宮頸癌患者三維能量多普勒超聲下血流情況與HPV分型的相關性研究

孫海婷，王瑩瑩，項小苗，陸敏莉

血管生成是宮頸癌的浸潤、生長及遠處轉移的重要原因之一。關于宮頸癌血管生成及如何對其抑制是治療宮頸癌的重要出路，因此一直是研究的熱點。超聲是目前無創(chuàng)評估血流的常用方法，具有便宜、快捷、易操作和可重復多次實施等特點；三維能量多普勒（3D-CPA）屬于定量分析方法，可準確分析和計算宮頸內血流的分布，是既無創(chuàng)且可靠的新方法之一。本研究采用3D-CPA技術檢測血管指數(shù)（VI）和血管分級[1]。有文獻報道，隨著高危型人類乳頭瘤病毒（HRHPV）負荷量增加，宮頸高度上皮內瘤變（CIN）和宮頸癌的發(fā)生率明顯高于負荷量低的HR-HPV患者[2]。研究發(fā)現(xiàn)HPV E6促進血管內皮生長因子（VEGF）的過度表達，從而促進宮頸癌的轉移和浸潤[3]。VEGF是近年發(fā)現(xiàn)的與腫瘤血管形成有關的最強的促腫瘤血管生成的分子之一，也與宮頸癌的發(fā)生發(fā)展息息相關[4]。VEGF一直被認為與血管生成相關，HPV E6可促進VEGF的表達，高危型HPV是否也通過相同的通路刺激血管的生成？本文旨在對此問題進行研究，為今后宮頸癌的診療提供依據?，F(xiàn)將結果報道如下。

1　資料與方法

1.1一般資料 選擇寧波市象山縣第一人民醫(yī)院2015年6月至2017年6月于本院住院的宮頸癌患者98例，采用原位 PCR雜交和免疫組織化學法檢測HPV16/18感染，根據檢測結果將病例分為 4組，僅 HPV16陽性為 32例為HPV16組；僅 HPV18陽性為25例為HPV18組；HPV16和18均陽性18例為HPV16+18組；兩者皆陰性、且低危型HPV陽性為對照組共23例。納入標準：經陰道鏡取材活檢證實為宮頸癌患者、未接受放療及化療等干預、3D-CAP檢查后1個月內接受手術切除術；排除標準：患者正參與另外一項藥物或醫(yī)療器械臨床試驗、不能配合檢查的神經障礙或其他嚴重疾病患者、具有任何需要急救的緊急醫(yī)療狀況。各組宮頸癌國際婦產科聯(lián)盟（FIGO）[5]臨床分期及病理類型的構成比差異均無統(tǒng)計學意義（均＞0.05），見表 1。

1.23D-CPA檢測 對各組研究對象行經陰道宮頸三維超聲（PHILIPS iu22超聲診斷儀）成像，采用QLAB軟件分析宮頸的體積。啟動能量多普勒（CPA）檢測技術，對宮頸的血管進行三維成像，檢測過程中對宮頸進行動態(tài)旋轉，已達到充分顯示血管分支和立體走行的效果。參考文獻[6]對三維成像顯示出的宮頸血管進行分級，其中0級：宮頸周邊及內部未見血流信號；I級：宮頸周邊可見短條狀或點狀分布的血管，宮頸內未見無血管分布；Ⅱ級：除宮頸周圍可見血管，宮頸內部也可存在稀疏的血管分布，走行較平直分支簡單；Ⅲ級：子宮頸內可見密集的血管網和/或血管樹，走行扭曲、分支復雜且不規(guī)則。軟件計數(shù)宮頸中的血管總數(shù)以及其與宮頸體積的比值即單位宮頸體積的血管條數(shù)，此比值為血管指數(shù)（VI），它可體現(xiàn)宮頸血供情況。血管數(shù)量由3位有經驗的超聲科醫(yī)生分別計數(shù)3次，取平均值作為最終值。

1.3免疫組化染色 手術切除術后選取各組研究對象的宮頸部位的組織切片，采用鏈霉素抗生物素蛋白-過氧化酶（S-P）免疫組化法染色。一抗為鼠抗人VEGF單克隆抗體和CD34單克隆抗體，操作按照抗體說明書操作。

1.4微血管密度（MVD）的計數(shù)CD34可標記血管內皮細胞，呈棕黃色染色為陽性。癌細胞的間質內存在孤立的棕黃色血管腔面積小于8個紅細胞、血管內皮細胞或細胞簇，且無肌層管壁者為1條獨立的微血管。病理醫(yī)生在低倍鏡下（×200）（Olympus生物顯微鏡）下檢查微血管的染色情況，取3個癌巢最多間質血管視野作為血管熱點區(qū)，高倍視野下（×400）計數(shù)每個區(qū)域的MVD，平均值記為該例腫瘤的MVD值。

1.5VEGF陽性判定 VEGF主要位于細胞質，腫瘤細胞胞質中出現(xiàn)棕黃色顆粒定義為陽性細胞。選擇5個高倍視野下計數(shù)腫瘤總細胞數(shù)和陽性細胞的個數(shù)，陽性細胞/腫瘤總細胞數(shù)得出陽性細胞百分率，陽性細胞數(shù)≤5%為0分，6%～25%為1分，26%～50%為2分，51%～75%為3分，＞75%為4分；無特異性染色為0分，染色強度黃色為1分，棕黃色為2分，棕褐色為3分；兩者積分相乘，0～1分為陰性（－），2～4分為弱陽性（+），5～8分為中度陽性（2+），9～12分為強陽性（3+）。

1.6HPV檢測 采用深圳亞能生物技術公司提供的 PCR-反向點雜交法能夠檢測5種低危亞型（HPV6、11、42、43、44）和 18種高危亞型（HPV16、18、33、35、31、39、45、51、52、53、56、58、59、66、68、73、84、MM4），此檢測法可檢出HPV的最小拷貝數(shù)為1.0×103copies/ml，結果按芯片上相應著色位點分布判讀出HPV亞型。

1.7觀察指標 3D-CPA檢測下的血管分級及病理下的MVD、VI及VEGF陽性細胞計數(shù)。

1.8統(tǒng)計方法 采用SPSS 19.0統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計學分析，計量資料采用均數(shù)±標準差，多組內比較采用檢驗，多組間兩兩比較采用LSD-檢驗；計數(shù)資料采用2檢驗＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2　結果

2.14組VEGF表達比較 4組VEGF陽性率差異有統(tǒng)計學意義（2=13.82，＜0.05），其中對照組明顯低于HPV16組、HPV18組及HPV16+18組（2=4.02、5.60、13.24 均＜0.05）。見表2。

表1　各組臨床分期及病理類型的構成比比較 例

2.2血管分級下 HPV感染亞型比例趨勢分析 所有病例無0級血流，對照組I級比例明顯高于 HPV陽性各組（2=10.29、10.50、6.71，均＜ 0.05）。對照組III級比例明顯低于HPV陽性各組（2=6.15、6.27、2.51，均＜ 0.05），II級血流比例比較差異均無統(tǒng)計學意義（2=1.04、0.64、0.24，均＞0.05）。見表3。

2.34組 MVD值及 VI值比較 4組MVD值和 VI值差異均有統(tǒng)計學意義（均＜0.05），其中對照MVD值和VI值明顯低于 HPV16組、HPV18組和HPV16+18組（均＜0.05）。見表4。

3　討論

高危型HPV16/18感染一直被認為與宮頸癌的發(fā)病密切相關，其與宮頸癌腫瘤MVD及三維超聲下VI的關系的研究報道較少。有人在研究胡蘿卜素對血管形成的作用中同時發(fā)現(xiàn)，用帶HPV16/18基因組的宮頸癌細胞株Skvt和Hela注入裸鼠皮下，腫瘤血管形成的能力明顯高于HPV16/18基因的細胞株細胞[7]。在研究14-HPV16轉基因小鼠的過程中發(fā)現(xiàn)，微血管計數(shù)、VEGF mRNA（VEGFmRNA）表達量與 E6/E7mRNA的表達量呈正相關，因此推測HPV16/18病毒感染可以上調VEGF，從而促進腫瘤的浸潤轉移[8]。國內研究結果顯示，在原位癌和浸潤癌中，HPV16/18感染率增加與 MVD間無明顯相關，提示高危型HPV16/18病毒在宮頸癌的微血管的生成可能并非起直接作用[9]。本研究其中一部分重復了類似的試驗，且結果顯示高危型HPV16/18感染的宮頸癌患者，MVD與VEGF表達水平均明顯高于低危型感染者，與過去研究結果有差異，具體原因需要進一步從信號通路上進行探討。

研究證實，CIN發(fā)展成宮頸浸潤癌的過程中，均存在不同程度血管生成，隨著病變惡化，病變中的MVD及多種血管生成誘導因子如 VEGF表達顯著增加，后者表達水平與預后密切相關[7,10]。3D-CPA將多普勒信號與空間定位相結合，從三維方式的角度立體呈現(xiàn)臟器及病灶內處的血流分布。三維能量多普勒定量分析法為分析和準確計算宮頸病灶內外的血流分布提供了一個無創(chuàng)的新方法。VI是宮頸單位體積內的血管數(shù)量，可直觀呈現(xiàn)腫瘤血供情況的重要指數(shù)。區(qū)域VI值越高，代表區(qū)域的新生血管越密集[11-12]。有研究發(fā)現(xiàn)宮頸癌、CIN及正?；颊叩膶m頸VI值存在顯著差異，VI用于診斷宮頸癌的AUC為0.848，可見VI不僅僅是體評估腫瘤血管新生的好工具，同時也是良惡性判斷的有效指標[13]。本研究嘗試使用3D-CPA對研究對象的病灶血流進行分析結合病理指標MVD和VI，結果顯示3D-CPA所得血管分級結果為非HPV感染病例（對照組）血管分級I的比例明顯高于HPV陽性各組，而分級III比例明顯低于各組；于此對應的病理結果顯示對照組的MVD值與VI值均不同程度的低于HPV陽性各組。

表2　各組VEGF表達比較

表3　血管分級下HPV感染亞型比例趨勢分析 例（%）

表4　各組MVD值及VI值比較

本研究還提示高危型患者VEGF表達水平高，可能是血流旺盛的主要原因之一。綜上所述，HPV16/18宮頸癌患者病變血流更為豐富，可能與預后有著密切關系，具體機制有待進一步研究證實。

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