不同透明度水稻籽粒橫斷面掃描電鏡分析

陸彥 張曉敏 祁琰 張昌泉 凌裕平 劉巧泉,*

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不同透明度水稻籽粒橫斷面掃描電鏡分析

陸彥1,2張曉敏2,3祁琰2,3張昌泉1凌裕平3劉巧泉1,*

(1揚(yáng)州大學(xué) 農(nóng)學(xué)院 植物功能基因組學(xué)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/江蘇省作物遺傳生理重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/糧食作物現(xiàn)代產(chǎn)業(yè)技術(shù)協(xié)同創(chuàng)新中心,江蘇 揚(yáng)州 225009;2揚(yáng)州大學(xué)測試中心,江蘇 揚(yáng)州 225009;3揚(yáng)州大學(xué) 園藝與植物保護(hù)學(xué)院,江蘇 揚(yáng)州 225009;)

【目的】探索單淀粉粒斷面觀察方法，并闡明稻米透明度與直鏈淀粉含量的關(guān)系以及造成稻米透明度下降的淀粉結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)?！痉椒ā坎捎脪呙桦婄R對經(jīng)過不同處理的具有不同透明度的秈稻和粳稻胚乳橫斷面進(jìn)行淀粉粒結(jié)構(gòu)觀察研究?！窘Y(jié)果】秈稻和粳稻稻米的透明度在直鏈淀粉含量低于15%的軟米中明顯下降。通過比較不同籽粒橫斷面斷開方式，發(fā)現(xiàn)直接機(jī)械斷裂法無法斷開單個(gè)淀粉粒，機(jī)械斷裂加玻璃刀刮刻法可以斷開單個(gè)淀粉粒但斷面結(jié)構(gòu)變形且無法定量分析。液氮脆斷法可以觀察到單個(gè)斷裂的淀粉粒以及其中的空腔。比較秈稻和粳稻胚乳橫斷面淀粉粒的排列方式和單個(gè)淀粉粒內(nèi)部結(jié)構(gòu)，表明所有品種稻米胚乳淀粉粒均規(guī)則且緊湊排列，但所有暗胚乳稻米籽粒橫斷面中淀粉粒內(nèi)部存在明顯的空腔且糯稻淀粉?？涨坏臄?shù)目和大小均明顯高于暗胚乳稻米。進(jìn)一步通過梯度烘干實(shí)驗(yàn)，證明稻米淀粉粒中的空腔數(shù)目和大小隨著水分的降低而增多和變大?！窘Y(jié)論】液氮直接脆斷法是觀察水稻單個(gè)淀粉粒斷面的有效方法。稻米透明度與胚乳淀粉粒的排列緊密程度無關(guān)而與稻米的含水量以及單個(gè)淀粉粒中間的氣腔數(shù)目和大小直接相關(guān)。此外，直鏈淀粉含量越低，淀粉粒中間的空腔數(shù)目越多，孔徑越大。

水稻；淀粉粒；掃描電鏡；透明度；氣腔

水稻是我國重要的糧食作物之一，稻米外觀品質(zhì)是廣大消費(fèi)者和研究者首要關(guān)注的性狀，也是稻米商品價(jià)值的重要決定因素[1-2]。稻米外觀品質(zhì)主要涉及稻米粒形和透明度(或堊白)，其中稻米粒形因不同地區(qū)的文化差異而存在一定的偏好性，但對稻米透明度性狀的偏好基本一致，都偏愛透明度好的稻米[3-4]。目前我國優(yōu)質(zhì)稻米育種在常規(guī)稻和雜交稻研究方面都取得了較大進(jìn)展[5]，其中稻米蒸煮食味品質(zhì)提升的一個(gè)重要方式是通過降低稻米表觀直鏈淀粉含量(AAC)途徑來實(shí)現(xiàn)。但通過該方法培育的優(yōu)質(zhì)軟米由于AAC普遍在14%以下而造成整粒精米在存放一段時(shí)間后因水分降低或老化等原因而出現(xiàn)暗胚乳(或云霧狀)的表型[6]。因此，目前軟米一般都是真空包裝銷售且需要保持一定的含水量，散裝銷售則很快就會(huì)出現(xiàn)暗胚乳表型而影響消費(fèi)者的選擇。暗胚乳的極端表型是糯稻，精米呈乳白色，完全不透明。

有關(guān)暗胚乳和糯稻不透明性狀形成的淀粉結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)并不清楚，但可以明確它不同于常見的稻米堊白性狀，后者主要是由于胚乳中區(qū)域性的淀粉粒排列松散而導(dǎo)致存在著一些空腔進(jìn)而造成的一種光學(xué)特性[7]。早期的研究發(fā)現(xiàn)在糯稻以及部分暗胚乳突變體的淀粉粒表面存在空腔，但透明度是否與之有關(guān)尚不明確[8]。Zhang等[9]通過分析在糯稻基礎(chǔ)上構(gòu)建的具有不同AAC轉(zhuǎn)基因稻米的透明度與胚乳淀粉粒的結(jié)構(gòu)關(guān)系發(fā)現(xiàn)，糯稻胚乳淀粉粒中間存在很多空腔，并且隨著AAC的增加，空腔數(shù)目有變少的趨勢，因此認(rèn)為糯稻的不透明和暗胚乳的半透明都是由于淀粉中間的空腔造成的。由于上述研究是利用轉(zhuǎn)基因稻米且在一個(gè)水稻品種背景下進(jìn)行比較分析的，在常規(guī)栽培的軟米和糯米的水稻品種中這種現(xiàn)象是否存在，并不清楚。因此本研究分別在秈稻和粳稻背景下選取了具有不同AAC和透明度的稻米品種進(jìn)行了稻米胚乳橫斷面的掃描電鏡(Scanning Electron Microscopy, SEM)觀察分析，一方面通過優(yōu)化稻米胚乳橫斷面斷裂方法來達(dá)到最優(yōu)的觀察淀粉粒斷面效果；另一方面，利用最佳處理方式來明確不同稻米的透明度是否與淀粉粒中間的空腔有關(guān)系以及空腔的大小和數(shù)目是否存在差異。

1?材料與方法

1.1?實(shí)驗(yàn)材料

供試水稻材料包括5個(gè)秈稻品種(清蘆占11、9311、滇屯502、鴨血糯、蘇御糯)和5個(gè)粳稻品種(武育粳3號、日本晴、關(guān)東194、廣陵香糯、太湖糯)。其中滇屯502、關(guān)東194為軟米品種，鴨血糯、蘇御糯、廣陵香糯和太湖糯為糯稻品種。為控制生育期可能對后續(xù)試驗(yàn)造成干擾，上述所選粳稻品種間和秈稻品種間的生育期差異均控制在2周之內(nèi)。上述材料于2016年夏季種植在揚(yáng)州大學(xué)校內(nèi)實(shí)驗(yàn)農(nóng)場。此外，進(jìn)一步選取了2017年夏季種植在揚(yáng)州大學(xué)校內(nèi)實(shí)驗(yàn)農(nóng)場的滇屯502、蘇御糯、關(guān)東194和廣陵香糯進(jìn)行水分含量對稻米外觀和淀粉結(jié)構(gòu)的分析。上述水稻材料的播種到成熟期間均實(shí)行普通大田常規(guī)栽培管理。收獲的成熟水稻種子除了部分品種用于烘干處理外，其他均經(jīng)過自然干燥，室溫保存3個(gè)月后進(jìn)行測試。

1.2?樣品前處理

用于水分含量與外觀分析的種子在收獲后密封保存，其余分成2份，于40℃下分別烘6 h和12 h，隨后用礱谷機(jī)(SY88-TH, 韓國)脫去穎殼，并用小型精米機(jī)(Kett，日本)研磨60 s，密封保存精米用于觀察橫斷面。用水分分析儀(Mettler Toledo MJ33, 瑞士)測定含水量并拍照分析。

其他樣品正常去殼、出糙和出精，用于淀粉提取和磨粉(FOSS, 瑞典)。磨完的米粉用百目篩篩除大顆粒后，轉(zhuǎn)入紙袋，37℃下烘2 d，之后室溫平衡2 d，用于其他分析。

1.3?稻米常規(guī)品質(zhì)分析

米粉AAC的測定按照農(nóng)業(yè)部頒發(fā)標(biāo)準(zhǔn)NY147－88進(jìn)行，參比樣品購自中國水稻研究所。稻米蛋白質(zhì)含量用全自動(dòng)凱氏定氮儀(Kjeltec 2300型, FOSS公司)測定，按半微量凱氏法測定米粉中全氮含量并通過換算按系數(shù)6.25計(jì)算出樣品蛋白質(zhì)含量，每份樣品重復(fù)測定3次，取其平均值。

1.4?稻米淀粉分離

參照Zhang等[9]濕磨的淀粉分離方法，并進(jìn)行一定的改動(dòng)。具體為稱取10 g精米于50 mL離心管中，將精米用3倍體積堿性水溶液(用NaOH調(diào)pH值至8.0~8.5)浸泡過夜后用組織勻漿機(jī)(IKA-T RCT-Basic，德國)勻漿并過300目篩。勻漿液轉(zhuǎn)至100 mL三角瓶中，加入50 mg/g的堿性蛋白酶和25 μL疊氮化鈉溶液(0.04 g/mL)。在42℃下，搖床消化16 h。勻漿液轉(zhuǎn)移至50 mL離心管中，離心并去除上清，刮掉淀粉表層黃色部分后用蒸餾水懸浮沉淀，再次離心，重復(fù)4~5次。最后用90%無水乙醇清洗2次并用去脂抽提液(氯仿∶甲醇=1∶1)，在45℃下抽提去脂30 min。沉淀隨后用無水乙醇再清洗4次，然后在40℃烘箱中烘干。

1.5 稻米斷面電鏡觀察分析

將精米進(jìn)行3種處理：第一種處理是將完整精米用鑷子直接掰斷；第二種處理是將完整的精米放至液氮中冷凍3~5 min，然后用鑷子對米粒施加外力將其脆斷；第三種處理是將直接掰斷的米粒斷面進(jìn)一步用刀片刮蹭。將3種方法處理過的精米斷面朝上粘在樣品臺(tái)上，用SCD-500離子濺射噴鍍儀鍍金，在場發(fā)射掃描電子顯微鏡(S-4800ⅡFESEM)上觀察拍照。

1.6 稻米淀粉粒的電鏡觀察與粒徑分布測定

取10 mg烘干的淀粉粉末于1.5 mL離心管中，加入500 μL無水乙醇懸浮后，滴加到樣品臺(tái)上，晾干后，置于離子濺射噴鍍儀(SCD-500)內(nèi)噴金鍍膜，用場發(fā)射掃描電子顯微鏡(S-4800ⅡFESEM)觀察稻米淀粉粒的形貌及顆粒大小，隨機(jī)選取多個(gè)觀察區(qū)域，拍照。根據(jù)放大倍數(shù)校正標(biāo)尺后，每個(gè)樣品隨機(jī)選擇200粒淀粉，利用Image J軟件測量其直徑，隨后用Excel軟件計(jì)算其平均值、標(biāo)準(zhǔn)差，并繪制粒徑的頻數(shù)分布圖。

1.7 統(tǒng)計(jì)分析

上述測量數(shù)據(jù)的輸入和分析由Excel軟件整理并由統(tǒng)計(jì)軟件SPSS 16.0進(jìn)行單因素方差分析檢測不同數(shù)據(jù)間是否存顯著差異。試驗(yàn)數(shù)據(jù)以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。

2?結(jié)果與分析

2.1 不同品種稻米的外觀與基本理化指標(biāo)比較

對相同存儲(chǔ)條件下不同品種稻米的精米進(jìn)行外觀比較發(fā)現(xiàn)，秈稻中清蘆占11和9311稻米均為正常的透明籽粒而軟米滇屯502則為半透明的暗胚乳表型。兩個(gè)秈糯品種鴨血糯和蘇御糯為完全不透明的乳白色(圖1)。粳稻中同樣存在類似的區(qū)別，武育粳3號和日本晴都為正常的透明籽粒，軟米關(guān)東194為半透明的暗胚乳外觀，而兩個(gè)糯稻品種廣陵香糯和太湖糯稻米則為不透明的乳白色(圖1)。

圖1?不同品種稻米整體外觀

Fig. 1.Rice grain appearance of different rice cultivars.

表1?不同品種稻米基本理化指標(biāo)

同一列中，數(shù)據(jù)后跟相同小寫字母者表示在0.05水平上差異不顯著。

In the same column, the data followed by the same lowercase indicates that the difference is not significant at the 0.05 level.

稻米的外觀表現(xiàn)受多種因素影響，如含水量、表觀直鏈淀粉含量(AAC)和蛋白質(zhì)含量等。水分含量是影響稻米外觀的一個(gè)重要因素，一般水分含量高的稻米透明度好。為了分析不同透明度稻米間含水量是否存在差異，對不同精米樣品的含水量進(jìn)行了測定，發(fā)現(xiàn)所有樣品的水分含量均在12%左右(表1)，無顯著差異。通過分析不同樣品的AAC，發(fā)現(xiàn)秈稻品種中AAC有高、中、低和糯四類(表1)。中高AAC稻米如清蘆占11和9311的外觀均表現(xiàn)透明，而中低AAC如滇屯502為暗胚乳；在粳稻中，AAC存在中、低和糯三類，其中中間類型AAC稻米如武育粳3號和日本晴的外觀正常，而低AAC的關(guān)東194也為暗胚乳表型。進(jìn)一步分析了不同樣品的蛋白質(zhì)含量，發(fā)現(xiàn)秈稻中糯稻蛋白質(zhì)含量明顯高于非糯稻品種，而非糯稻米如清蘆占11、9311和滇屯502的蛋白質(zhì)含量較為接近(表1)；在粳稻中，廣陵香糯稻米的蛋白質(zhì)含量最高，武育粳3號最低(表1)。上述結(jié)果說明不同品種稻米的透明度差異可能與AAC是直接相關(guān)的，而與水分含量和蛋白質(zhì)含量沒有直接關(guān)系。

2.2 不同處理對稻米斷面電鏡觀察的影響

為了觀察稻米淀粉粒中是否存在氣腔，對稻米橫斷面的斷裂方式進(jìn)行了優(yōu)化。通過比較10個(gè)水稻品種稻米三種斷裂方法的掃描結(jié)果發(fā)現(xiàn)，采用常規(guī)自然斷裂方法能觀察到淀粉粒規(guī)則的外部形態(tài)，不同品種間在胚乳斷面的正常區(qū)域(非堊白區(qū))的淀粉粒排列緊密，單個(gè)淀粉粒形狀規(guī)則(圖2-A1~E1, 圖3-A1~E1)。盡管該方法對于觀察具有完整結(jié)構(gòu)的淀粉粒非常方便，但是很難觀察到單個(gè)斷裂的淀粉粒。而利用液氮脆斷法，秈稻(圖2-A2~E2)和粳稻(圖3-A1~E1)樣品中盡管也能在少數(shù)區(qū)域觀察到具有完整淀粉粒的區(qū)域，但是，在多數(shù)區(qū)域都能清楚觀察到單個(gè)淀粉粒斷裂的情況(圖2、圖3)。通過分析，發(fā)現(xiàn)無論是秈稻還是粳稻背景，籽粒透明的稻米中，單個(gè)淀粉粒的斷面都比較光滑，幾乎沒有孔洞，而暗胚乳和糯稻的單個(gè)淀粉粒的斷面都能觀察到孔洞，且糯稻中孔洞多而大?？紤]到制樣的方便性，我們又比較了常規(guī)自然斷裂后用刀片對斷面刮蹭處理的方法，發(fā)現(xiàn)處理后樣品斷面刀痕非常明顯(圖2-A3~E3，2-A3~E3)，盡管在糯稻中能夠模糊觀察到淀粉粒中的空腔(圖2-D3~E3，圖4-I3~J3)，但圖片非常粗糙，無法進(jìn)行細(xì)節(jié)分析。因此，通過比較認(rèn)為，液氮脆斷稻米胚乳是一種有效的觀察單淀粉粒斷面結(jié)構(gòu)的方法。

2.3 不同稻米斷面空腔分析

利用液氮脆斷法分別對5個(gè)秈稻和5個(gè)粳稻品種稻米橫斷面淀粉粒中的空腔有無、數(shù)目和大小進(jìn)行了分析。在秈稻背景下，兩個(gè)透明稻米的淀粉粒斷面都看不到孔洞(圖4-A1~A3, B1~B3)，而在極少數(shù)淀粉粒表面發(fā)現(xiàn)有較小的孔洞，大多位于淀粉與儲(chǔ)藏蛋白結(jié)合處。具有暗胚乳的滇屯502胚乳斷面中可以觀察到明顯的孔洞分布，幾乎所有的淀粉粒斷面處都有孔洞(圖4-C1~C3)。在兩個(gè)糯稻中，只要有淀粉粒斷裂的斷面，就能觀察到明顯的孔洞分布，且部分淀粉粒中存在1~2個(gè)明顯較大的孔洞(圖4-D1~D3, E1~E3)。在粳稻背景下，具有正常透明度的武育粳3號和日本晴淀粉粒斷面也未觀察到孔洞(圖4-F1~F3, G1~G3)。而在軟米關(guān)東194的胚乳斷面，可見明顯散布的孔洞，單個(gè)淀粉粒一般存在1個(gè)孔洞(圖4-H1~H3)。與秈糯相似，2個(gè)粳糯品種胚乳淀粉粒斷面可見明顯散布的孔洞，且單淀粉?？锥磾?shù)目明顯增加，一般存在2個(gè)以上的較大的孔洞(圖4-I1~I3, J1~J3)。

為定量比較不同品種間孔洞數(shù)目和大小的差異，詳細(xì)分析了不同稻米橫斷面單個(gè)斷裂淀粉粒中孔洞的數(shù)目和大小。秈稻滇屯502淀粉粒中平均孔洞數(shù)目在1.1個(gè)左右，平均孔洞直徑為275 nm；而兩個(gè)秈糯淀粉粒的可見孔洞數(shù)目最多，接近2，平均孔洞直徑也極顯著大于滇屯502(表2)。此外，在粳稻關(guān)東194淀粉粒中平均孔洞數(shù)目為1，平均直徑318 nm；而兩個(gè)粳糯淀粉粒中的平均孔洞數(shù)目接近2，空腔的直徑也極顯著大于關(guān)東194(表2)。通過上述分析發(fā)現(xiàn)，不管是秈稻還是粳稻，單粒淀粉中孔洞個(gè)數(shù)與直徑大小呈明顯的正相關(guān)，表現(xiàn)為孔洞數(shù)量越多，孔洞直徑越大。

A－清蘆占11; B－9311; C－滇屯502; D－鴨血糯; E－蘇御糯。1－正常掰斷處理; 2－液氮冷凍處理; 3－正常掰斷后雙面刀片處理。箭頭示淀粉粒內(nèi)孔洞。標(biāo)尺=20 μm。

Fig. 2. Scanning electron microscopic images ofrice cross-section obtained by different methods.

2.4 水分含量對稻米外觀和淀粉結(jié)構(gòu)的影響

水分含量對稻米外觀具有重要的影響，通常水分含量高的稻米透明度好。因此，為分析不同水分含量對上述稻米尤其是軟米和糯米外觀及淀粉粒內(nèi)部結(jié)構(gòu)的影響，選取了秈稻軟米滇屯502、糯稻蘇御糯和粳稻軟米關(guān)東194、糯稻廣陵香糯4種稻米進(jìn)行梯度烘干處理分析。如圖5-A所示，剛收獲的稻米水分含量非常高，外觀透明。隨著烘干時(shí)間的增加，稻米水分含量顯著下降，胚乳逐漸變暗。烘6 h后兩個(gè)糯稻稻米徹底變?yōu)槿榘咨?，軟米滇?02和關(guān)東194的胚乳均開始變暗；烘12 h后，兩個(gè)軟米呈現(xiàn)典型的暗胚乳表型。

為分析不同水分含量下稻米透明度是否與胚乳淀粉粒中的孔洞數(shù)目和大小存在相關(guān)性，針對不同處理的樣品進(jìn)行了籽粒橫斷面的SEM觀察和淀粉?？锥磾?shù)目和大小的分析(圖5)。如圖5-C所示，在高水分含量下的滇屯502，其部分淀粉粒中央仍可以觀察到少量孔洞存在(圖5-C1)，分析認(rèn)為，由于樣品在噴金鍍膜處理和掃描電鏡觀察時(shí)均處于真空環(huán)境中，導(dǎo)致樣品失水，從而使淀粉內(nèi)出現(xiàn)空洞。此外，隨著水分的減少，能夠觀察到的孔洞概率明顯增多(圖5-C2，C3)。定量分析表明，高水分條件下可觀察到的單淀粉粒中孔洞數(shù)基本為1個(gè)，孔洞直徑較??；隨著水分含量下降，單淀粉粒中可觀察的孔洞數(shù)目增加，可見2個(gè)孔洞，且孔洞直徑也明顯增大(圖5-B)。對糯稻而言，在高水分條件下可觀察到部分淀粉粒內(nèi)存在孔洞(圖5-D1)，且隨著水分含量降低，單淀粉粒中的孔洞數(shù)目有明顯增多的趨勢，多數(shù)淀粉粒內(nèi)可見2~3個(gè)孔洞(圖5-B，圖5-D2，D3)。

A－武育粳3號; B－日本晴; C－關(guān)東194; D－廣陵香糯; E－太湖糯。1－正常掰斷處理; 2－液氮冷凍處理; 3－正常掰斷后雙面刀片處理。箭頭示淀粉粒內(nèi)孔洞。標(biāo)尺=20 μm。

Fig. 3. Scanning electron microscopic images ofgrain cross-section obtained by different methods.

此外，關(guān)東194和廣陵香糯樣品也表現(xiàn)出相似的趨勢，即隨著水分含量的降低，單淀粉粒中的孔洞數(shù)目和直徑有增大的趨勢(圖5-B~F)。該烘干處理實(shí)驗(yàn)表明，對于軟米和糯米而言，高水分含量條件下稻米淀粉粒中的空腔數(shù)目少且體積小，因此表現(xiàn)為外觀透明，而隨著水分的減少，淀粉粒中的空腔數(shù)目增多，體積變大，因此造成了暗胚乳或蠟質(zhì)表型的出現(xiàn)。

2.5 不同稻米淀粉粒比較

稻米胚乳斷面觀察無法系統(tǒng)分析淀粉粒的完整形態(tài)結(jié)構(gòu)和粒徑分布，為明確不同稻米淀粉粒表面結(jié)構(gòu)和粒徑是否存在差異，進(jìn)一步分離了不同品種稻米的淀粉，并對淀粉粒進(jìn)行了SEM分析。通過比較發(fā)現(xiàn)，無論是秈稻還是粳稻，不同品種稻米的淀粉粒都非常規(guī)則，表面存在較淺的小孔(圖6小箭頭所示)，分析認(rèn)為這些孔洞是在胚乳發(fā)育后期，淀粉體中蛋白體由于受擠壓而陷入淀粉粒所形成的[10]。另外，暗胚乳樣品中偶爾可以觀察到開裂的淀粉粒，尤其是糯稻來源的淀粉粒中間有明顯的孔洞(圖6-C~E, H~J大箭頭所示)，這與籽粒斷面的掃描結(jié)果非常吻合，進(jìn)一步證明了上述的觀察結(jié)果。此外，部分樣品中存在淀粉粒碎片，分析與研磨過度有關(guān)，該現(xiàn)象在品種間沒有顯著的差異。進(jìn)一步統(tǒng)計(jì)了不同品種淀粉粒的大小和粒徑分布，發(fā)現(xiàn)不同品種間淀粉粒平均直徑存在一定差異，平均直徑從4.5 μm到6.5 μm不等，但是這些差異與品種的外觀以及AAC沒有明顯的相關(guān)性。從淀粉粒徑分布曲線來看，秈稻背景下幾個(gè)品種間的粒徑分布相差較大(圖6-K)，而5個(gè)粳稻淀粉的粒徑分布較為集中(圖6-L)。總體來看，不同品種間淀粉粒大小和分布沒有明顯的規(guī)律性。

A－清蘆占11; B－9311; C－滇屯502; D－鴨血糯; E－蘇御糯; F－武育粳3號; G－日本晴; H－關(guān)東194; I－廣陵香糯; J－太湖糯。箭頭示淀粉粒內(nèi)孔洞。2和3分別為1和2圖中方框的放大圖片。

Fig. 4. Scanning electron microscopic images of rice grain cross-section obtained by the liquid nitrogen freezing treatment.

表2?不同品種水稻稻米單個(gè)淀粉粒斷面孔洞比較

A－不同烘干處理的稻米外觀。B－不同烘干處理的淀粉?？锥磾?shù)目和孔洞大小; C－滇屯502; D－蘇御糯; E－關(guān)東194; F－廣陵香糯。

Fig. 5.Rice grain appearance and scanning electron microscopic images of grain cross-section.

3 討論

稻米透明度是育種專家和廣大消費(fèi)者關(guān)注的性狀，也是優(yōu)質(zhì)稻米定級的一個(gè)重要指標(biāo)，該性狀受多種因素影響，如含水量、粒形、堊白度、生長環(huán)境等[11-13]。一般常規(guī)的粳稻和秈稻稻米在透明度評價(jià)中都能夠達(dá)到優(yōu)質(zhì)稻米的要求，然而對于近年來大量上市的軟米而言，在水分含量較低的情況下由于稻米透明度極顯著下降而往往達(dá)不到優(yōu)質(zhì)稻米標(biāo)準(zhǔn)。關(guān)于暗胚乳稻米乃至糯稻稻米透明度的形成存在不同的觀點(diǎn)，本研究通過優(yōu)化稻米橫斷面斷裂方式明確了液氮脆斷法是觀察單個(gè)淀粉粒斷面的有效方式，同時(shí)，通過在秈稻和粳稻背景下對具有不同透明度的稻米胚乳淀粉粒排列方式以及內(nèi)部結(jié)構(gòu)和大小等指標(biāo)進(jìn)行了系統(tǒng)的分析，明確了暗胚乳和糯稻中淀粉粒中間的空腔是暗胚乳形成的主要原因，這與堊白稻米中部分不透明區(qū)域的松散淀粉粒排列方式明顯不同[14]。目前在稻米外觀品質(zhì)研究方面主要集中在稻米堊白粒率和堊白度方面，一般認(rèn)為堊白度高的稻米透明度較差，在遺傳調(diào)控方面已經(jīng)克隆了系列相關(guān)基因或QTL，并且對其形成的機(jī)制有了一定的了解[15-16]。然而在稻米透明度的遺傳調(diào)控和形成機(jī)制方面研究較少，且沒有明確的直接調(diào)控基因被鑒定到。與之相反的是在對于一些暗胚乳突變的研究表明，GBSSⅠ的一些低酶活自然突變或者轉(zhuǎn)基因修飾的低酶活蛋白，由于合成較少的直鏈淀粉(13%以下)而使稻米表現(xiàn)出半透明的表型，說明兩者具有直接的相關(guān)性[17-19]。此外，通過對一些水稻粉質(zhì)突變體的研究，發(fā)現(xiàn)胚乳中儲(chǔ)藏蛋白的錯(cuò)誤轉(zhuǎn)運(yùn)也會(huì)導(dǎo)致稻米不透明[20-21]，當(dāng)然也有部分粉質(zhì)突變體(包括高堊白突變體)與胚乳的灌漿和直鏈淀粉的含量有關(guān)[22-24]，但通過胚乳橫斷面的掃描電鏡觀察發(fā)現(xiàn)，上述粉質(zhì)突變或高堊白突變的不透明表型主要是是由于淀粉粒的排列松散所造成的，而與本研究中所觀察到的淀粉粒中的孔洞沒有關(guān)系。

A－清蘆占11; B－9311; C－滇屯502; D－鴨血糯; E－蘇御糯; F－武育粳3號; G－日本晴; H－關(guān)東194; I－廣陵香糯; J－太湖糯。K－秈米粒徑分布; L－粳米粒徑分布。小箭頭示淀粉粒表面小孔，大箭頭示淀粉粒內(nèi)孔洞。

Fig. 6. Scanning electron microscopic images of isolated starch from different cultivars.

有關(guān)淀粉?？锥唇Y(jié)構(gòu)的發(fā)現(xiàn)實(shí)際上早在1981年就有報(bào)道，但僅在糯稻中有發(fā)現(xiàn)，且其是否與透明度和直鏈淀粉含量有關(guān)并不清楚[8]。最近，本課題組通過對不同人工修飾的GBSSⅠ轉(zhuǎn)基因材料分析發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)基因稻米的AAC越低，稻米透明度越差，稻米淀粉粒中間的空腔也越多[7]，因此，認(rèn)為AAC與稻米透明度以及淀粉粒中的空腔數(shù)目有著直接聯(lián)系。然而在常規(guī)栽培品種中這種關(guān)聯(lián)是否存在并不清楚。為明確這種相關(guān)性，本研究通過選用具有不同AAC的秈稻和粳稻品種，通過方法優(yōu)化和統(tǒng)計(jì)分析，進(jìn)一步明確了這種現(xiàn)象在普通栽培稻中普遍存在，并且發(fā)現(xiàn)稻米透明度隨著淀粉粒中央孔洞的數(shù)目和尺寸的增加而下降，說明淀粉粒中的空腔是造成暗胚乳和蠟質(zhì)胚乳的直接原因?？涨坏拇嬖诓粌H造成了較差的外觀，而且直接造成了胚乳中可儲(chǔ)藏淀粉總量的減少，從而影響稻米潛在的產(chǎn)量和品質(zhì)。從空腔的形成來看，梯度烘干實(shí)驗(yàn)表明在高水分含量條件下，淀粉粒中存在極少的空腔且空腔體積小，說明單淀粉粒在高水分含量時(shí)其中的淀粉分子分布比較均勻，而在干燥失水的過程中，可能由于淀粉粒中直鏈和支鏈淀粉之間的結(jié)合不夠緊密，或者結(jié)合態(tài)水在低直鏈淀粉含量的情況下更容易釋放，而造成淀粉粒內(nèi)部結(jié)構(gòu)的不均一，從而拉伸出現(xiàn)空腔。從目前優(yōu)質(zhì)稻米的選育來看，培育中低直鏈淀粉含量水稻品種是當(dāng)下培育優(yōu)良食味稻米的重要途徑，尤其是一些軟米品種的大面積推廣使得通過提高AAC來改善稻米透明度變得難以實(shí)現(xiàn)。當(dāng)然，從目前軟米的銷售來看，通過對高水分含量稻米的真空包裝可以保證軟米的較好外觀，但在開袋食用后會(huì)造成水分含量降低從而不可避免的出現(xiàn)暗胚乳表型。從胚乳淀粉?？锥闯霈F(xiàn)的位置來看，淀粉粒的早期發(fā)育過程可能與孔洞的形成密切相關(guān)，目前水稻中尚未有相關(guān)基因被克隆，但在擬南芥中發(fā)現(xiàn)淀粉合成酶SS4與淀粉粒導(dǎo)向蛋白PTST(protein targeting to starch)協(xié)同起始淀粉粒的合成[25-26]。因此，在水稻中是否可以通過修飾淀粉粒起始合成相關(guān)基因來改變淀粉粒內(nèi)部淀粉分子間的組織結(jié)構(gòu)來提高稻米透明度可能是今后培育透明且具優(yōu)良食味稻米新品種的一個(gè)努力方向。

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Scanning Electron Microscopic Analysis of Grain Cross-section from Rice with Different Transparency

LU Yan1,2, ZHANG Xiaomin2,3, QI Yan2,3, ZHANG Changquan1, LING Yuping3, LIU Qiaoquan1,*

(Jiangsu Key Laboratory for Crop Genetics and Physiology / Key Laboratory of Plant Functional Genomics of Ministry of Education / Co-Innovation Center for Modern Production Technology of Grain Crops, Yangzhou University, Yangzhou, China;2Instrumental Analysis Center, Yangzhou University, Yangzhou 225009, China;3College of Horticulture and Plant Protection, Yangzhou University, Yangzhou 225009, China;)

【Objective】 The objective of this study was to set up an ideal method of observation of a single starch granule cross-section, to clarify the relationship between rice transparency and amylose content and to find the structure foundation that caused the poor rice transparency. 【Method】 The pre-treated rice grain cross-section and isolated starch were observed under a scanning electron microscopy.【Result】The transparency of bothandsoft rice with amylose contentbelow 15%was significantly decreased. By comparingdifferent methods of grain cross-section pre-treatments, we found that the direct mechanical fracture method can’t break a single starch granule and the mechanical fracture with glass scraping method could break down an individual starch granule, however, it will cause rough surface and thus difficult to be analyzed quantitatively. As for the liquid nitrogen fracture method, we found it’s an ideal way to break a single starch granule and the cavity in starch granule can be easily observed. We then further analyzed the starch granule arrangement and the internal structure of an individual starch granule in paddy rice from bothandrice cultivars. We found that all the starch granules arranged tightly and obvious air containing space was observed in an individual starch granule from grains of all dark endosperm rice. Also, we found that the number and area of starch granule cavity in glutinous rice was significantly higher than those in dark endosperm rice. Furthermore, we proved that the number and area of starch granule cavity increased as the grain moisture content decreased.【Conclusion】The direct liquid nitrogen fracture treatment of rice grain cross-section is an ideal method for the single starch granule cross-section observation. Besides, the rice grain transparency showed a close relationship with the moisture content and also the number and size of cavity in the middle of a starch granule but not the starch granule arrangement. Moreover, the size and number of cavities increased as the amylose content decreased.

L.; starch; scanning electron microscopy; transparency; cavity

Corresponding author, E-mail: qqliu@yzu.edu.cn

Q944.6; S511.01

A

1001-7216(2018)02-0189-11

2017-09-01；

2017-11-15。

江蘇省自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(BK20160464)；江蘇省高校自然科學(xué)研究面上項(xiàng)目(16KJB210011)；國家重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃資助項(xiàng)目(2016YFD0100501)；國家轉(zhuǎn)基因?qū)ｍ?xiàng)(2016ZX08001006)；國家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(31561143008; 31401354)。

通訊聯(lián)系人, E-mail: qqliu@yzu.edu.cn

10.16819/j.1001-7216.2018.7107