寨卡病毒相關(guān)研究現(xiàn)狀

梁 艷，徐 俊

(1.大連醫(yī)科大學(xué) 第二臨床學(xué)院，遼寧 大連 116044; 2.首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京天壇醫(yī)院 神經(jīng)內(nèi)科，北京 100050)

寨卡病毒(Zika)是一種蟲媒傳播病毒，早在1947年就被人們從烏干達恒河猴體內(nèi)發(fā)現(xiàn)[1]，因其僅引起極少數(shù)的輕微感染病例，而一直未引起人們的重視。直到2015年，巴西等南美洲國家爆發(fā)寨卡疫情期間，因當(dāng)?shù)匦☆^畸形、吉蘭-巴雷綜合征的發(fā)病率顯著增加，使這一沉默了半個多世紀(jì)的古老病毒重新引起了全世界的關(guān)注。隨后，各國學(xué)者致力于寨卡病毒的相關(guān)研究，在證實其嗜神經(jīng)特性的同時不斷發(fā)現(xiàn)潛在的危害。

1 寨卡病毒的基本特征

寨卡病毒與乙型腦炎病毒、登革病毒及西尼羅病毒等屬于黃病毒科黃病毒屬。病毒基因組為一條長約10.8 kb的單股正鏈RNA，其兩端為非編碼區(qū)，中間為可編碼3個結(jié)構(gòu)蛋白(衣殼蛋白C、前體膜蛋白prM、包膜蛋白E)及7個非結(jié)構(gòu)蛋白(NS1、NS2A、NS2B、NS3、NS4A、NS4B、NS5)的開放閱讀框。

寨卡病毒的E蛋白負(fù)責(zé)病毒與感染宿主受體的識別，介導(dǎo)病毒侵入，在后續(xù)藥物及疫苗的研發(fā)中起著重要的作用。并且，寨卡病毒的E蛋白糖基化位點(Asn154)從病毒表面上延伸出來[2]，這種結(jié)構(gòu)特點的發(fā)現(xiàn)可能對解釋寨卡病毒的傳播方式及提供藥物靶點等有一定的幫助。另外，非結(jié)構(gòu)蛋白NS1可以分泌到宿主的血液中，隨著寨卡病毒同時進入蚊蟲體內(nèi)。NS1蛋白通過抑制蚊蟲腸道內(nèi)的免疫屏障輔助寨卡病毒感染蚊蟲。同時有研究發(fā)現(xiàn)，寨卡病毒非結(jié)構(gòu)蛋白NS1上一個氨基酸位點的突變(NS1 A188V)導(dǎo)致NS1蛋白分泌增加，產(chǎn)生更高的NS1蛋白血癥，增強該病毒對蚊蟲的感染性，從而導(dǎo)致蚊蟲的寨卡病毒感染率顯著上升，為近年寨卡病毒的爆發(fā)流行提供了依據(jù)[3]。

2 寨卡病毒的危害

寨卡病毒從1947年4月被發(fā)現(xiàn)到2007年之前，僅在非洲及東南亞地區(qū)出現(xiàn)少量且病情輕微的感染病例。直到2007年4月，寨卡病毒在雅浦(Yap) 島上爆發(fā)導(dǎo)致約73%的居民受到感染，而引起了人們的重視。在這次疫情中，寨卡病毒感染主要表現(xiàn)為皮疹(90%)，發(fā)熱(65%)，關(guān)節(jié)痛(65%)及結(jié)膜炎(55%)等輕微癥狀。雅浦島上寨卡病毒的首次爆發(fā)并無住院或死亡的病例，然而因其傳播速度快范圍廣的特點而引起了人們的重視[4]。

繼雅浦島爆發(fā)寨卡疫情后，2013—2014年，法屬波利尼西亞發(fā)生了一次更大的寨卡病毒爆發(fā)事件，與既往寨卡病毒僅引起發(fā)熱、皮疹等輕微癥狀不同，在此次疫情中，當(dāng)?shù)丶m-巴雷綜合征(GBS)的發(fā)病率顯著上升[5]。據(jù)統(tǒng)計，2013年11月至2014年2月，當(dāng)?shù)貓蟮赖?4例嚴(yán)重的成人神經(jīng)系統(tǒng)疾病中42例為GBS[6]，然而2009-2012年，GBS病例數(shù)僅為5、10、3、3[7]。隨后，Cao-Lormeau等[5]對當(dāng)?shù)卮_診的42名GBS患者進行病例對照研究發(fā)現(xiàn)，98%的(41例)GBS患者中檢測到抗寨卡病毒IgG/IgM抗體，100%的(42例)GBS患者檢測出抗寨卡病毒中性抗體。IgM(93%)的存在以及大多數(shù)患者(88%)在神經(jīng)系統(tǒng)癥狀發(fā)作前6天出現(xiàn)了寨卡病毒感染癥狀，均提示近期存在寨卡病毒感染，首次為寨卡病毒感染與GBS之間的關(guān)系提供了依據(jù)。至此，人們發(fā)現(xiàn)了成人中第一個與寨卡病毒相關(guān)的嚴(yán)重并發(fā)癥。

隨后，寨卡病毒引起了南美洲大部分國家及地區(qū)的疫情爆發(fā)，其中疫情最為嚴(yán)重的巴西，其小頭畸形兒的病例明顯增加。據(jù)統(tǒng)計，2015年11月至2016年2月13日，巴西共報告5280例小頭畸形和/或中樞神經(jīng)系統(tǒng)畸形，其中包括108例死亡病例，然而2010-2014年，小頭畸形的年發(fā)病例數(shù)僅為163例[8]。并且人們發(fā)現(xiàn)，巴西寨卡疫情最嚴(yán)重的3個州小頭畸形發(fā)病率增長也最為顯著[9]。Mlakar等[10]報道1名在巴西工作的孕婦，其在妊娠13周時出現(xiàn)寨卡病毒感染癥狀，并且妊娠29周的超聲檢查提示小頭畸形伴顱內(nèi)及胎盤鈣化。終止妊娠后對胎兒進行尸檢后發(fā)現(xiàn)，胎兒存在小頭畸形外觀，大腦解剖幾乎無完整腦回結(jié)構(gòu)，并且在腦組織中發(fā)現(xiàn)寨卡病毒RNA及病毒顆粒。隨后，人們又陸續(xù)從羊水[11]及胎盤組織中[12]發(fā)現(xiàn)了寨卡病毒，證明寨卡病毒是導(dǎo)致新生兒小頭畸形的直接病因。并且，人們在對小頭畸形兒進行研究時意外的發(fā)現(xiàn)，寨卡病毒不僅與小頭畸形及GBS密切相關(guān)，該病毒還可導(dǎo)致眼部病變。de Paula Freitas等[13]在對29名小頭畸形兒的研究中發(fā)現(xiàn)，其中23名患兒的母親在妊娠期有疑似寨卡病毒感染表現(xiàn)，10名患兒的17只眼睛出現(xiàn)視力問題，其中視網(wǎng)膜局限性色素黃斑和視網(wǎng)膜脈絡(luò)膜萎縮最常見，其次為視神經(jīng)異常、虹膜缺損及晶狀體半脫位。在成人中，寨卡病毒同樣可導(dǎo)致眼部病變，約10%～15%的感染者可出現(xiàn)結(jié)膜炎，也有少數(shù)患者可出現(xiàn)葡萄膜炎[14]。至此，寨卡病毒感染僅導(dǎo)致發(fā)熱、皮疹等輕微癥狀的觀點被徹底顛覆。并且，世界衛(wèi)生組織于2016年2月1日，將寨卡病毒感染相關(guān)小頭畸形等神經(jīng)系統(tǒng)病變宣布為“國際衛(wèi)生緊急事件”。

最近，人們又發(fā)現(xiàn)寨卡病毒可導(dǎo)致睪丸損傷及雄性不育[15]。并在對15名男性寨卡病毒感染者的研究中發(fā)現(xiàn)，病毒感染可導(dǎo)致精子總數(shù)減少、抑制素水平升高及精液特征改變，嚴(yán)重影響生育能力，同時活性精子中檢測到有復(fù)制功能的寨卡病毒，提示寨卡病毒可通過性活動及輔助生殖過程進行傳播，危害人類健康[16]。

至此，寨卡病毒對人類健康的危害被逐漸揭示，從最初僅引起發(fā)熱、皮疹等輕微癥狀，到吉蘭-巴雷綜合癥、小頭畸形等神經(jīng)系統(tǒng)表現(xiàn)。最近的研究又表明寨卡病毒感染者存在睪丸損傷及男性不育的風(fēng)險。然而，寨卡病毒感染對人類健康潛在的危害及其具體的發(fā)病機制仍有待多學(xué)科學(xué)者的進一步研究。

3 病毒感染與并發(fā)癥的因果關(guān)系

受寨卡病毒感染的蚊蟲叮咬皮膚后，病毒通過樹突狀細(xì)胞C型凝集素受體、受體酪氨酸激酶Tyro3以及受體酪氨酸激酶AXL侵入皮膚成纖維細(xì)胞，表皮角質(zhì)細(xì)胞和未成熟的樹突狀細(xì)胞并大量復(fù)制。病毒的復(fù)制激活了抗病毒先天性免疫應(yīng)答并在感染細(xì)胞中產(chǎn)生I型干擾素[17]。并且有研究表明，感染可上調(diào)糖酵解及RNA代謝相關(guān)基因的表達，以增強病毒的復(fù)制[18]。隨后，寨卡病毒擴散到血液及淋巴結(jié)中，其表面的NS1蛋白協(xié)助其穿過血腦屏障、血胎屏障、血眼屏障及血睪屏障[19]，因此寨卡病毒感染出現(xiàn)神經(jīng)系統(tǒng)、生殖系統(tǒng)及眼病等多種癥狀。

寨卡病毒侵入人體后，可靶向神經(jīng)組織產(chǎn)生直接損害作用，并可在星形膠質(zhì)細(xì)胞及神經(jīng)元中復(fù)制[20]，同時分化程度影響神經(jīng)元對寨卡病毒的敏感性，分化程度低、未成熟的神經(jīng)元對寨卡病毒高度敏感[21]。寨卡病毒可優(yōu)先高效感染神經(jīng)祖細(xì)胞，受感染的細(xì)胞可進一步釋放感染性寨卡病毒顆粒擴大感染，并通過增加細(xì)胞死亡及紊亂細(xì)胞周期延緩神經(jīng)祖細(xì)胞的生長[22]，同時寨卡病毒prM蛋白中S139N單氨基酸位點突變可顯著增強其對神經(jīng)祖細(xì)胞的毒性及感染力[23]。寨卡病毒也可靶向皮層祖細(xì)胞，通過細(xì)胞凋亡和自噬誘導(dǎo)細(xì)胞死亡，損害神經(jīng)發(fā)育，導(dǎo)致胎兒宮內(nèi)生長受限[24]。另外，寨卡病毒可通過AXL受體進入神經(jīng)干細(xì)胞，并通過與神經(jīng)RNA結(jié)合蛋白MSI1的相互作用促進病毒的復(fù)制，同時阻礙MSI1與其內(nèi)源性靶點的結(jié)合，導(dǎo)致與神經(jīng)干細(xì)胞功能相關(guān)因子的正常表達受抑制，最終引起神經(jīng)干細(xì)胞的凋亡[25]。寨卡病毒不僅可引起中樞神經(jīng)系統(tǒng)感染，最近科學(xué)家通過小鼠模型發(fā)現(xiàn)，無論是經(jīng)腹腔還是腦室注入寨卡病毒，均可引起周圍神經(jīng)系統(tǒng)的感染，并且寨卡病毒可有效地感染干細(xì)胞來源的人神經(jīng)嵴細(xì)胞及周圍神經(jīng)細(xì)胞，導(dǎo)致細(xì)胞死亡增加，轉(zhuǎn)錄失調(diào)[26]。此外，也有科學(xué)家認(rèn)為寨卡病毒感染所產(chǎn)生的抗體，也可針對與寨卡病毒抗原相似的神經(jīng)組織產(chǎn)生免疫交叉反應(yīng)，從而造成神經(jīng)系統(tǒng)的損傷[27]。

此外，寨卡病毒也可靶向雄性的生殖系統(tǒng)，優(yōu)先感染睪丸中的精原細(xì)胞，初級精母細(xì)胞和支持細(xì)胞，引起細(xì)胞死亡并破壞生精小管，并且睪丸中的支持細(xì)胞、間質(zhì)細(xì)胞及附睪上皮細(xì)胞受到感染后可促進炎性細(xì)胞因子/趨化因子的產(chǎn)生，但并不誘導(dǎo)管周肌樣細(xì)胞及精原細(xì)胞中細(xì)胞因子的產(chǎn)生，表明管周肌樣細(xì)胞及精原細(xì)胞對寨卡病毒更加易感，并可能為寨卡病毒的潛在儲存庫[28]。寨卡病毒感染最終導(dǎo)致雄性小鼠睪丸體積縮小、性激素水平降低、生育能力減弱，并降低雌性小鼠與之交配時的受孕機率，揭示了寨卡病毒對男性的危害，可嚴(yán)重影響生育功能[15]。

除了備受關(guān)注的神經(jīng)系統(tǒng)及生殖系統(tǒng)損傷，研究人員通過小鼠實驗發(fā)現(xiàn)寨卡病毒感染可導(dǎo)致視覺傳導(dǎo)通路中神經(jīng)細(xì)胞的死亡。研究人員通過對小鼠皮下注射寨卡病毒后發(fā)現(xiàn)，小鼠眼部出現(xiàn)結(jié)膜炎及葡萄膜炎，并在接種后第7天的小鼠眼中檢測到有活性的寨卡病毒，從而證明寨卡病毒感染可導(dǎo)致眼部病變，并有可能通過眼淚進行傳播，但寨卡病毒如何侵入并感染眼睛從而導(dǎo)致炎癥的細(xì)胞機制仍有待進一步研究[14]。

4 藥物研發(fā)

針對寨卡病毒感染，尚無特效藥物上市，目前主要以休息、補液等對癥治療為主，可酌情使用解熱鎮(zhèn)痛藥，然而，隨著寨卡病毒對人類健康的危害被逐漸揭示，人們對特效藥物的需求愈發(fā)強烈。目前，關(guān)于藥物的研究主要集中在抗體藥物、小分子化合物及多肽類藥物。

抗體藥物為應(yīng)對突發(fā)傳染病的重要應(yīng)急治療措施，并且科學(xué)家發(fā)現(xiàn)寨卡病毒表面的E蛋白含有誘導(dǎo)機體產(chǎn)生特異性中和抗體的重要表位，為抗體藥物研發(fā)中的重要靶點。研究人員從寨卡病毒感染者體內(nèi)分離出一種人中和抗體(ZIKA-117),其可識別寨卡病毒E蛋白二聚體連接處的抗原表位，從而抑制寨卡病毒活性。ZIKA-117不僅可降低孕鼠血清、腦脊液、胎盤及胎鼠腦組織中病毒RNA的水平，還可降低寨卡病毒感染雄鼠的死亡率，揭示了人中和抗體可阻止寨卡病毒在母嬰間的垂直傳播，并可保護發(fā)育中的胎兒免受寨卡病毒損害[29]。Z23及Z3L1是另外兩種通過結(jié)合寨卡病毒E蛋白D I、D II和D III表位而抑制病毒活性的中和抗體[30]。最近，研究人員又將兩種單克隆抗體(ZKA190和ZKA185)組合成一種雙特異性抗體(FIT-1)，不僅保存了親本抗體抗病毒的廣度和效力，還能有效防止病毒逃逸[31]。目前大量研究證明抗體藥物可有效抑制寨卡病毒感染，但其高成本可能會限制其在發(fā)展中國家的實際應(yīng)用，并且抗體藥物的研發(fā)面臨著抗體依賴性增強效應(yīng)(ADE)的巨大挑戰(zhàn)，如何避免ADE效應(yīng)及降低成本為后續(xù)研究中的關(guān)鍵問題。

利用小分子藥物治療寨卡病毒感染也為目前的熱門研究之一。通過對現(xiàn)有藥物的篩選，科學(xué)家發(fā)現(xiàn)恩利卡生可保護人類大腦皮層祖細(xì)胞免受寨卡病毒感染的損害，氯硝柳胺及細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶抑制劑(如PHA-690509)可有效抑制寨卡病毒的復(fù)制，并且恩利卡生及PHA-690509具有協(xié)同抗病毒作用[32]。隨后，科學(xué)家發(fā)現(xiàn)寨卡病毒的復(fù)制取決于寨卡病毒NS2B-NS3蛋白酶的激活[33]。利用該酶為靶點，又發(fā)現(xiàn)3種已經(jīng)上市的藥物(替莫泊芬、氯硝柳胺、硝唑尼特)能有效地抑制NS2B-NS3蛋白酶活性，其中替莫泊芬的效果最為明顯，不僅能在人類胎盤和神經(jīng)祖細(xì)胞中抑制寨卡病毒的復(fù)制，并可抑制寨卡病毒誘導(dǎo)的病毒血癥及降低死亡率[34]。另外，具有抑制登革熱病毒活性的芬維A胺可顯著并迅速抑制寨卡病毒RNA的合成，從而對抗寨卡病毒[35]。2017年3月，我國科學(xué)家發(fā)現(xiàn)寨卡病毒感染可顯著上調(diào)細(xì)胞內(nèi)膽固醇-25-羥化酶的表達水平，其酶促產(chǎn)物25-羥基膽固醇可阻斷寨卡病毒進入細(xì)胞，抑制寨卡病毒復(fù)制并避免小頭畸形的發(fā)生[36]。目前已發(fā)現(xiàn)數(shù)種具有抗寨卡病毒作用的小分子化合物，但它們之間似乎并無抗病毒作用的共同機制可尋。這些小分子化合物具有獲取相對容易，成本低的優(yōu)點，但如何安全有效的保護孕婦，為小分子藥物研發(fā)的巨大挑戰(zhàn)。若能從已批準(zhǔn)用于孕婦的藥物中篩選出抗寨卡病毒藥物，則可加速治療藥物的問世。

目前，利用現(xiàn)代生物技術(shù)合成的多肽藥物因其安全性高且成本低的優(yōu)勢，成為寨卡病毒治療藥物研究的新興方向。2017年7月，我國科學(xué)家設(shè)計并合成了一種由寨卡病毒E蛋白莖區(qū)衍生的合成肽(Z2)。Z2可與寨卡病毒的E蛋白結(jié)合，破壞病毒包膜完整性并釋放病毒基因組RNA，最終滅活寨卡病毒顆粒。并且，Z2可穿透胎盤屏障進入胎兒體內(nèi)，不僅降低了寨卡病毒感染孕鼠血清中的病毒滴度及胎盤中病毒RNA載量，還能顯著降低胎兒的感染率。此外，多肽藥物對孕鼠及胎鼠均表現(xiàn)出較好的安全性[37]。多肽類藥物的安全性高，成本低，可通過胎盤屏障及血睪屏障，尤其適用于寨卡病毒感染的高危人群—孕婦。

另外，三型干擾素(IFN-λ)[38]及干擾素誘導(dǎo)的跨膜蛋白(IFITM1及IFITM3)[39]同樣具有抗寨卡病毒的作用。然而，這些藥物能否成功上市仍需大量的臨床試驗進行驗證。

5 預(yù)防性疫苗的研發(fā)

除了開發(fā)特效藥物治療急性寨卡病毒感染，加快預(yù)防性疫苗的上市是一種長期應(yīng)對寨卡病毒感染及預(yù)防復(fù)燃的重要手段。目前，針對寨卡病毒的疫苗，主要包括傳統(tǒng)的滅活疫苗以及新興的DAN疫苗、RAN疫苗等。

滅活疫苗是一種傳統(tǒng)的疫苗形式，寨卡病毒滅活疫苗(ZPIV)在先前的動物實驗中已經(jīng)證實可有效的保護小鼠及非人靈長類動物免受寨卡病毒感染[40]。最近的3項臨床I期試驗結(jié)果顯示,92%接種ZPIV疫苗的受試者在第二次注射后檢測出針對性抗體，并且受試者血清中的抗體可有效保護小鼠抵抗寨卡病毒感染，試驗中該疫苗在人體內(nèi)表現(xiàn)出良好的耐受性及安全性[41]。該試驗表明，開發(fā)ZPIV疫苗控制寨卡疫情是不難實現(xiàn)的。此外，由美國國家過敏性及傳染性研究所研發(fā)的兩種由質(zhì)粒介導(dǎo)的DNA疫苗(VRC5288和VRC5283)也已經(jīng)進入臨床I期試驗，對最后一次接種4周后的血樣分析發(fā)現(xiàn)，60%～89%接種VRC5288的受試者及77%～100%接種VRC5283的受試者均產(chǎn)生了中和抗體應(yīng)答，受試者除了有局部壓痛及發(fā)紅等輕微反應(yīng)外，該疫苗在該兩項試驗中均具有良好的安全性及耐受性[42]。GLS-5700是由美國Inovio制藥公司研發(fā)的可表達寨卡病毒prM-E蛋白的另一種DNA疫苗，其I期臨床試驗結(jié)果同樣顯示寨卡病毒DNA疫苗可保護人體免受寨卡病毒感染，并且安全性良好[43]。除了目前進展較迅速的寨卡病毒滅活疫苗及DNA疫苗外，新型mRNA疫苗也是一種前景可觀的備選方案。Pardi等[44]研發(fā)了一種經(jīng)脂質(zhì)納米顆粒包裹的可編碼寨卡病毒prM-E蛋白的mRNA疫苗，并進行動物實驗。結(jié)果顯示，僅接種30 μg該疫苗，2周后就可保護小鼠免受寨卡病毒感染，并且5個月后仍有效。接種50 μg該疫苗的獼猴，會在5周后為其提供保護。該研究表明，單一低劑量的mRNA疫苗，即可誘導(dǎo)出有效而持久的中和抗體反應(yīng)。隨后，Richner等[45]對mRNA疫苗進一步改進，破壞了E蛋白中保守的融合環(huán)表位。改良的mRNA疫苗不僅可強有力地保護機體抵抗寨卡病毒感染，同時“融合環(huán)”的突變有效地減少了增強登革熱感染的交叉反應(yīng)性抗體的產(chǎn)生。mRNA疫苗除了具有強大持久的免疫效應(yīng)外，其較DNA疫苗最大的優(yōu)點是，mRNA疫苗不進入細(xì)胞核，因此可避免同人類基因組整合所帶來的突變及致癌的風(fēng)險，有望在各類疫苗的研發(fā)中脫穎而出。目前，已有多種類型的疫苗通過動物實驗或臨床試驗證實了其安全性及免疫原性，促進了預(yù)防性疫苗的實際應(yīng)用。

然而，如何有效地避免寨卡病毒與其他黃病毒之間的原始抗原效應(yīng)(OAS)及抗體依賴性增強效應(yīng)(ADE)是疫苗研發(fā)過程中的巨大挑戰(zhàn)。此外，寨卡病毒感染人體后所產(chǎn)生的抗體，可能針對與寨卡病毒抗原相似的神經(jīng)組織抗原發(fā)生免疫交叉反應(yīng)，從而導(dǎo)致神經(jīng)系統(tǒng)的損傷[27]，因此疫苗研發(fā)過程中應(yīng)密切關(guān)注其潛在的神經(jīng)系統(tǒng)不良反應(yīng)。

6 總 結(jié)

2016年11月18日，世界衛(wèi)生組織在瑞士召開會議，宣布寨卡病毒及其并發(fā)癥在短時間內(nèi)不會消除，寨卡疫情已不再是國際關(guān)注的突發(fā)公共衛(wèi)生事件，而是需要采取長期策略加以應(yīng)對的持續(xù)挑戰(zhàn)。我國自2016年2月9日確診首例輸入性寨卡病毒感染病例以來，不斷有新發(fā)輸入性病例的報道，并且南方部分城市存在寨卡病毒的傳播媒介—埃及伊蚊及白紋伊蚊，應(yīng)嚴(yán)防寨卡病毒在我國本土的爆發(fā)。雖然，絕大多數(shù)寨卡病毒感染者為隱性感染，但有些病例可出現(xiàn)嚴(yán)重的并發(fā)癥，如小頭畸形、吉蘭—巴雷綜合征、睪丸損傷及眼病等。目前，尚無防治寨卡病毒的特效藥物及疫苗上市。針對寨卡病毒感染，臨床上主要采取對癥治療，包括補液及臥床休息等，可酌情使用解熱鎮(zhèn)痛藥。為防止寨卡病毒給我國及其他遭受寨卡病毒威脅的國家所帶來的不良影響，各國政府除了應(yīng)做好寨卡病毒的健康知識宣傳，加強疾病的預(yù)防控制外，還需不斷推進寨卡病毒特效藥物及疫苗的研發(fā)。

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