紅楓湖櫻桃花粉超低溫保存探究

宋常美， 文曉鵬， 李慶宏

(1.貴陽學(xué)院生物與環(huán)境工程學(xué)院，貴州貴陽 550003； 2.貴州大學(xué)農(nóng)業(yè)生物工程重點實驗室，貴州貴陽 550025；3.貴陽市農(nóng)業(yè)試驗中心，貴州貴陽 550003)

花粉保存是育種工作的核心內(nèi)容，適宜的保存方式能延長花粉活力，利于進行異地授粉，克服花期不育等困難，進行雜交種子生產(chǎn)及保持單倍體基因，可有效地推動育種工作的開展，為資源創(chuàng)新提供有力保障。溫度和濕度是影響花粉貯藏的重要因素。低溫和干燥的環(huán)境下，代謝過程減弱且呼吸作用降低，能較長時間保持花粉活力，隨貯藏時間的延長，花粉貯藏物質(zhì)消耗過多，酶活性下降，水分過度缺乏，從而使活力下降[1-2]。低溫保存可適當(dāng)延長花粉壽命，但活力仍會下降，超低溫可長時間保持花粉活力并避免病蟲害引入，且便于資源交換[3-4]。目前，鳳梨[5]、柑橘[6]、唐菖蒲[7]、椰子[8]、桃[9]和橄欖[10]等植物花粉均已成功保存。而有關(guān)櫻桃，尤其是中國櫻桃花粉超低溫保存卻未見報道。

貴州省是櫻亞屬植物起源中心之一[11]，種質(zhì)資源豐富，具有遺傳改良物質(zhì)基礎(chǔ)。近些年，該省大力發(fā)展果蔬產(chǎn)業(yè)，櫻桃被列為精品水果得以大面積發(fā)展，并引種甜櫻桃，為利用其耐儲存的特點，望將地方資源與其進行雜交能創(chuàng)造耐儲存、品質(zhì)優(yōu)良且適合在西南大面積栽種的品種。然而，甜櫻桃的花期較地方櫻桃晚1個月，因此進行地方櫻桃花粉長期保存研究具有一定的意義。紅楓湖櫻桃(PrunuspseudocerasuL.‘Hongfenghu’)是貴陽市本土種質(zhì)資源，果實較大，可作為育種材料，本試驗期望通過建立其花粉長期保存體系，為中國櫻桃花粉長期保存提供理論參考，最終服務(wù)于育種工作。

1　材料與方法

1.1　材料

2011年2月底從貴陽市烏當(dāng)區(qū)摘取即將開放的紅楓湖櫻桃花，隨后將花藥用鑷子夾落在硫酸紙上自然陰干1 d，隨后連同花藥一起進行干燥處理。

1.2　方法

1.2.1試驗設(shè)計本試驗設(shè)置了液氮(-196 ℃)、-80 ℃及-20 ℃ 3種溫度保存櫻桃花粉。液氮保存即超低溫保存，將花粉置于含硅膠的干燥器中，常溫和4 ℃下干燥0、3、6、9、12 h后收集于凍存管并迅速置入液氮，1 h后用流水解凍 10 min 進行萌發(fā)率檢測。-80 ℃及-20 ℃保存時將花粉置于含硅膠的干燥器，4 ℃下處理0、3、6、9、12 h后收集于凍存管，用錫箔紙包裹后放入試管盒，盒子用錫箔紙包裹后再用2個塑料袋包裹，分置于-80 ℃及-20 ℃保存12個月，干燥 3 h 的花粉每月檢測1次活力，其余保存6個月后檢測1次。此外，將-80 ℃及-20 ℃下保存3月后花粉取出置于含硅膠的干燥器，室溫下干燥0、3、6 h/周，連續(xù)處理4周，檢測保存過程中干燥時間對花粉活力的影響。每個處理含3支凍存管，即3個重復(fù)。

1.2.2花粉活力檢測花粉活力檢測采用離體萌發(fā)法和坐果率檢測。離體萌發(fā)法檢測操作如下：取適量培養(yǎng)基(0.1 g/L 硼酸+10%蔗糖+0.5%瓊脂)在載玻片上，待凝固后用醫(yī)用棉簽蘸少量花粉均勻抖落在上面，隨后放入墊有濕濾紙的培養(yǎng)皿，用保鮮膜封皿后置于恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度為25±2 ℃，8 h后統(tǒng)計數(shù)據(jù)。所有處理均含3個重復(fù)，每個重復(fù)培養(yǎng)3個載玻片，每個載玻片選3個視野計數(shù)，每個視野花粉數(shù)多于50粒。坐果率檢測時將-80 ℃及-20 ℃下保存12個月的花粉進行同株授粉，同時采用當(dāng)年花粉為對照，授粉時將處于鈴鐺期或棉花期的花朵進行連被去雄，30 d后統(tǒng)計坐果率。

1.3　數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

數(shù)據(jù)均采用SPSS 17.0軟件分析，萌發(fā)率=萌發(fā)花粉數(shù)/花粉總數(shù)×100%(花粉管長度超過花粉粒直徑作為萌發(fā)標(biāo)準(zhǔn))，坐果率=坐果數(shù)/授粉總數(shù)×100%。

2　結(jié)果與分析

2.1　干燥溫度及時間對超低溫保存的影響

干燥溫度對花粉超低溫保存的萌發(fā)率有明顯影響(圖1)。2種溫度下干燥3 h的花粉萌發(fā)率明顯高于未干燥的花粉，未干燥花粉萌發(fā)率僅63.55%，而干燥后的花粉可達(dá)到83%以上。室溫下隨干燥時間的延長萌發(fā)率逐漸下降，12 h降至最低(54.65%)，15 h略有回升(62.57%)。然而，4 ℃下干燥的花粉萌芽率在3 h后并未隨時間延長而降低。因此，為避免花粉活力下降，室溫干燥時間以約3 h為宜，4 ℃下的干燥時間沒有明顯影響。

2.2　干燥時間及保存溫度的影響

將干燥不同時間的花粉在-20 ℃及-80 ℃下保存6個月后進行活力檢測，發(fā)現(xiàn)干燥時間無明顯影響，萌發(fā)率為85%～86%(圖2)。從圖3可以看出，保存溫度也無明顯影響，-20 ℃及-80 ℃下保存的花粉萌發(fā)率無明顯差異，且保存10個月前幾乎無變化，隨后略有下降。保存1個月后檢測的花粉活力約為86%，12個月后降至約84%。因此，考慮技術(shù)及成本，-20 ℃下適合櫻桃花粉較長時間保存。

2.3　保存中干燥時間的影響

為避免花粉濕度高導(dǎo)致萌發(fā)率下降，因此設(shè)計在保存過程中對花粉抽出進行干燥0、3、6 h/周，但發(fā)現(xiàn)干燥反而引起萌發(fā)率下降(表1)。-20 ℃及-80 ℃下，花粉活力均隨干燥時間的延長而下降。-20 ℃下，不干燥萌芽率可一直保持85%以上，但4周后，干燥3 h和6 h的萌發(fā)率分別為67.61%和52.06%。-80 ℃下，不干燥萌芽率亦可一直保持85%以上，4周后干燥3 h和6 h的萌發(fā)率分別為61.93%和52.52%。

表1　保存中干燥時間對花粉萌發(fā)率的影響

注：同列數(shù)據(jù)后相同字母表示經(jīng)鄧肯氏多重極差檢驗在0.05水平上差異不顯著。表2同。

2.4　坐果率檢測

-20 ℃及-80 ℃下保存1年后的花粉與CK無顯著差異(表2、圖4)，保存的花粉授粉坐果率均可達(dá)到80%左右，但三者數(shù)值以-80 ℃最高(87.17%)，其次為CK(84.75%)、-20℃(78.68%)。由此可見，-20 ℃及-80 ℃下保存1年后的花粉可用于授粉。

表2　保存溫度對坐果率的影響

3　討論

Towill認(rèn)為超低溫保存效果取決于花粉的干燥度，適宜的干燥方式和干燥時間對花粉儲藏有較大影響[12]。許多植物用硅膠干燥4 h為好[13-15]。Barnabas認(rèn)為含水量對花粉的超低溫保存影響很大，但過分干燥不行[16-17]。干燥后的辣椒花粉進行超低溫(-196 ℃)貯藏1年仍具有新鮮花粉一半活力，但未干燥幾乎無有效儲藏期[18]。本試驗對干燥溫度和時間進行了探討，發(fā)現(xiàn)室溫干燥3 h后可獲得較高萌發(fā)率，干燥時間過長則萌發(fā)率下降，12 h后急劇下降。然而，本試驗在-196 ℃、-20 ℃和-80 ℃下保存時均發(fā)現(xiàn)，4 ℃下干燥時間長短無影響，且試驗中還發(fā)現(xiàn)部分花粉受潮成團的現(xiàn)象。本試驗同時發(fā)現(xiàn)，將保存在-20 ℃和-80 ℃下的花粉取出，于室溫干燥0、3、6 h后獲得的結(jié)果不一樣，干燥3 h或6 h花粉活力下降，尤其以6 h下降更快。這也許說明干燥時的溫度對花粉保存的影響大于含水量。究其原因，可能有3點：一是花粉在4 ℃干燥時已經(jīng)歷低溫鍛煉，同時在放入-20 ℃和 -80 ℃ 時具有多層包裹物，一定程度上降低了低溫的刺激，從而更利于適應(yīng)環(huán)境變化。陶麗等在4 ℃、25 ℃及-80 ℃下儲藏澳洲堅果花粉，發(fā)現(xiàn)-80 ℃最差，認(rèn)為與保存前未干燥處理有關(guān)，這也說明干燥時的低溫鍛煉對花粉活力有一定影響[19]。二是室溫干燥時溫度較高，花粉失活較快。楊帆等采用自然干燥、干燥皿干燥、40 ℃烘箱干燥3種方式干燥澳洲堅果花粉，并在4 ℃保存，結(jié)果表明前2種方式下花粉萌發(fā)率極顯著高于后者[20]。三是花粉經(jīng)歷反復(fù)的解凍和冷凍，細(xì)胞易受傷害導(dǎo)致活力下降。這與呂晉慧等在地被菊花粉保存上的觀點[21]一致。綜上，本試驗認(rèn)為，櫻桃花粉干燥時的溫度比含水量的影響更大，低溫干燥可避免花粉活力在儲存前快速下降。

花粉是否具有活力最有利的證據(jù)為是否能授粉，某些花粉經(jīng)低溫保存后，出現(xiàn)離體萌發(fā)率低而授粉能力強的現(xiàn)象[22]。這種現(xiàn)象可能是因為低溫保存后的花粉對萌發(fā)培養(yǎng)基不敏感[23-24]，保存后的花粉萌發(fā)率達(dá)到10%～30%就能授粉坐果[25-26]。本試驗中，儲存于-20 ℃和-80 ℃下的花粉萌發(fā)率均在85%左右，授粉率與新鮮花粉相比無顯著差異，甚至數(shù)值上-80 ℃儲藏花粉高于新鮮花粉。矮牡丹經(jīng)超低溫保存后出現(xiàn)花粉萌發(fā)率明顯升高的“冷刺激”現(xiàn)象[1]。魔芋[27]和山龍眼屬[28]花粉超低溫保存中均發(fā)現(xiàn)此現(xiàn)象，但該現(xiàn)象出現(xiàn)的機制目前尚不清楚。玫瑰花粉經(jīng)液氮超低溫保存后的授粉能力與新鮮花粉也沒有區(qū)別[29]。Parton等將保存于-80 ℃下6個月的蜻蜓鳳梨花粉進行授粉，授粉能力并未下降，而虎紋鳳梨卻被發(fā)現(xiàn)其授粉能力不如新鮮花粉[30]。飛燕草花粉儲存在25 ℃下60 d便沒有授粉能力，而-30 ℃下180 d后授粉能力高于新鮮花粉[31]。總體而言，-20 ℃便可進行櫻桃花粉長期保存。

本試驗儲藏花粉是同花藥一起保存的，與僅保存花粉的方法有差異，但也獲得了較好的效果，這樣使得操作更簡便，且提高花粉利用率。這種方法在杜鵑紅山茶花[32]和桂花[33]上亦用到。

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