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    MaCaM和MaCAMTA3基因在熱處理誘導(dǎo)香蕉抗冷性中的作用

    2018-04-09 05:47:13王海波蘇新國張昭其龐學(xué)群
    江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué) 2018年5期
    關(guān)鍵詞:冷性脯氨酸擬南芥

    王海波, 李 璐, 蘇新國, 張昭其, 龐學(xué)群

    (1.廣東食品藥品職業(yè)學(xué)院,廣東廣州 510520; 2.華南農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院,廣東廣州 510642;3.華南農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝學(xué)院,廣東廣州 510642)

    香蕉果實在貯藏溫度低于12 ℃時即發(fā)生冷害,難以采用較低的溫度來延長貯運期[1-2]。熱處理是提高果蔬抗冷性的最有效的采后處理措施之一[3],但熱處理誘導(dǎo)的抗冷機制目前尚不明確。鈣調(diào)素(calmodulin,CaM)是植物中重要的第二信使,CAMTA(calmodulin-binding transcription activator)/SR (signal responsive transcription activator)是一類廣泛存在于真核生物中的含有CaM結(jié)合位點的轉(zhuǎn)錄因子家族。CaM和CAMTA在植物響應(yīng)逆境中起調(diào)節(jié)作用,對香蕉CaM和CAMTA 的深入研究,有助于進(jìn)一步了解香蕉鈣信號系統(tǒng)調(diào)節(jié)的分子機制,有助于揭示熱處理提高香蕉果實抗冷性的作用機理。CaM參與了植物對高溫、低溫脅迫等的響應(yīng),并且在植物細(xì)胞對脅迫的適應(yīng)過程中起重要調(diào)節(jié)作用[4-5]。熱、冷、干旱等多種脅迫都能誘導(dǎo)CAMTA基因上調(diào)表達(dá)[6-7]。擬南芥CAMTA3能同CBF2(C-repeat binding transcription factor)啟動子區(qū)域CM2序列(CCGCGT)結(jié)合,激活CBF2等基因的表達(dá),從而提高擬南芥的抗冷性[8]。筆者所在課題組的前期研究結(jié)果表明,采用52 ℃熱水處理香蕉果實3 min,能有效減輕香蕉果實的冷害癥狀[9-10],但有關(guān)CaM和CAMTA在熱水處理誘導(dǎo)香蕉抗冷性中的作用目前還不明確。分析CaM和CAMTA基因在香蕉熱處理和低溫貯藏中的表達(dá)情況,探討這2個基因在熱處理誘導(dǎo)香蕉抗冷性中的作用,為有效延長香蕉貯運期提供參考依據(jù)。

    1 材料與方法

    1.1 試驗材料及處理

    香蕉品種為巴西(Musaspp. AAAGroupcv.cavendish),采自廣東省廣州市番禺香蕉園,及時運回廣東省果蔬保鮮重點實驗室。挑選七成飽滿、大小均勻、無病蟲害及機械損傷的單個香蕉, 先后用0.1%漂白粉和0.05%咪鮮胺錳鹽可濕性粉劑各浸泡5 min,晾干后備用。

    熱水及低溫貯藏處理:將香蕉果實浸入熱水處理機(體積400 L)中,溫度52 ℃,時間3 min。熱水處理后將香蕉果實放入20 ℃恒溫箱中貯藏3 h,然后置于7 ℃下貯藏5 d;對照處理的香蕉在20 ℃恒溫箱中貯藏3 h,然后置于7 ℃下貯藏5 d。每個處理100個香蕉,定期取樣備用。取樣時間點為:20 ℃下0、0.5、1.5、3.0 h;7 ℃下1.0、4.0、8.0、24.0、48.0、120.0 h。

    1.2 試驗方法

    1.2.1脯氨酸含量測定參照Demiral等的試驗方法[11],略有改動。取香蕉果皮0.5 g,用5 mL 3%磺基水楊酸提取,沸水浴10 min,冷卻。5 000 r/min離心10 min,取上清液待測。測定:取2 mL上清液,加2 mL水、2 mL 3%磺基水楊酸、2 mL冰乙酸和4 mL 2.5%茚三酮,沸水浴顯色30~60 min,冷卻。加4 mL甲苯萃取,靜置后取甲苯相測定520 nm下的吸光度(以甲苯為空白對照)。根據(jù)下式計算脯氨酸含量:單位鮮質(zhì)量樣品中脯氨酸含量(μg/g)=2.5C/W,式中:C為樣品脯氨酸濃度,μg/mL;W為樣品質(zhì)量,g;2.5表示溶液體積為 2.5 mL。

    1.2.2實時定量引物設(shè)計根據(jù)已經(jīng)克隆得到的MaCaM和MaCAMTA3基因序列,設(shè)計實時定量引物,驗證后備用。引物序列為MaCaM(5′-ACCGAAGCTGAGCTACAG-3′、5′-ATCCTTCATCTTGCGAGC-3′)和MaCAMTA3(5′-GCAA ATGGTCACAAAGGC-3′、5′-GAGAAGCATTCCGAACAG-3′)。

    1.2.3實時熒光定量PCR(qRT-PCR)采用TOYOBO THUNDERBIRD SYBR?qPCR Mix 進(jìn)行qRT- PCR擴增。反應(yīng)體系為20.0 μL,即SYBR-Green PCR Master Mix 10.0 μL,上、下游引物(10 μmol/L)各0.25 μL,稀釋的cDNA 2.0 μL,ddH2O 7.5 μL。擴增程序:95 ℃ 3 min;95 ℃ 10 s,59 ℃ 10 s,72 ℃ 20 s,40個循環(huán)。為了確認(rèn)產(chǎn)物的質(zhì)量和引物的特異性,在溶解曲線中分析產(chǎn)物的Tm(分析溶解溫度為65~95 ℃)。所有qRT-PCR結(jié)果根據(jù)內(nèi)參基因Actin1進(jìn)行Ct值校準(zhǔn),再利用2-ΔΔCt計算目的基因的相對表達(dá)量,重復(fù)3次。

    1.3 數(shù)據(jù)處理

    采用Sigmaplot 12.5制作折線圖。

    2 結(jié)果與分析

    2.1 熱激處理及熱激后低溫貯藏對脯氨酸含量的影響

    前期研究表明,7 ℃(冷害溫度)下,香蕉果實在處理后 5 d 已經(jīng)出現(xiàn)明顯的冷害癥狀,利用52 ℃熱水處理(HWD) 3 min 能有效提高香蕉果實在7 ℃低溫貯藏中的抗冷性[9-11]。從圖1可知,對照香蕉果實的脯氨酸含量在7 ℃下呈現(xiàn)緩慢上升的趨勢。熱激處理后在20 ℃貯藏期間,香蕉果實的脯氨酸含量小幅度逐漸增加,且脯氨酸含量略高于對照。當(dāng)熱激后的香蕉果實轉(zhuǎn)入7 ℃下1 h時,脯氨酸含量迅速增加至20 ℃貯藏時的3倍左右,之后呈現(xiàn)出下降上升再下降的趨勢,在整個7 ℃低溫貯藏期間,熱激處理的香蕉果實其脯氨酸含量一直明顯高于對照。

    2.2 熱激處理及熱激后低溫貯藏對MaCaM表達(dá)的影響

    從圖2可知,對照處理的MaCaM基因表達(dá)在7 ℃下1 h迅速升高至最大值,之后又在7 ℃ 4 h迅速下降,后期持續(xù)在同一個水平,但表達(dá)量仍高于20 ℃下的表達(dá)量。香蕉果實經(jīng)過HWD處理后,MaCaM基因表達(dá)呈現(xiàn)快速升高的趨勢,在20 ℃下3 h達(dá)到一個高峰,MaCaM基因表達(dá)量約為對照的2倍。當(dāng)熱激后的香蕉果實中轉(zhuǎn)入7 ℃低溫貯藏1 h時,MaCaM基因表達(dá)量迅速下降至0 d的水平,這與對照的表現(xiàn)相反。7 ℃低溫4~8 h時,MaCaM基因表達(dá)量迅速增強至最高峰,之后逐漸下降。除7 ℃貯藏1、4 h外,熱激處理的MaCaM基因表達(dá)量均高于對照。

    2.3 熱激處理及熱激后低溫貯藏對MaCAMTA3表達(dá)的影響

    從圖3可知,對照處理的MaCAMTA3基因在7 ℃貯藏下1~8 h呈現(xiàn)逐漸下降趨勢,7 ℃貯藏8~24 hMaCAMTA3基因表達(dá)又增強至20 ℃貯藏時的水平,之后又開始逐漸下降。香蕉經(jīng)HWD處理后3 h,MaCAMTA3基因表達(dá)逐漸升高至最大值,約是對照處理的1.4倍,然而當(dāng)果實轉(zhuǎn)入7 ℃后1 h,MaCAMTA3基因表達(dá)量出現(xiàn)短暫而迅速的下降,且低于對照。之后其表達(dá)量逐漸上升,在7 ℃ 8~24 h達(dá)到一個高峰,之后又開始逐漸下降。除7 ℃貯藏1、4 h外,HWD處理的MaCAMTA3基因表達(dá)均高于對照。

    3 結(jié)論與討論

    脯氨酸含量的積累與果實抗冷性的提高密切相關(guān)[12]。桃果實中較高的脯氨酸含量明顯提高了桃果實的抗冷性,而且用外源5 mmol/L脯氨酸處理桃果實,能明顯降低桃果實冷害指數(shù),緩解其冷害癥狀的發(fā)生[13]。10 mmol/L甜菜堿處理可提高黃瓜果實中脯氨酸含量,從而減輕黃瓜果實貯藏期間的冷害[14]。外源NO處理能夠通過促進(jìn)香蕉果實脯氨酸積累和增強體系的抗氧化性,進(jìn)而減輕香蕉冷害[15]。本研究也發(fā)現(xiàn),熱激能在處理后3 h內(nèi)輕微增加香蕉果實脯氨酸的含量,而當(dāng)果實經(jīng)熱激處理后在7 ℃低溫貯藏時,其脯氨酸含量一直明顯高于對照處理,說明熱激誘導(dǎo)的脯氨酸大量積累與香蕉果實的抗冷性密切相關(guān)。

    熱激處理能在短時間內(nèi)迅速激活CaM的表達(dá)。例如,擬南芥幼苗經(jīng)過37 ℃熱激后,其AtCaM3基因表達(dá)水平在 20 min 內(nèi)迅速增加并達(dá)到最大值,在30 min后逐漸下降[16]。37 ℃處理玉米幼苗后,其CaM1-2的表達(dá)在10 min后開始迅速增強[4],本研究也發(fā)現(xiàn),香蕉果實經(jīng)過熱激處理后,MaCaM基因表達(dá)呈現(xiàn)快速升高的趨勢,在處理后3 h達(dá)到一個高峰。CaM也參與了植物的低溫脅迫反應(yīng)。例如,茶樹在4 ℃低溫脅迫下,CsCaM1與CsCaM2基因的表達(dá)量從3 h開始逐漸上升,于24 h達(dá)到最大值[17]。 4 ℃低溫能誘導(dǎo)小麥幼苗TaCaM5的表達(dá)量在1 h后迅速升高,3 h達(dá)到最高峰,之后又迅速下降至處理前的水平[18]。本研究結(jié)果與之類似,7 ℃ 低溫誘導(dǎo)香蕉果實的MaCaM基因表達(dá)在1 h迅速升高至最大值,之后又在4 h迅速下降,后期維持在一個較低的水平。而經(jīng)熱激處理后在7 ℃低溫貯藏的香蕉果實,MaCaM基因表達(dá)高峰推遲出現(xiàn)在4 h,除低溫貯藏1、4 h外,熱激處理的MaCaM基因表達(dá)均高于對照。以上結(jié)果說明,MaCaM可能參與了熱激處理誘導(dǎo)香蕉果實抗冷性的過程。

    熱處理和低溫都能誘導(dǎo)CAMTA基因的表達(dá)。42 ℃熱處理能誘導(dǎo)擬南芥幼苗的AtCAMTA1、AtCAMTA2、AtCAMTA3、AtCAMTA5、AtCAMTA6這5個基因在15 min開始上調(diào)表達(dá),尤其是AtCAMTA1、AtCAMTA5、AtCAMTA6這3個基因在熱處理4 h內(nèi)均維持較高的表達(dá)水平。類似地,4℃低溫也能誘導(dǎo)擬南芥幼苗AtCAMTA1、AtCAMTA2、AtCAMTA3、AtCAMTA5、AtCAMTA6這5個基因的上調(diào)表達(dá),尤其是AtCAMTA1、AtCAMTA3、AtCAMTA5、AtCAMTA6這4個基因在低溫處理4 h內(nèi)均保持較高的表達(dá)水平[6]。本研究也發(fā)現(xiàn),熱處理能誘導(dǎo)香蕉果實MaCAMTA3基因表達(dá)在處理后3 h內(nèi)迅速增強,7 ℃ 低溫貯藏下MaCAMTA3基因表達(dá)呈現(xiàn)先下降后上升再下降的趨勢,而經(jīng)過熱激處理后在7 ℃低溫貯藏的香蕉果實,除低溫貯藏1、4 h外,MaCAMTA3基因表達(dá)均高于對照。說明熱激處理誘導(dǎo)MaCAMTA3基因較高的表達(dá)水平,可能參與了熱激處理誘導(dǎo)香蕉果實產(chǎn)生的抗冷性。

    熱處理能誘導(dǎo)香蕉果實在低溫貯藏中的脯氨酸含量升高,從而提高果實抗冷性。MaCaM和MaCAMTA3基因可能參與了熱激處理誘導(dǎo)香蕉果實產(chǎn)生的抗冷性。

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