn)[23]。

    本實(shí)驗(yàn)在20 V電壓下陽極氧化獲得了管徑為80~120 nm的TiO2納米管試件,并使用了PDLLA作為緩釋劑在TiO2納米管試件表面成功構(gòu)筑了載HHC-36抗菌肽的緩釋涂層,測(cè)定了載藥試件15 d的藥物釋放,獲得表1結(jié)果,除第1~2天有一個(gè)小幅度突釋,后測(cè)試的連續(xù)14 d均有持續(xù)穩(wěn)定的藥物釋放,且15 d藥物釋放比達(dá)到了46%,可以認(rèn)為載藥試件具有良好的緩釋性能。在抑菌圈實(shí)驗(yàn)中可見試件周圍約15 mm左右抑菌圈,且10 d之后測(cè)定抑菌圈大小基本沒有變化,抑菌圈內(nèi)也無細(xì)菌長入,表明所構(gòu)建載藥試件有持續(xù)有效的抗菌作用。

    4 結(jié) 論

    在100 nm管徑TiO2納米管試件表面成功構(gòu)建了以PDLLA為緩釋劑的HHC-36抗菌肽涂層,并測(cè)定了載藥量與緩釋曲線。對(duì)所構(gòu)建載藥試件的抗菌性能做了相關(guān)研究,證明了試件具有良好抗菌性能。

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