單增李斯特菌、副溶血弧菌和沙門氏菌液相芯片檢測方法的建立

黨亞麗 周亭屹

摘 要：目的是建立一種快速檢測單增李斯特菌、副溶血弧菌和沙門氏菌的液相芯片檢測方法。采用基于間接競爭法的原理，將3種細菌抗原分別與不同的聚苯乙烯微球偶聯(lián)，以藻紅蛋白（PE）熒光標記二抗為信號，優(yōu)化反應條件，對建立的方法進行靈敏度、特異性和可重復性驗證。結(jié)果顯示，3種細菌檢測抗體最佳加入量分別為10ng、10ng、5ng，建立的方法檢測單增李斯特菌、副溶血弧菌和沙門氏菌的最低檢測限均可達到103 CFU/mL，檢測其他常見食源性致病菌無交叉反應。結(jié)論表明，建立了一種快速檢測食品中金黃色葡萄球菌的液相芯片檢測方法，能夠應用于實際樣品的檢測。

關(guān)鍵詞：單增李斯特菌 副溶血弧菌 沙門氏菌 液相芯片 檢測

前言

近年來，食源性疾病已成為世界上最突出、最廣泛的食品安全問題，病原微生物引起的食源性疾病則是影響食品安全的最主要因素之一[ 1 ]。微生物性食物中毒事件主要由食物污染或變質(zhì)、生熟交叉污染等原因引起，且氣溫較高、氣候潮濕的環(huán)境適于細菌生長繁殖，導致食物易于腐敗變質(zhì)，一旦儲存、加工不當，極易發(fā)生由沙門氏菌、副溶血性弧菌等微生物引起的食物中毒?，F(xiàn)行檢測手段已無法滿足日常對食源性致病菌檢測的需要，目前檢驗檢疫工作中常用于檢測和鑒定食源性致病菌的方法主要有PCR、Southem Blot雜交、酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA）等一些簡單的分子生物學和免疫學方法[ 2 ]?，F(xiàn)行的檢測方法一般以檢測致病菌為主，需要增菌培養(yǎng)，檢測時間長，無法滿足高通量的檢測要求，遠不能滿足食品檢測的需要，市場迫切需要能同時檢測食源性致病菌的靈敏度更高、特異性更強、簡便快捷的高通量技術(shù)和方法[ 3 ]。因此，目前迫切需要發(fā)展一種快速、準確的方法來檢測和追蹤病原體和污染物的來源[4]。

液相芯片技術(shù)是在流式細胞技術(shù)、酶聯(lián)免疫吸附技術(shù)和傳統(tǒng)芯片技術(shù)基礎上開發(fā)的新一代生物芯片技術(shù)和新型蛋白質(zhì)研究平臺，能同時檢測多種致病菌。邱楊等[ 5 ]通過該法建立了對沙門氏菌、單增李斯特菌、金黃色葡萄球菌、霍亂弧菌、副溶血弧菌的快速液相芯片檢測方法，檢測靈敏度達到50～100copies/mL。郭啟新等[ 6 ]建立了對金黃色葡萄球菌、單核增生李斯特氏菌、志賀氏菌的檢測方法，具有很好的特異性，檢測靈敏度分別達38、44、21CFU/mL。Sun等[ 7 ]利用該法建立了高通量的同時檢測6種食源性致病菌的方法，檢測靈敏度達到20.4×103CFU/mL，遠高于PCR。

但基于多重PCR的液相芯片技術(shù)對單管樣本進行大量不同指標的高通量多重PCR方法建立仍存在困難，至今鮮見液相芯片用于檢測多種致病菌方法建立的相關(guān)報道。將液相芯片技術(shù)應用到食源性致病菌檢測中，可在短時間內(nèi)實現(xiàn)對多個樣品同時進行多種致病菌靈敏、準確的檢測，因而有望大大提高食源性致病菌的檢測效率，在有效控制食物中毒事件的發(fā)生、食品安全控制、海關(guān)進出口檢驗檢疫、臨床診斷等方面具有廣闊的應用前景。

1 材料與方法

1.1 材料

Luminex 200液相懸浮芯片系統(tǒng)（美國Luminex公司）；4625型孔板振蕩器；ST16R冷凍離心機（美國Thermo公司）；編號No.18、No.29、No.52的微球（美國Luminex公司）。活化緩沖液：0.1mol/L NaH2P04- N a2 HP04，pH6.2；磷酸鹽緩沖液（PBS）：138mmol/L NaCI，2.7mmol/L KCl，8mmol/ L Na2HP04，1.5mmol/L KH2P04，pH7.4；洗滌緩沖液：PBS，0.05%Tween-20，pH7.4；分析緩沖液：PBS，1%BSA，pH7.4；封閉緩沖液：50mmol/L Tris，153mmol/L NaCl，2%BSA，0.05%Tween-20，pH7.4；儲存緩沖液：PBS，0.1%BSA，0.02%Tween-20，0.05%疊氮化鈉，pH7.4。菌種為本實驗室保藏與西北農(nóng)林科技大學食品實驗室饋贈。

1.2 方法

1.2.1 微球偶聯(lián)抗原

①取微球50μL（1.25×106個/mL）置于EP管，14000g離心4min，棄上清液。

②加入40μL活化緩沖液重懸微球，漩渦混合30s。

③加入50mg/mL NHS和EDC各5μL，混勻，避光室溫下旋轉(zhuǎn)混合600rpm，20min。

④加入150μL PBS，漩渦混合10s，14000g離心4min，棄上清液。

⑤用PBS洗滌3次后，加入150μL PBS重懸，再加入抗原，用PBS補齊至500μL，避光室溫旋轉(zhuǎn)混合600rpm，2h。

⑥14000g離心4min，棄上清液。

⑦加入150μL封閉緩沖液，漩渦混合15s，避光室溫旋轉(zhuǎn)混合600rpm，30min。

⑧16000g離心4min，棄上清液，加入100μL儲存緩沖液4℃保存偶聯(lián)的微球?？乖尤肓繛?0ng。1.2.2 檢測

①取出偶聯(lián)微球，恢復至室溫后漩渦30s。

②96孔板中加入100μL PBS預濕實驗孔，抽去孔內(nèi)液體，每孔中加入適量預混好的偶聯(lián)微球（約2000個），用150μL PBS洗滌兩次。

③將適量標準品或樣品分別加入合適的孔中，空白孔加入等量PBS，再加入適量的抗體，用PBS補齊各孔至100μL。

④用移液器反復抽吸混勻孔內(nèi)溶液，避光條件下37℃，600rpm振蕩60min。

⑤反應完畢后，抽去孔內(nèi)液體，用150μL PBS洗滌兩次。

⑥每孔中加入100μL經(jīng)適當稀釋的PE標記二抗，移液器反復抽吸混勻。

⑦避光條件下，37℃，600rpm振蕩45min后，抽去孔內(nèi)液體，用150μL PBS洗滌兩次。

⑧加入100μL PBS，900rpm震蕩3min重懸浮微球并混勻，置于液相芯片系統(tǒng)進行測試，每種微球讀取100個。

1.3 實驗條件優(yōu)化以及標準曲線的建立

1.3.1 最佳抗體加入量的確定

在不加樣品和標準品的情況下，分別加入對應抗體1、5、10、20和40ng，加入過量的PE標記二抗，采用液相芯片系統(tǒng)測試。

1.3.2 單一標準曲線建立

3種標準品按照一定的比例稀釋成梯度液，采用液相芯片系統(tǒng)測試。按照ELISA所采用的抑制率計算方式（抑制率B=（A0-An）/A0，其中A0為不加樣品孔MFI值；An為加標準品或者樣品孔MFI值），將各孔MFI值換算成抑制率，以抑制率為縱坐標，濃度的對數(shù)值為橫坐標，建立單一標準曲線。

1.3.3 靈敏度

用PBS緩沖液將培養(yǎng)的菌10倍系列稀釋，取1 08～102CFU/mL用已建立的方法進行檢測。每個濃度重復檢測3次，驗證該方法的靈敏度。

1.3.4 特異性

用已建立的方法檢測7種常見的食源性致病菌，每個樣品重復檢測3次，驗證該方法的特異性。

1.3.5 重復性

在1d、5d、7d用此方法分別檢測陽性菌和陰性菌，驗證該方法的重復性。

2 結(jié)果與討論

2.1 抗體加入量優(yōu)化

如圖1所示，低濃度時，隨著抗體加入量的增加，MFI值迅速升高?？贵w量增大至一定值后，種抗體的MFI值均趨于平穩(wěn)，此時抗原的位點已被全部占據(jù)。選擇MFI的拐點為最佳抗體加入量，因為此時靶標物和探針競爭結(jié)合獸藥抗體的競爭結(jié)果變化最顯著。單增李斯特菌、副溶血弧菌、沙門氏菌抗體加入量分別為10ng、10ng、5ng。

2.2 一元標準曲線建立

在加入最優(yōu)抗體量的條件下，建立了一元標準曲線。在一定濃度范圍內(nèi)，抑制率與抗原濃度呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系。單增李斯特菌方程為y=0.1935ln（x）-0.2924，R2=0.9869，副溶血弧菌方程為y=0.1748ln（x）+0.2054，R2=0.9909，沙門氏菌方程為y=0.2469ln（x）-0.1658，R2=0.9887。

2.3 靈敏度檢測

由圖3可看出，三種細菌在濃度達到103CFU/mL時仍可被檢出。因此本方法的靈敏度較高，可達到103CFU/mL。

2.4 特異性的檢測

用已建立的方法進行檢測，從圖4中可看出此方法特異性良好，與其它菌無交叉反應。

2.5 重復性試驗

在1d、5d、7d用此方法分別檢測陽性菌和陰性菌，由圖5可見陽性菌，陰性菌MFI值上下浮動都不大，可證明本方法重復性較好。

3 結(jié)論

2001年，美國FDA批準液相芯片技術(shù)可應用于臨床診斷，這是唯一由美國FDA批準用于臨床診斷的生物芯片技術(shù)。目前，液相芯片技術(shù)已應用于病原菌的檢測、腫瘤標志物的檢測、細胞因子檢測、自身免疫性疾病診斷等方面。

國家標準方法檢測食品中的病原微生物，需先對可疑樣品增菌1～2d，然后接種于平板進行分離培養(yǎng)，之后再進行生化試驗等進行鑒定，所需材料和試劑繁多，而且分型鑒定等需有經(jīng)驗的人員來完成；使用PCR檢測病原體也存在一定缺陷，特別是在大量樣本的檢測中，單一PCR費時費力，而多重PCR體系尚不成熟，擴增背景高，靈敏度和特異性較低。

本實驗建立了一種應用液相芯片技術(shù)檢測單增李斯特菌、副溶血弧菌和沙門氏菌的方法。由于整個反應過程完全在液相環(huán)境中進行，故靈敏度較高，可達到103CFU/mL；該方法特異性好，檢測選擇的幾種常見食源性致病菌，特異性可達100%。與傳統(tǒng)方法相比，本方法耗時短，4h即可完成檢測；需要樣品量少，只需10 μL的菌液。

綜上所述，本實驗建立了一種快速檢測單增李斯特菌、副溶血弧菌和沙門氏菌的液相芯片技術(shù)，其為一種優(yōu)于傳統(tǒng)檢測方法的快速、準確、高通量的新型檢測技術(shù)，在食品檢驗檢疫方面具有廣闊的開發(fā)前景。該方法的建立也為其他致病菌快速、高通量檢測提供了參考。

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浙江省醫(yī)藥衛(wèi)生項目（項目號：2014C02023）。