液晶傳感競爭免疫法檢測天蠶素B

蘇秀霞， 張　姣， 欒崇林， 霍文靜，徐　佳

(1.陜西科技大學 化學與化工學院 教育部輕化工助劑化學與技術重點實驗室， 陜西 西安　710021; 2.深圳職業(yè)技術學院 應用化學與生物技術學院, 廣東 深圳　518088)

0　引言

液晶(LCs)兼具液體的流動性和固體的光學各向異性[1]，表面微小的地貌和化學結構變化即會引起處于向列相的液晶分子的取向變化[2]，進而引起液晶膜顏色和亮度的變化.1998年，Abbot小組[3]首次以液晶作為“敏感元件”，基于構建金膜法將基底表面發(fā)生的蛋白質結合事件轉換為光學圖像信號檢測抗生物素蛋白(Av)，這種液晶生物傳感技術具有低耗、快速、無需標記，所呈現的光學信號肉眼可觀等優(yōu)點，在非標記生物傳感檢測方面具有潛在應用價值，已經實現了對酪氨酸[4]、膽固醇[5]、多肽[6]、蛋白質[7]、核酸[8]、Hg2+[9]等的檢測.

天蠶素B(CB)是人類1980年從惜古比天蠶體內發(fā)現的第一個抗菌肽[10]，對革蘭氏陽性菌[11]、革蘭氏陰性菌[12]、真菌[13]、癌細胞[14]、病毒[15]均有抑殺作用，其在動植物抗病基因工程[16,17]、植物育種[18]、生物飼料添加劑[19]等領域有著巨大的潛在應用價值.現有多肽的檢測方法主要有液相色譜-質譜法[20]、毛細管電泳法[21]和免疫分析法[22]等.然而，以上方法樣品預處理繁瑣，有的還需要衍生化，對抗原抗體進行標記，耗時長、成本高，且對操作人員要求高，應用受限，因此，高靈敏性、特異性、非標記、低成本的多肽檢測方法的研究迫在眉睫.

本文結合液晶生物傳感器無需標記等優(yōu)點，利用競爭免疫法，通過在玻璃基底表面修飾自組裝膜誘導液晶分子垂直均一取向，觀察天蠶素B抗體(anti-CB)與天蠶素B結合前后液晶膜顏色和亮度的變化，并通過計算偏光顯微鏡成像灰度強度定量化分析天蠶素B濃度，構建了一種非標記、高靈敏、特異性的天蠶素B液晶生物傳感器.

1　實驗部分

1.1　試劑與儀器

(1)主要試劑：二甲基十八烷基[3-(三甲氧基硅基)丙基]氯化銨(DMOAP)、3-氨丙基三乙氧基硅烷(APTES)、天蠶素B均購自美國Sigma-Aldrich公司；天蠶素B抗體購自英國Abcam公司；4-氰基-4-戊基聯(lián)苯(5CB)購自美國Instec公司；戊二醛(GA)購自國藥集團化學試劑有限公司；其余試劑均為分析純.

(2)主要儀器：XPL3230型透反兩用數碼偏光顯微鏡(上海光學儀器一廠)；SPI3800N/SPA400型原子力顯微鏡(日本精工有限公司)；OCA20視頻光學接觸角(德國dataphysics公司)；玻片(江蘇飛舟玻塑有限公司)；Mylar聚酯片(廣州市斯朗特電子科技有限公司).

1.2　玻片預處理

將玻片切割成2 cm×2 cm，用熱的Piranha溶液[V(H2O2)∶V(H2SO4)]=3∶7于80 ℃浸泡1 h，依次用超純水和乙醇清洗干凈，經N2吹干，于110 ℃干燥3 h，防塵備用.

1.3　上下玻片的自組裝

上玻片的DMOAP自組裝：將清洗干凈的玻片浸入0.2%(v/v)的DMOAP水溶液中，常溫下靜置半小時，超純水沖洗干凈，N2吹干，于110 ℃干燥1 h，防塵備用.

下玻片的APTES/DMOAP混合自組裝：將清洗干凈的玻片浸入3%(v/v)APTES和1%(v/v)DMOAP的10 mmol/L的醋酸-醋酸鈉溶液中(pH=5)，于80 ℃恒溫2 h，超純水沖洗干凈，N2吹干，于110 ℃干燥1 h，然后浸入1%(v/v)的GA溶液中37 ℃反應1 h，取出后用大量超純水沖洗，N2吹干,防塵備用.

1.4　天蠶素B的固定

將天蠶素B溶解于0.01 mol/L的PBS緩沖液中(pH=7.4)，配置成不同濃度的天蠶素B溶液.取適量的天蠶素B溶液滴加至下玻片表面，于37 ℃反應2 h，取出后分別用0.01 mol/L的PBS緩沖液(pH=7.4)和超純水沖洗，除去未固定的天蠶素B分子，N2吹干,置于-20 ℃下冷凍保存.

1.5　液晶池的制作

將處理后的上下玻片面對面組裝，玻片之間用Mylar聚酯片(中間開凸型空腔)隔開，除開孔方向外，其他三邊用小夾子固定.將液晶5CB于40 ℃恒溫箱中加熱約10 min，使其從渾濁液晶態(tài)變?yōu)槌吻逋噶恋囊簯B(tài)，取少許液晶從開孔處利用毛細管作用力注入液晶池內，待液晶布滿整個空腔，停止加熱，使液晶池緩慢冷卻至室溫(25 ℃)后利用偏光顯微鏡觀察.

1.6　檢測方法

根據競爭免疫法，將一定濃度的天蠶素B抗體溶液與不同濃度的待測天蠶素B抗原溶液于37 ℃恒溫混勻10 min，取適量混合后溶液依次滴加至固定有天蠶素B抗原的玻片上，37 ℃反應1 h，抗原抗體即可實現競爭免疫反應，分別用0.01 mol/L的PBS緩沖液(pH=7.4)和超純水沖洗，除去非特異性吸附物質，N2吹干.按照1.5節(jié)方法制備成液晶池，使用偏光顯微鏡觀察液晶膜顏色和亮度變化并采集圖像分析，通過Adobe Photoshop CS5 軟件計算偏光顯微鏡成像灰度強度.

2　結果與討論

2.1　液晶生物傳感器的檢測原理

本文的檢測原理如圖1所示，在下玻片表面修飾APTES/DMOAP混合自組裝膜(如圖1(b)所示)，DMOAP用于誘導液晶分子垂直均一取向，APTES中的氨基與GA中的一個醛基反應后作為功能分子固定天蠶素B(如圖1(c)所示).當依次滴加一定濃度的天蠶素B抗體溶液與不同濃度的待測天蠶素B抗原溶液后，此時玻片上已固定的天蠶素B與待測天蠶素B競爭結合抗體上有限的反應位點(如圖1(d)所示)，基底固定的天蠶素B與天蠶素B抗體特異性結合后，由于抗體分子具有一定的空間立體結構以及分子尺寸效應，能夠擾亂液晶5CB分子的取向，使其呈傾斜或近平行排列，隨著樣品中待測天蠶素B濃度的變化，結合到基底的天蠶素B抗體量也隨之變化，進而使液晶膜的顏色和亮度發(fā)生變化(如圖1(e)所示)實現對天蠶素B的特異性檢測.當不含天蠶素B抗體時，由于液晶5CB分子呈垂直均一的取向因而不具有雙折射,不能使偏振光透過，光學成像為均一黑色圖案(如圖1(f)所示).

2.2基底表面APTES/DMOAP/GA自組裝膜比例優(yōu)化

已有研究表明，基底自組裝膜的化學結構與液晶膜的有效雙折射(Δneff)直接相關，進而影響其光學成像[23]，因此液晶生物傳感器的基底修飾對生物分子的檢測至關重要.本文采取APTES與DMOAP混合自組裝法構建基底敏感膜，DMOAP中的長鏈烷基鏈能夠誘導液晶分子沿長鏈方向取向，呈垂直排列，此時偏振光不能透過液晶池，光學圖像為均一的黑色圖案.APTES中的氨基與GA中的一個醛基反應后作為功能分子固定生物分子，由于APTES為短鏈烷基，不能有效的誘導液晶分子垂直排列，偏光顯微鏡成像會產生背景干擾，因此，需要探究APTES與DMOAP比例對液晶取向的影響，確定最優(yōu)比例，在此基礎上，進一步確定GA最優(yōu)含量.

(a)裸玻片 (b)DMOAP/APTES/GA基底自組裝膜 (c)天蠶素B的固定 (d)天蠶素B抗體與天蠶素B特異性結合 (e)天蠶素B抗體與天蠶素B特異性結合后液晶5CB分子為傾斜排列 (f)未加入天蠶素B抗體時液晶5CB分子為垂直排列圖1　液晶生物傳感器檢測天蠶素B示意圖及液晶池的組裝過程

從圖2可以看出，當APTES與DMOAP比例較高時(25∶1，如圖2(a)所示)，由于DMOAP含量較少，不能有效誘導液晶分子垂直排列，光學成像中亮斑大且多，隨著APTES與DMOAP比例減小，光學成像中亮斑逐漸減少，當兩者比例為5∶1和3∶1時，光學成像均為均一黑色圖案，不會干擾生物分子的檢測，因此，選取APTES與DMOAP比例為5∶1和3∶1，進一步探討GA含量對液晶取向的影響.

(a)25∶1　　　　　　　(b)10∶1

(c)5∶1　　　　　　　(d)3∶1圖2　不同體積比的APTES/DMOAP基底自組裝膜制備的液晶池光學成像

GA含量決定基底表面醛基密度，當GA含量為2.5%(v/v)時，APTES與DMOAP比例為5∶1(如圖3(a)所示)和3∶1(如圖3(b)所示)光學成像中出現均勻分布的較大彩色亮斑.當GA含量減少到1%(v/v)時，圖像中亮斑減少，APTES與DMOAP為5∶1時(如圖3(c)所示)，亮斑呈星點分布，而當兩者比例為3∶1時(如圖3(d)所示)，圖案呈現全黑背景，不干擾生物分子檢測，因此實驗最佳比例為APTES與DMOAP體積比為3∶1，GA含量為1%(v/v).

(a)APTES/DMOAP為5∶1,GA含量為2.5%(v/v)　(b)APTES/DMOAP為3∶1,GA含量為2.5%(v/v)　(c)APTES/DMOAP為5∶1,GA含量為1%(v/v)　(d)APTES/DMOAP為3∶1,GA含量為1%(v/v)圖3　GA含量對液晶池光學成像的影響

2.3　固定化天蠶素B抗原濃度的優(yōu)化

液晶分子的取向對基底表面地貌變化非常敏感，天蠶素B與GA交聯(lián)固定到基底表面后，會在一定程度上改變表面地貌結構從而影響液晶分子的取向，因此需要考察固定化天蠶素B濃度對液晶池光學成像的影響.結果如圖4所示，當天蠶素B濃度較高時(500 ng/mL)，對液晶分子取向擾亂程度較大，光學成像中有較大的彩色亮斑出現(如圖4(a)所示)，背景值較高，干擾后續(xù)檢測.隨著固定化天蠶素B抗原濃度的減小，對液晶分子取向擾亂減小，液晶池光學成像逐漸變暗，當固定化抗原濃度為150 ng/mL、100 ng/mL、80 ng/mL時，光學成像中只有少數星點亮斑，趨近于全黑背景(如圖4(d)、(e)、(f)所示)，由于需要足夠的抗原與抗體反應，因此選擇能夠使光學成像背景保持黑暗的最高固定化天蠶素B濃度150 ng/mL固定于基底表面.

(a)500 ng/mL　　　　(b)250 ng/mL

(c)200 ng/mL　　　　(d)150 ng/mL

(e)100 ng/mL　　　　(f)80 ng/mL圖4　不同濃度的固定化天蠶素B制備的液晶池光學成像

2.4　天蠶素B抗體濃度的優(yōu)化

進一步考察天蠶素B抗體濃度對液晶池光學成像的影響.如圖5所示，在樣品中不含待測天蠶素B抗原的條件下，天蠶素B抗體濃度為1 000、500 ng/mL時(如圖5(a)、(b)所示)，偏光顯微鏡成像中有彩色亮斑出現，當天蠶素B抗體濃度為300、150、75 ng/mL時，偏光顯微鏡成像只有少數亮點趨近于全黑背景(如圖5(c)、(d)、(e)所示).在后續(xù)檢測中，基底已固定天蠶素B會與待測天蠶素B競爭結合天蠶素B抗體上有限的反應位點，當待測天蠶素B濃度趨于0時(檢測限無限低)，天蠶素B抗體最大限度地與基底已固定天蠶素B結合擾亂液晶分子取向，使液晶池光學成像產生亮斑.隨著待測天蠶素B濃度的增加，與基底已固定天蠶素B結合的天蠶素B抗體隨之減小，光學成像由亮變暗，從而實現對天蠶素B的檢測.由于樣品中待測天蠶素B含量較低，基于競爭免疫反應產生的信號變化非常小，較大濃度的天蠶素B抗體會影響檢測限，因此選擇能夠使光學成像出現亮斑的最低天蠶素B抗體濃度500 ng/mL進行后續(xù)檢測.

(a)1 000 ng/mL　　　　　(b)500 ng/mL

(c)300 ng/mL　　　　　　(d)150 ng/mL

(e)75 ng/mL圖5　不同濃度的天蠶素B抗體制備的液晶池光學成像

2.5　天蠶素B的檢測

基于競爭免疫原理，在一定濃度范圍內，待測天蠶素B的濃度越低，結合到基底玻片表面的天蠶素B抗體分子越多，圖像越亮；反之，待測天蠶素B濃度越高，結合到基底玻片表面的天蠶素B抗體分子越少，圖像趨于全黑.如圖6所示，當待測天蠶素B含量超過0.1 ng/mL時，光學信號出現明顯變化.

(a)0 ng/mL　　　　(b)0.01 ng/mL

(c)0.1 ng/mL　　　(d)1 ng/mL

(e)10 ng/mL　　　　(f)100 ng/mL圖6　不同濃度的待測天蠶素B制備的液晶池光學成像

2.6　天蠶素B濃度定量分析

以上方法能夠實現對天蠶素B的定性檢測.為了進一步定量化檢測天蠶素B濃度，探究了圖6中偏光顯微鏡成像灰度強度值與天蠶素濃度之間的相關性.如圖7所示，隨著天蠶素B濃度的增加，偏光顯微鏡成像灰度值逐漸減小，當天蠶素B濃度大于10 ng/mL時，灰度強度值趨于0.天蠶素B濃度在0.01～0.1 ng/mL范圍內時，偏光顯微鏡成像灰度強度值與天蠶素B濃度之間具有線性關系，相關系數為0.985 2.液晶生物傳感器傳感器能夠使天蠶素B的檢測限低至0.01 ng/mL.

圖7　偏光顯微鏡成像灰度強度與天蠶素B濃度關系(插圖：天蠶素B濃度在0.01～0.1 ng/mL范圍內與偏光顯微鏡灰度強度之間為線性關系.誤差線為每個濃度進行四次測量后的標準偏差.)

3　結論

(1) 硅烷化試劑自組裝膜法構建的基底敏感膜能夠很好的誘導液晶分子垂直取向，偏光顯微鏡觀測結果表明：APTES與DMOAP體積比為3∶1，GA含量為1%時(v/v)，光學成像為均一黑色圖案，不干擾后續(xù)檢測.

(2) 基于競爭免疫原理，固定化天蠶素B濃度為150 ng/mL時光學成像為黑色圖案，天蠶素B抗體濃度為500 ng/mL時，光學成像中有彩色亮斑出現，以此為基礎進一步檢測待測天蠶素B.

(3) 液晶生物傳感器可在0.01～0.1 ng/mL線性范圍內實現對天蠶素B的非標記、高靈敏性、特異性檢測，檢測低至0.01 ng/mL.

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