犬誘導(dǎo)發(fā)情與超數(shù)排卵試驗(yàn)

趙興旺

（新疆石河子總場獸醫(yī)站，新疆 石河子 832000）

0 前言

同情發(fā)情、超數(shù)排卵、體外受精、胚胎移植、克隆和轉(zhuǎn)基因等技術(shù)，在國內(nèi)外重多科技人員的不懈努力之下取得了突飛猛進(jìn)的發(fā)展和廣泛的應(yīng)用，尤其在牛羊等動物的繁殖和育種方面已經(jīng)獲得明顯的經(jīng)濟(jì)效益。但有關(guān)犬的同情發(fā)情、超數(shù)排卵、胚胎移植、克隆和轉(zhuǎn)基因技術(shù)等方面的研究資料還是比較局限和少見的。

犬屬于非季節(jié)發(fā)情動物，在一年中有2個區(qū)分不太明顯的發(fā)情繁殖季節(jié)，即春季（3～5月）和秋季（9～11月），部分犬在冬、夏季也可發(fā)情。一般每6～7個月發(fā)情1 次，也就是說在一年中可發(fā)情2 次，并可配種，產(chǎn)2 窩仔。獒犬只在秋冬季發(fā)情1 次。犬的發(fā)情周期分為發(fā)情前期（流血期） 、發(fā)情期（配種期）、妊娠期/發(fā)情后期（黃體作用期）和休情期（靜止期、非繁殖期）。發(fā)情前期，生殖器官開始為卵巢排出卵子做準(zhǔn)備，新生的卵泡開始發(fā)育和迅速增長，卵泡中充滿了卵泡液。生殖道上皮開始增生，腺體活動開始加強(qiáng)，分泌物增多，外陰充血，陰戶腫脹，黏膜潮紅濕潤，流出混有血液的粘液，持續(xù)時間5～20 d，平均9 d。發(fā)情期犬發(fā)情征兆明顯，并接受公犬交配，此期的母犬外陰腫脹變軟并出現(xiàn)皺褶，陰道流出的粘液顏色變淡，出血減少或停止，接近和接受交配，持續(xù)時間7～12 d，平均為9 d。妊娠期從卵子受精（最后一次配種）開始計算，為58～63 d，平均為60 d。發(fā)情后期若沒有配種或者配種沒有懷孕，子宮粘膜都要在黃體的作用下發(fā)生增生，子宮壁增厚，為胚胎的發(fā)育做準(zhǔn)備，可持續(xù)30～90 d，平均60 d ，所以犬很容易出現(xiàn)假孕。

本試驗(yàn)是對非發(fā)情非繁殖季節(jié)的母犬從同期發(fā)情（人工誘導(dǎo)發(fā)情）和超數(shù)排卵兩方面進(jìn)行探索性研究，其目的是為了對非繁殖季節(jié)的優(yōu)良犬種（如獒犬）的同期發(fā)情、克隆和胚胎移植奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 試驗(yàn)動物

小型雜種母犬4 只，年齡6月齡左右，體重4～5 kg，購進(jìn)后分籠飼養(yǎng)觀察15 d，無發(fā)情和生殖道疾病，分為2 組，每組2 只進(jìn)行試驗(yàn)。

1.1.2 試驗(yàn)器械和藥品

黃體酮注射液（寧波市三生藥業(yè)有限公司）、氯前列醇注射液（上海市計劃生育科學(xué)研究所）、笨甲酸雌二醇注射液（寧波第二激素廠）、注射用孕馬血清（寧波第二激素廠）、注射用促黃體素釋放激素A3（LHRH-A3：上海市計劃生育科學(xué)研究所）、促卵泡激素釋放激素（FSH：加拿大）、陰道海綿孕酮栓、注射器、生理鹽水、甲醇液、姬姆薩染液、載玻片、手術(shù)刀、手術(shù)剪、止血鉗、腸鉗、持針鉗、縫線、創(chuàng)巾、止血紗布、采胚管、顯微鏡等。

1.2 試驗(yàn)方法與程序

A 組（陰道孕酮海綿栓+笨甲酸雌二醇+促卵泡激素釋放激素（FSH）+氯前列醇+促黃體素釋放激素A3 組）：在第0 天埋置陰道孕酮海綿栓，第13 天撤除陰道海綿栓，第13 天至第16 天每天肌肉注射1 次雌二醇500 μ/kg 和促卵泡素5 mg/kg，第17 天肌肉注射1 次氯前列醇0.1 mg/kg、促卵泡素20 mg/kg 和促黃體釋放激素0.2 μg/kg，第18 天（陰道流血）上午和下午各肌肉注射1 次促卵泡素20 mg/kg 和促黃體釋放激素0.2 μg/kg； 第19 天上午和下午各肌肉注射1 次促卵泡素20 mg/kg 和促黃體釋放激素0.4 μg/kg，第20 天上午和下午各肌肉注射1 次促卵泡素10mg/kg 和促黃體釋放激素0.6 μg/kg，第21 天上午和下午各肌肉注射1 次促卵泡素5 mg/kg 和促黃體釋放激素0.8 μg/kg。第22 天用手術(shù)摘除犬的子宮和卵巢，在體視顯微鏡下收集卵母細(xì)胞。

B 組（黃體酮+ 笨甲酸雌二醇+ 氯前列醇+ 孕馬血清+ 促卵泡激素釋放激素（FSH）組）：在第0～7 天，肌肉注射黃體酮1 mg/kg，第8 天至第13 天肌肉注射黃體酮0.5 mg/kg，第14 天和第16 天肌肉注射1 次雌二醇500 μg/kg 和馬血清25 iu/kg，第17 天肌肉注射1 次氯前列醇、孕馬血清25 iu/kg 和促卵泡素20 mg/kg，第18 天（陰道流血）上午和下午各肌肉注射1 次馬血清25 iu/kg 和促卵泡素20 mg/kg，第19 天上午和下午各肌肉注射1 次孕馬血清30 iu/kg 和卵泡素10 mg/kg。第20 天和第21 天上午和下午各肌肉注射1 次孕馬血清50 iu/kg 和促卵泡素5 mg/kg。第22 天用手術(shù)摘除犬的子宮和卵巢，在體視顯微鏡下收集卵母細(xì)胞。

1.3 陰道分泌物——角化磷狀上皮細(xì)胞的檢查與發(fā)情觀察

試驗(yàn)開始后的第7 天對所有試驗(yàn)?zāi)溉刻煊蒙睇}水浸濕的棉簽，從陰道中旋轉(zhuǎn)粘取陰道分泌物，均勻涂抹在載玻片上，甲醇固定，干燥后姬姆薩染色10～20 min，置顯微鏡下觀察角化磷狀上皮細(xì)胞的數(shù)量。同時觀察臨床發(fā)情情況。

1.4 試驗(yàn)?zāi)溉训氖占?/h3>

同情發(fā)情的第22 天用無菌手術(shù)方法取完整的子宮和卵巢，在試驗(yàn)室觀測子宮和卵巢的形態(tài)變化，然后用滅菌的生理鹽水沖洗子宮，并收集沖洗液，在顯微鏡下觀察和尋找卵細(xì)胞或者將整個卵巢用手術(shù)刀切碎（越碎越好，充分釋放卵細(xì)胞），并收集卵細(xì)胞。

2 結(jié)果與分析

2.1 同情發(fā)情情況

A 組試驗(yàn)犬在試驗(yàn)的第13 天表現(xiàn)為陰唇腫脹，陰門下角懸垂有渾濁的帶有褐色液體小滴，撤除陰道海綿栓并沖洗陰道3 h 后，從陰道中流出大量血樣黏性分泌物，陰道黏膜水腫呈玫瑰紅色，陰道黏膜形成縱向皺褶，觸診整個陰唇發(fā)硬，母犬之間有的相互爬跨，在試情中不愿意接受公犬爬跨，到第16 天陰門腫脹開張，陰道黏膜變?yōu)榈t色，在試情公犬的試情過程中，母犬很愿意接近公犬，表現(xiàn)為后軀高抬，尾巴歪向一側(cè)，露出會陰區(qū)。

B 組試驗(yàn)犬在試驗(yàn)的第13 天表現(xiàn)為陰唇腫脹，并從陰道流出大量血樣黏性分泌物，陰道黏膜水腫呈玫瑰紅色，陰唇腫脹發(fā)硬，陰道黏膜形成縱向皺褶，觸診整個陰唇發(fā)硬，母犬之間有的相互爬跨，在試情中不愿意接受公犬爬跨，此階段可認(rèn)為是發(fā)情前期。到第17 天，試驗(yàn)犬陰門腫脹開張，陰道黏膜變?yōu)榈t色，在試情公犬的試情過程中，母犬很愿意接近公犬，表現(xiàn)為后軀高抬，尾巴歪向一側(cè)，露出會陰區(qū)，此階段可認(rèn)為是發(fā)情前期。

2.2 陰道黏液角化磷狀上皮細(xì)胞的數(shù)量和形態(tài)

A 組和B 組母犬均在試驗(yàn)后的第14 天陰道分泌物中開始有少量的角化磷狀上皮細(xì)胞出現(xiàn)。其中：A1 犬第14 天出現(xiàn)少量的角化磷狀上皮細(xì)胞，維持到第15 天，第16 天所增加，第17 天出現(xiàn)大量的角化磷狀上皮細(xì)胞，持續(xù)維持到第21 天；A2 犬第14天出現(xiàn)少量的角化磷狀上皮細(xì)胞，第15 天有所增加，第16 天出現(xiàn)大量的角化磷狀上皮細(xì)胞，維持到第19 天，第20 天和第21 天，有所減少；B1 犬第14天出現(xiàn)少量的角化磷狀上皮細(xì)胞，維持到第16 天，第17 天有所增加，第18 天出現(xiàn)大量的角化磷狀上皮細(xì)胞，維持到第21 天；B2 犬第14 天出現(xiàn)少量的角化磷狀上皮細(xì)胞，維持到第15 天，第16 天有所增加，第18 天出現(xiàn)大量的角化磷狀上皮細(xì)胞，維持到第21 天（見表1）。

表1 陰道涂片法的鑒定結(jié)果

顯微鏡鏡檢觀察發(fā)現(xiàn)，第14 天陰道中脫落的角化磷狀上皮細(xì)胞角化不完全，細(xì)胞開始形變，輪廓變得扁平而鈍圓，染色顏色較淡，部分細(xì)胞核開始空泡化，有的已經(jīng)消失，可見有數(shù)量較多的紅細(xì)胞；第17天或者第18 天出現(xiàn)大量的角化磷狀上皮細(xì)胞，細(xì)胞角化嚴(yán)重，絕大部分細(xì)胞的細(xì)胞核已經(jīng)消失，而且細(xì)胞體積變大，形狀不規(guī)則。涂片中亦可見微量的紅細(xì)胞。

通過發(fā)情臨床觀察、陰道黏液的角化磷狀上皮細(xì)胞的檢查結(jié)果顯示：A、B 兩組犬均在同期后的第14 天進(jìn)入發(fā)情前期，規(guī)律比較一致。4 只犬進(jìn)入發(fā)情排卵期的時間分別為A1 犬第16 天、A2 犬第17天、B1 犬和B2 犬均為第18 天，A、B 兩組犬進(jìn)入發(fā)情排卵期的時間有一定的差異性，A 組提早于B 組進(jìn)入發(fā)情排卵期。

2.3 犬子宮形態(tài)變化和卵母細(xì)胞回收數(shù)量

對子宮和卵巢進(jìn)行大體解剖和組織形態(tài)學(xué)變化觀察：A 組和B 組的4 只犬均表現(xiàn)為子宮明顯腫脹、光亮，呈粉紅色，子宮切開后子宮壁明顯增后，子宮腔積有少量的稀薄分泌物，黏膜層顯著腫脹，充血，呈淡紅色。切開卵囊包膜，卵巢形狀不規(guī)則，卵巢體積明顯增大，卵巢的表面有大小不一、突出的卵泡，里面充滿淡黃色透明的液體。子宮和輸卵管的沖卵液以及切碎卵巢液的顯微鏡觀察結(jié)果顯示：4 只同期發(fā)情犬均觀察到卵細(xì)胞，所回收的卵細(xì)胞均為卵母細(xì)胞，其中A1 犬140 枚，A2 犬145 枚，B1 犬378 枚，B2 犬480 枚，B 組犬的收集到的卵母細(xì)胞數(shù)量是A 組犬的3 倍，B 組犬超數(shù)排卵效果明顯高于A 組。

3 小結(jié)與討論

雌性動物在正常生殖生理的情況下，1個雌性哺乳動物一生中卵細(xì)胞的數(shù)量在20萬～40萬枚之間，而最終能形成為成熟的卵細(xì)胞并排出的極少，大部分在發(fā)育的不同階段閉鎖消失[1]，這就限制了優(yōu)秀母畜后代數(shù)量的擴(kuò)大。超數(shù)排卵技術(shù)的研究開始于20 世紀(jì)20年代，1927年Smith 和Engle 首先發(fā)現(xiàn)了超數(shù)排卵現(xiàn)象，他們在性成熟的小鼠身上進(jìn)行了垂體前葉組織肌肉埋植試驗(yàn)，結(jié)果從輸卵管收回了60 多個卵子，是正常數(shù)量的4～5 倍。此后不久，Cole 和Hart 發(fā)現(xiàn)了孕馬血清可使未成熟大鼠超數(shù)排卵，從而奠定了超數(shù)排卵技術(shù)的基礎(chǔ)。

生長期的排卵數(shù)由以下因素決定：（1）初級卵泡發(fā)育成生長卵泡的比例；（2）生長卵泡的生長率；（3）生長卵泡的閉鎖率。超數(shù)排卵處理就是增加早期卵泡發(fā)育到高級階段卵泡的數(shù)量，或者降低發(fā)育卵泡的閉鎖率，是一個連續(xù)的動態(tài)過程。這一過程受中樞神經(jīng)系統(tǒng)、垂體前葉和卵巢間激素調(diào)控[2]。超數(shù)排卵處理可改變這一生理過程。常見方法有：（1）降低或消除卵巢對促性腺激素釋放的負(fù)反饋反應(yīng)，主要針對促卵泡素；（2）提高血液中促性腺激素濃度。生產(chǎn)中廣泛采用這一方法。它常與刺激內(nèi)源促性腺激素釋放的方法結(jié)合進(jìn)行。動物對超數(shù)排卵處理的反應(yīng)很不穩(wěn)定：排卵數(shù)、可獲得排卵數(shù)、所獲得的卵子質(zhì)量都很不穩(wěn)定，這種不穩(wěn)定性已成為目前阻礙家畜胚胎移植技術(shù)應(yīng)用而亟待解決的問題。

藥物A 組（陰道孕酮海綿栓+ 笨甲酸雌二醇+促卵泡激素釋放激素+ 氯前列醇+ 促黃體素釋放激素A3 藥物組）和藥物B 組（黃體酮+ 笨甲酸雌二醇+ 氯前列醇+ 孕馬血清+ 促卵泡激素釋放激素），組方雖然有所不同，但從作用機(jī)理方面沒有根本性不同，然而試驗(yàn)結(jié)果有顯著的差異性，尤其在提早發(fā)情排卵和超數(shù)排卵效果方面，B 組明顯好于A 組，究其原因可能與陰道埋置孕酮海綿栓14 d后，會導(dǎo)致陰道分泌物腐敗惡臭和陰道發(fā)炎，繼而引起生殖系統(tǒng)發(fā)生炎癥，減弱了激素對卵巢的作用，影響了超數(shù)排卵效果有關(guān)。

本試驗(yàn)結(jié)果顯示，無論是孕酮陰道海綿栓+ 笨甲酸雌二醇+ 促卵泡激素釋放激素（FSH）+ 氯前列醇+促黃體素釋放激素A3 組（A 組），還是黃體酮+笨甲酸雌二醇+ 氯前列醇+ 孕馬血清+ 促卵泡激素釋放激素（FSH）組（B 組），均能誘導(dǎo)非發(fā)情季節(jié)的非發(fā)情母犬的同期發(fā)情和超數(shù)排卵，同期發(fā)情和超數(shù)排卵效果良好。試驗(yàn)方法和試驗(yàn)結(jié)果可為犬的同期發(fā)情、適時配種、胚胎移植、卵母細(xì)胞的體外培養(yǎng)成熟、克隆胚胎的制作及生產(chǎn)的廣泛深入研究提供參考。