非融合海參溶菌酶在大腸桿菌中的表達、純化及酶活鑒定

張 　 齊，　牛 慶 昌，　姜 　 琳，　黃 　 君，　馬 　 俊，　叢 麗 娜，　李 　 成

( 大連工業(yè)大學(xué) 生物工程學(xué)院, 遼寧 大連　116034 )

0　引　言

溶菌酶作為海參先天免疫系統(tǒng)中的重要組成成分，是機體應(yīng)對病原菌的重要免疫應(yīng)答因子[1]。作為新型的i型海洋動物溶菌酶，它是天然的抗菌劑、免疫增強劑和防腐劑，近年來已經(jīng)成為研究的熱點。研究表明，作為典型的i型溶菌酶代表，海參溶菌酶屬于多功能蛋白，它不僅具有溶菌酶活性，還有異構(gòu)肽酶活性[2-4]。研究海參溶菌酶的生物學(xué)活性，能更好地分析其性質(zhì)、作用和功能，以便對其進行深入的研究和應(yīng)用。

國內(nèi)外已有在原核細胞和真核細胞中表達海參溶菌酶的報道，但在真核細胞中的表達仍然存在產(chǎn)量低、培養(yǎng)細胞成本高、制備純化工藝復(fù)雜等問題。而原核細胞中僅可見海參溶菌酶融合蛋白的表達，但是人為添加肽段也產(chǎn)生一些問題。融合標(biāo)簽蛋白Trx-His-S tag肽段的添加包埋了海參溶菌酶的酶活位點，抑制了蛋白的抑菌活性[5]。因為在很多研究中，真正需要的是沒有附加片段的目的蛋白質(zhì)，而額外添加的肽段(即使是很短的)會影響產(chǎn)物蛋白質(zhì)的功能，干擾實驗結(jié)果，而且融合蛋白的多余肽段對重組蛋白的活性和安全性有潛在的影響。因此，能否有效而完整地把各種融合肽段切除并再生出非融合的海參溶菌酶目的蛋白就成為后續(xù)相關(guān)研究和應(yīng)用的關(guān)鍵。

本實驗利用大腸桿菌表達系統(tǒng)獲得了重組海參溶菌酶rSjLys，利用腸激酶將其融合標(biāo)簽成功切除。成功獲得無融合標(biāo)簽、具有抑菌活性的海參溶菌酶SjLys，以期為海參溶菌酶的深入研究開發(fā)和利用提供良好的理論依據(jù)。

1　材料和方法

1.1　材　料

基因工程菌RoSetta(DE3) plysS，實驗室保存；表達載體pET32a(+)-SjLys，本實驗室構(gòu)建。Ni2+-NTA親和層析填料、重組牛腸激酶(rEK)、牛血清白蛋白，金斯瑞生物科技有限公司(南京)；蛋白Marker，大連寶生物工程有限公司；其他試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.2　方　法

1.2.1rSjLys的表達

通過熱激法將實驗室構(gòu)建好的表達載體pET32a(+)-SjLys，轉(zhuǎn)化大腸桿菌宿主RoSetta(DE3) plysS。Amp+抗性篩選陽性重組子RoSetta(DE3) plysS-pET32a(+)-SjLys。

將基因工程菌過夜活化獲得種子液，再按照1%的接種量轉(zhuǎn)接到500 mL LB發(fā)酵培養(yǎng)基中，在37 ℃、160 r/min條件下發(fā)酵至OD600 nm0.7左右時，加入誘導(dǎo)劑IPTG，使終濃度為0.5 mmol/L，誘導(dǎo)重組海參溶菌酶蛋白的表達。在28 ℃、120 r/min 下培養(yǎng)15 h[6]，低溫離心收集菌體。將菌體用PBS清洗兩次后于-80 ℃凍存。

1.2.2rSjLys的分離純化及鑒定

菌體細胞經(jīng)過凍融處理后超聲破碎。將樣品在低溫條件下離心收集上清液。將上清液過濾后，上樣Ni2+-NTA親和層析柱。以30 mmol/L咪唑沖洗未結(jié)合的雜蛋白，通過不同濃度的咪唑?qū)δ康牡鞍走M行洗脫。12% SDS-PAGE檢測蛋白的純化情況及其純度。

1.2.3rSjLys的三級結(jié)構(gòu)預(yù)測

使用表達載體pET32a(+)表達外源海參溶菌酶時，會在目的蛋白的N端附加上較大的融合標(biāo)簽蛋白Trx-His-S tag，分子質(zhì)量17.9 ku，形成重組融合海參溶菌酶蛋白。利用Swiss model(https://swissmodel.expasy.org/)的同源建模對重組海參溶菌酶的三級結(jié)構(gòu)進行預(yù)測。在First approach mode中輸入目的蛋白的全長氨基酸序列，在線進行同源序列比對后建模。利用能量最小化原理，預(yù)測了重組海參溶菌酶rSjLys的三級結(jié)構(gòu)。

1.2.4rSjLys的腸激酶酶切

為獲得SjLys，需人工去除融合標(biāo)簽蛋白Trx-His-S tag，從而釋放SjLys目的蛋白。實驗采用重組牛腸激酶，其N端帶有6個組氨酸標(biāo)簽，特異性酶切Trx-His-S tag和海參溶菌酶之間的酶切位點DDDK[7-9]。

經(jīng)實驗發(fā)現(xiàn)，5 U的重組牛腸激酶在溫度22 ℃ 的條件下酶切16 h能夠完全裂解15 μg的蛋白，建立的腸激酶酶切反應(yīng)體系能夠完全地將標(biāo)簽蛋白Trx-His-S tag和SjLys分開。實驗體系：10×重組牛腸激酶反應(yīng)緩沖液5 μL，0.3 mg/mL融合蛋白40 μL，5 U/μL重組牛腸激酶2.5 μL，再補充4.5 μL ddH2O至總體積50 μL。反應(yīng)條件：22 ℃，16 h[10]。酶切結(jié)束后，用15%的SDS-PAGE電泳檢測酶切效果。

1.2.5SjLys的純化

將酶切后的溶液上樣Ni2+-NTA親和層析柱，直接收取上樣流出液；再用漂洗緩沖液沖洗，收集流出液；最后用含有400 mmol/L 咪唑的洗脫液洗脫Ni2+-NTA并收集流出液中的標(biāo)簽蛋白。純化結(jié)束后，用15% SDS-PAGE電泳檢測海參溶菌酶的純化結(jié)果。

1.2.6SjLys抑菌活性的檢測

以溶壁微球菌作為指示菌，采用牛津杯法分別檢測重組融合海參溶菌酶及非融合海參溶菌酶的抑菌活性[11-13]。將100 μL溶壁微球菌接種在10 mL的LB液體培養(yǎng)基中，37 ℃、180 r/min、12 h 過夜培養(yǎng)。在LB固體培養(yǎng)基上均勻涂布100 μL過夜培養(yǎng)的指示菌，放上已滅好菌的牛津杯，向杯中加入200 μL樣品過夜培養(yǎng)，檢測抑菌活性[14]。

2　結(jié)果與討論

2.1　rSjLys的表達及純化

重組質(zhì)粒pET32a(+)-SjLys轉(zhuǎn)化E.coli感受態(tài)RoSetta(DE3) plysS細胞，氨芐抗性篩選陽性重組子RoSetta(DE3) plysS/pET32a(+)-SjLys。通過IPTG誘導(dǎo)基因工程菌，表達重組融合海參溶菌酶蛋白rSjLys，SDS-PAGE檢測結(jié)果如圖1所示。與未加誘導(dǎo)劑IPTG的菌體上清液比較(lane 1)，加入誘導(dǎo)劑后，RoSetta(DE3)plysS/pET32a(+)-SjLys菌株在29.0 ku附近多出一條明顯的高豐度蛋白條帶(lane 2)。標(biāo)簽蛋白Trx-His-S tag的分子質(zhì)量約為17.9 ku，SjLys的分子質(zhì)量為14.3 ku，因此目的重組融合海參溶菌酶的實際分子質(zhì)量應(yīng)為29.2 ku。說明成功表達了目的蛋白rSjLys。

M， marker；1，誘導(dǎo)前；2，誘導(dǎo)后；3～5，分別為100、200、300 mmol/L咪唑純化后的蛋白

對rSjLys進行分離、純化。從圖1可以看出，100和200 mmol/L的咪唑就能將部分目的蛋白洗脫，但是具有明顯的雜蛋白(lane 3，lane 4)。而300 mmol/L的咪唑洗脫下來的目的蛋白經(jīng)過BandScan5.0分析表明，目的蛋白rSjLys的純度大于99%。實驗結(jié)果表明，工程菌RoSetta(DE3) plysS/pET32a(+)-SjLys經(jīng)IPTG誘導(dǎo)后，在菌體上清液中成功表達了融溶狀態(tài)的rSjLys。經(jīng)過咪唑梯度洗脫后，成功獲得了高純度的重組融合海參溶菌酶蛋白。

2.2　rSjLys三級結(jié)構(gòu)的模擬

基因工程菌經(jīng)表達載體pET32a(+)表達的外源蛋白會在目的蛋白的N端附加上較大的融合Trx-His-S tag標(biāo)簽蛋白。本實驗通過Swiss model蛋白結(jié)構(gòu)預(yù)測分析在線軟件，對rSjLys的三級結(jié)構(gòu)進行預(yù)測。結(jié)果如圖2所示，海參溶菌酶會形成以α螺旋為主要二級結(jié)構(gòu)的高度折疊態(tài)(紅色和綠色區(qū)域)，標(biāo)簽蛋白的氨基酸序列能在海參溶菌酶蛋白的N末端折疊成獨立的、完整的結(jié)構(gòu)域。

圖2　rSjLys的三級結(jié)構(gòu)模擬圖

研究表明，海參溶菌酶溶解細菌，通過蛋白的N端結(jié)構(gòu)域水解細胞壁中的N-乙酰胞壁酸和N-乙酰氨基葡糖之間的β-1，4糖苷鍵，使細胞壁中不溶性黏多糖分解成可溶性糖肽，導(dǎo)致細胞壁破裂內(nèi)容物逸出從而殺死細菌。對融合海參溶菌酶蛋白的結(jié)構(gòu)預(yù)測發(fā)現(xiàn)，融合標(biāo)簽Trx-His-S tag所形成的結(jié)構(gòu)域主要集中在海參溶菌酶的側(cè)端(圖2)。因此，融合標(biāo)簽會在很大程度上影響目的蛋白的抑菌活性。另外，額外添加的融合蛋對開發(fā)利用rSjLys的安全性也會有潛在的影響。

2.3　SjLys的制備與純化

融合標(biāo)簽Trx能在蛋白質(zhì)的形成過程中幫助蛋白質(zhì)進行正確折疊，有助于提高蛋白質(zhì)復(fù)性效率，并具有提高基因表達產(chǎn)量等優(yōu)點。表達成功后，利用工具酶從融合蛋白釋放目的蛋白。目前去除融合標(biāo)簽的策略主要有化學(xué)裂解法[15]和酶裂解法[16]兩種，酶裂解法因特異性較高、反應(yīng)條件較溫和，成為目前較為常用的裂解方法。腸激酶是最常用的裂解酶，它對融合蛋白N端的Asp-Asp-Asp-Asp-Lys位點有很高的特異性，并在識別位點的C端進行切割，從而保證獲得不帶任何附加氨基酸、與天然多肽氨基酸序列完全一致的目的蛋白。

將實驗純化所得的rSjlys，用N端帶有6個組氨酸標(biāo)簽的重組牛腸激酶進行酶解，以切除標(biāo)簽蛋白Trx-His-S tag序列，釋放目的蛋白SjLys。實驗結(jié)果如圖3所示，純化獲得的重組蛋白rSjlys(lane 2)，被rEK徹底酶解成兩部分肽段，Trx-His-S Tag和Sjlys (lane 1)。表明實驗通過腸激酶，有效、完整地切開了rSjLys的融合肽段Trx-His-S tag，釋放了目的蛋白。

M， marker；1， rEK酶切后；2， rEK酶切前

采用的rEK為重組蛋白，其N末端帶有6個組氨酸標(biāo)簽，rSjLys重組融合標(biāo)簽Trx-His-S tag也帶有6個組氨酸標(biāo)簽。由實驗可結(jié)果知，酶切下來的海參溶菌酶不帶有任何標(biāo)簽序列。所以酶解完全的樣品可以利用Ni2+-NTA親和層析柱進行分離、純化。將酶切完全的樣品用鎳離子親和色譜柱純化。其中，rEK和融合標(biāo)簽由于含有組氨酸標(biāo)簽，可以特異性結(jié)合鎳柱上的Ni2+離子；而海參溶菌酶由于缺少這樣的親和位點，酶解液上樣后將直接穿過柱子。

利用15%的SDS-PAGE對純化回收后的產(chǎn)物進行檢測，結(jié)果如圖4所示，樣品中目的蛋白SjLys直接穿柱流出(lane 3)，其分子質(zhì)量約為14 ku，與實際SjLys分子質(zhì)量大小相符。經(jīng)BandScan 5.0分析表明，目的蛋白SjLys的純度大于99%。標(biāo)簽蛋白幾乎全部結(jié)合在親和柱上(lane 4)。

結(jié)果表明，本實驗通過rEK酶切、分離、純化成功獲得了非融合海參溶菌酶SjLys蛋白。

2.4　SjLys的酶活性檢測

以溶壁微球菌為指示菌，牛津杯法檢測蛋白的抑菌活性，如圖5所示。通過與陰性空載對照、rSjLys比較，結(jié)果表明SjLys對溶壁微球菌具有明顯的抑制作用。表明帶有標(biāo)簽序列的rSjLys在原核宿主Rosetta宿主內(nèi)以融溶狀態(tài)表達，但是，融合標(biāo)簽確實對蛋白的抑菌活性區(qū)域具有屏蔽作用(圖2)。根據(jù)模擬的SjLys的三級結(jié)構(gòu)，由于SjLys蛋白的抑菌活性位點主要集中在N末端，標(biāo)簽序列對SjLys的活性有影響，所以原核表達出的rSjLys抑菌活性明顯缺失，切掉標(biāo)簽后的非融合蛋白SjLys對指示菌溶壁微球菌表現(xiàn)出明顯的抑菌效果。同時，也在一定程度上證明了，即使有標(biāo)簽蛋白的屏蔽作用，目的蛋白SjLys的高級結(jié)構(gòu)在原核宿主內(nèi)可以正確折疊。

M， marker；1，酶切前；2，酶切后；3，上樣流出液；4， 400 mmol/L咪唑純化后的蛋白

圖4rSjLys腸激酶酶切產(chǎn)物SjLys的純化回收

Fig.4Enterokinase digestion of rSjLys and purification and recovery of SjLys

(a) 陰性對照

(b) rSjLys

(c) SjLys

圖5SjLys抑菌活性的檢測

Fig.5Antimicrobial activity of SjLys

3　結(jié)　論

實驗利用Ni2+-NTA純化獲得了高純度的重組海參溶菌酶。進一步利用重組牛腸激酶對重組蛋白的標(biāo)簽進行酶切，再通過親和層析進行純化，制備出非融合海參溶菌酶SjLys。抑菌結(jié)果表明，體外純化的非融合海參溶菌酶蛋白對溶壁微球菌具有明顯的抑菌活性。本實驗通過一系列的酶切、純化等步驟，體外成功獲得了具有抑菌活性的非融合海參溶菌酶蛋白。

參考文獻:

[1] BECK G, HABICHT G S. Immunity and the invertebrates[J]. Scientific American, 1996, 275(5): 60-66.

[2] JOSKOVA R, SILEROVA M, PROCHAZKOVA P, et al. Identification and cloning of an invertebrate-type lysozyme fromEiseniaandrei[J]. Developmental and Comparative Immunology, 2009, 33(8): 932-938.

[3] ZAVALOVA L L, BASKOVA I P, LUKYANOV S A, et al. Destabilase from the medicinal leech is a representative of a novel family of lysozymes[J]. Biochimica et Biophysica Acta, 2000, 1478(1): 69-77.

[4] TAKESHITA K, HASHIMOTO Y, UEDA T, et al. A small chimerically bifunctional monomeric protein:Tapesjaponicalysozyme[J]. Cellular and Molecular Life Sciences, 2003, 60(9): 1944-1951.

[5] 武瑤,梁雯婧,李成,等.熱處理對海參溶菌酶C端多肽的抑菌活性和結(jié)構(gòu)的影響[J].高等學(xué)?；瘜W(xué)學(xué)報,2014,35(5):1044-1050.

[6] 常藝海,叢麗娜,盧冬,等.重組海參溶酶基因工程菌的構(gòu)建及原核表達[J].大連工業(yè)大學(xué)學(xué)報,2012,31(6):391-394.

[7] 趙陽,黃鶴.利用腸激酶加工融合蛋白的方法制備rhIL-11[J].中國實驗血液學(xué)雜志,2008,16(4):903-909.

[8] 修朝陽,周賀鉞,俞瓔,等.利用腸激酶加工融合蛋白的方法制備重組人甲狀旁腺素(1～34)肽[J].生物化學(xué)與生物物理學(xué)報,2002,34(4):469-474.

[9] 易進華,王羅春,張元興.重組腸激酶酶切Trx-rPA融合蛋白的研究[J].中國醫(yī)藥工業(yè)雜志,2007,38(6):419-422.

[10] 盧雪梅,黃演婷,金小寶,等.重組融合蛋白Trx-IFN-CSP的腸激酶酶切及純化[J].生物技術(shù),2015,25(5):491-494.

[11] 姜啟晨,叢麗娜,宋明徽,等.海參溶菌酶C端多肽在畢赤酵母中的重組表達[J].大連工業(yè)大學(xué)學(xué)報,2013,32(6):395-398.

[12] 王秀霞,叢麗娜,王丹,等.海刺參i-型溶菌酶基因的重組表達及抑菌譜分析[J].生物工程學(xué)報,2009,25(2):189-194.

[13] CONG L N, YANG X J, WANG X X, et al. Characterization of an i-type lysozyme gene from the sea cucumberStichopusjaponicus, and enzymatic and non-enzymatic antimicrobial activities of its recombinant protein[J]. Journal of Bioscience and Bioengineering, 2009, 107(6): 583-588.

[14] 劉興敏,何自福,李華平,等.溶菌酶基因合成及其原核表達[J].華南農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報,2007,28(1):55-57.

[15] BOUMAIZA M, JAOUEN M, DESCHEMIN J C, et al. Expression and purification of a new recombinant camel hepcidin able to promote the degradation of the iron exporter ferroportin1[J]. Protein Expression and Purification, 2015, 115: 11-18.

[16] RYAN R O, FORT T M, ODA M N. Optimized bacterial expression of human apolipoprotein A-I[J]. Protein Expression and Purification, 2003, 27(1): 98-103.