谷氨酰轉(zhuǎn)肽酶基因工程菌發(fā)酵條件優(yōu)化的研究

王夢(mèng)婷，徐禮生，柴存寶，彭　靜，孫　玥，王　昕

(宿州學(xué)院 生物與食品工程學(xué)院，安徽 宿州　234000)

谷氨酰胺轉(zhuǎn)肽酶，簡(jiǎn)稱GGT，GGT是生物體內(nèi)谷胱甘肽代謝途徑的關(guān)鍵酶之一，大部分主要存在于腎、肝和脾等組織中[1-2]。正常人的血清中的谷氨酰胺轉(zhuǎn)肽酶來自于肝臟，用谷氨酰對(duì)硝基苯胺法測(cè)得正常的含量為3到50 U/L。谷氨酰胺轉(zhuǎn)肽酶是食管癌病變的標(biāo)記酶[3-5]。谷氨酰胺轉(zhuǎn)肽酶對(duì)生物體內(nèi)氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)過程起著重要的作用，因此可以作為生物體代謝情況的指標(biāo)[6]。本實(shí)驗(yàn)利用前期篩選出性能較穩(wěn)定的谷氨酰胺轉(zhuǎn)肽酶基因工程菌，通過建立一系列單因素實(shí)驗(yàn)優(yōu)化發(fā)酵培養(yǎng)基組成成分，以提高培養(yǎng)基發(fā)酵菌種的能力，通過提高大腸桿菌谷氨酰胺轉(zhuǎn)肽酶基因工程菌的產(chǎn)量進(jìn)而來提高谷氨酰胺轉(zhuǎn)肽酶的產(chǎn)量，為谷氨酰胺轉(zhuǎn)肽酶的生產(chǎn)提供參考。

1　材料與方法

1.1　主要試劑和儀器設(shè)備

主要試劑: 魚粉蛋白胨、酵母浸粉均為生化試劑；乳糖、氯化鈉、氫氧化鈉；抗生素氨芐(AMP)。主要儀器: 電子天平，上海雷韻試驗(yàn)儀器制造有限公司；PHS-3C Ph計(jì)，上海儀電科學(xué)儀器股份有限公司；立式自動(dòng)壓力蒸汽滅菌鍋，上海博訊實(shí)業(yè)有限公司；恒溫振蕩培養(yǎng)箱，上海智城分析儀器制造有限公司；WT-ZNO無菌操作臺(tái)，鄭州中旺實(shí)驗(yàn)室設(shè)備有限公司；可見分光光度計(jì)721型，上海儀電科學(xué)儀器股份有限公司。

1.2　方法

1.2.1菌種的活化

菌種活化是將上述凍藏的原始菌種按照3%的接種量接種于LB液體培養(yǎng)基中，經(jīng)計(jì)算本實(shí)驗(yàn)需要用微量進(jìn)樣器吸取100微升原始菌種于每支裝有3 mL LB液體培養(yǎng)基的試管中，之后還要加入7μL 的抗生素氨芐，以上操作在無菌操作臺(tái)進(jìn)行，然后在37℃、170 r/min下于振蕩培養(yǎng)箱中培養(yǎng)10 h。重復(fù)上述操作活化兩代，即共活化三代即可。

1.2.2菌種的發(fā)酵

菌種的振蕩搖瓶培養(yǎng)是將活化后的菌種按照20%的接種量接入乳糖發(fā)酵培養(yǎng)基中，經(jīng)計(jì)算本實(shí)驗(yàn)將2 mL活化后的菌種接入100 mL的乳糖發(fā)酵培養(yǎng)基中。在37℃、170 r/min下于振蕩培養(yǎng)箱中培養(yǎng)發(fā)酵4 h后再調(diào)節(jié)溫度使其降至30℃繼續(xù)于振蕩培養(yǎng)箱中培養(yǎng)發(fā)酵8 h。

1.2.3菌量的測(cè)定

菌量的測(cè)定是將經(jīng)搖床培養(yǎng)完成后的所得菌液20倍稀釋，用721型可見分光光度計(jì)在660 nm處，測(cè)定發(fā)酵培養(yǎng)所得菌液的光密度值OD660，上清液做等量稀釋作為空白對(duì)照。

1.2.4上清液的制備

上清液的制備是將上述發(fā)酵后所得菌液在5000 r/min下于4℃離心機(jī)中離心10min得到的上清液。

1.2.5發(fā)酵培養(yǎng)基的優(yōu)化

1.2.5.1乳糖

本實(shí)驗(yàn)用乳糖作為碳源，在保持原發(fā)酵培養(yǎng)基成分比例的基礎(chǔ)上，改變?nèi)樘堑暮?，設(shè)置8個(gè)培養(yǎng)基，乳糖含量分別替換為0.35%(w/v)，0.4%(w/v)，0.45%(w/v), 0.5%(w/v)，0.55%(w/v)，0.6%(w/v)，0.65%(w/v), 0.7%(w/v)。

1.2.5.2酵母浸粉

本菌最佳發(fā)酵培養(yǎng)基氮源為酵母浸粉和魚粉蛋白胨，所以要分別對(duì)其進(jìn)行優(yōu)化建立。酵母浸粉的優(yōu)化是設(shè)置8個(gè)酵母浸粉含量不同的培養(yǎng)基，分別把基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基的酵母浸粉替換為0.35%(w/v)，0.4%(w/v)，0.45%(w/v), 0.5%(w/v)，0.55%(w/v)，0.6%(w/v)，0.65%(w/v), 0.7%(w/v)。

1.2.5.3魚粉蛋白胨

魚粉蛋白胨的優(yōu)化是在初始培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上設(shè)置8個(gè)培養(yǎng)基，魚粉蛋白胨含量分別為分別換成0.7%(w/v), 0.8%(w/v), 0.9%(w/v), 1.0%(w/v), 1.1%(w/v), 1.2%(w/v)，1.3%(w/v), 1.4%(w/v)。

1.2.5.4無機(jī)鹽氯化鈉

無機(jī)鹽對(duì)微生物的生長(zhǎng)很有意義，本實(shí)驗(yàn)以氯化鈉做為無機(jī)鹽，在初始發(fā)酵培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上，把其中的氯化鈉成分含量替換成0.35%(w/v)，0.4%(w/v)，0.45%(w/v), 0.5%(w/v)，0.55%(w/v)，0.6%(w/v)，0.65%(w/v), 0.7%(w/v)。

1.2.6顯微鏡觀察

將沒有優(yōu)化發(fā)酵培養(yǎng)基發(fā)酵得到的菌液與優(yōu)化發(fā)酵培養(yǎng)基后發(fā)酵得到的菌體經(jīng)20倍稀釋后放在倒置顯微鏡下觀察。

1.2.7統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS11.5軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差來表示數(shù)據(jù)，組間采用t檢驗(yàn)比較[7]。

2　實(shí)驗(yàn)結(jié)果與分析

2.1　單一碳源乳糖不同含量對(duì)發(fā)酵培養(yǎng)基產(chǎn)菌量的影響

乳糖為菌株發(fā)酵生長(zhǎng)的良好碳源，本實(shí)驗(yàn)設(shè)置8個(gè)培養(yǎng)基，乳糖含量分別為0.35%(w/v)，0.4%(w/v)，0.45%(w/v), 0.5%(w/v)，0.55%(w/v)，0.6%(w/v)，0.65%(w/v), 0.7%(w/v)。。發(fā)酵后于721型分光光度計(jì)下660nm處測(cè)得不同乳糖含量下發(fā)酵所得菌液光密度OD660值如圖1所示(*表示差異顯著)。

圖1　發(fā)酵培養(yǎng)基乳糖對(duì)菌液光密度的影響

圖2　乳糖含量為0.5%時(shí)(OD660=0.195)的菌液圖

根據(jù)上圖1分析可知，發(fā)酵培養(yǎng)基乳糖含量在0.35%(w/v)處菌液光密度值較低，隨著乳糖含量的增大光密度值也隨之逐漸增大，但是乳糖含量到達(dá)0.5%(w/v)時(shí)達(dá)到最大值0.195，之后再增大含量菌液光密度值不會(huì)增大反而隨之逐漸減小。而菌液光密度值越大代表著菌液量越多，所以發(fā)酵培養(yǎng)基乳糖含量為0.5%(w/v)處發(fā)酵所得菌最多，由圖2可以看出OD值大時(shí)顯微鏡圖大腸桿菌微生物要多于OD值小的，說明培養(yǎng)基的最佳乳糖含量為0.5%(w/v)。

2.2　單一氮源酵母浸粉含量的不同對(duì)發(fā)酵培養(yǎng)基產(chǎn)菌量的影響結(jié)果

酵母浸粉含量對(duì)培養(yǎng)基產(chǎn)菌量的影響是設(shè)置8個(gè)100 mL的培養(yǎng)基，酵母浸粉含量在原始培養(yǎng)基基礎(chǔ)上改為0.35%(w/v)，0.4%(w/v)，0.45%(w/v), 0.5%(w/v)，0.55%(w/v)，0.6%(w/v)，0.65%(w/v), 0.7%(w/v)。發(fā)酵完成后于721型分光光度計(jì)下660nm處測(cè)得不同酵母浸粉含量下發(fā)酵所得菌液光密度OD660值如圖3所示(*表示差異顯著)。

圖3　酵母浸粉對(duì)菌液光密度的影響

圖4　酵母浸粉含量為0.5%時(shí)(OD660=0.193)的菌液圖

根據(jù)圖3分析可知，發(fā)酵培養(yǎng)基酵母浸粉含量在0.35%(w/v)處菌液光密度值較低，隨著酵母浸粉含量的增大光密度值也隨之逐漸增大，但是酵母浸粉含量到達(dá)0.5%(w/v)時(shí)達(dá)到最大值0.193，之后再增大含量菌液光密度值不會(huì)增大反而隨之逐漸減小。而菌液光密度值越大代表著菌液量越多，由圖4可以看出OD值大時(shí)顯微鏡圖大腸桿菌微生物要多于OD值小的，說明培養(yǎng)基的最佳酵母浸粉含量為0.5%(w/v)。

2.3　單一氮源魚粉蛋白胨含量差異對(duì)發(fā)酵培養(yǎng)基產(chǎn)菌量的影響結(jié)果

魚粉蛋白含量對(duì)乳糖發(fā)酵培養(yǎng)基產(chǎn)菌量的影響實(shí)驗(yàn)是設(shè)置8個(gè)發(fā)酵培養(yǎng)基，其含量在基礎(chǔ)培養(yǎng)基上改為0.7%(w/v)，0.8%(w/v)，0.9%(w/v), 1.0%(w/v)，1.1%(w/v)，1.2%(w/v)，1.3%(w/v), 1.4%(w/v)。于721型分光光度計(jì)下660 nm處測(cè)得不同魚粉蛋白胨含量下發(fā)酵所得菌液光密度OD660值如圖5所示(*表示差異顯著)。

圖5　發(fā)酵培養(yǎng)基魚粉蛋白胨對(duì)菌液光密度的影響

圖6　魚粉蛋白胨含量為1.0%時(shí)(OD660=0.196)的菌液圖

根據(jù)圖5分析可知，發(fā)酵培養(yǎng)基魚粉蛋白胨含量在0.7%(w/v)處菌液光密度值較低，隨著魚粉蛋白胨含量的增大光密度值也隨之逐漸增大，但是魚粉蛋白胨含量到達(dá)1.0%(w/v)時(shí)達(dá)到最大值0.196，之后再增大含量菌液光密度值不會(huì)增大反而隨之逐漸減小。而菌液光密度值越大代表著菌液量越多，由圖6可以看出光密度值大的菌液觀察到的大腸桿菌微生物量多于光密度值小的，說明培養(yǎng)基的最佳魚粉蛋白胨含量為1.0%(w/v)。

2.4　無機(jī)鹽氯化鈉含量差異對(duì)發(fā)酵培養(yǎng)基產(chǎn)菌量的影響

氯化鈉為菌株發(fā)酵生長(zhǎng)的良好無機(jī)鹽，本實(shí)驗(yàn)設(shè)置8個(gè)培養(yǎng)基，氯化鈉含量分別為0.35%(w/v)，0.4%(w/v)，0.45%(w/v), 0.5%(w/v)，0.55%(w/v)，0.6%(w/v)，0.65%(w/v), 0.7%(w/v)。發(fā)酵后菌液于721型分光光度計(jì)下660nm處測(cè)得不同含量下發(fā)酵所測(cè)得菌液光密度OD660值如圖7所示(*表示差異顯著)。

圖7　發(fā)酵培養(yǎng)基NaCl對(duì)菌液光密度的影響

圖8　氯化鈉含量為0.5%時(shí)(OD660=0.197)的菌液圖

根據(jù)圖7分析可知，發(fā)酵培養(yǎng)基NaCl含量在0.35%(w/v)處菌液光密度值較低，伴隨氯化鈉的量的變大光密度值OD660也會(huì)隨之慢慢變大，但是NaCl的量到達(dá)0.5%(w/v)處OD660到達(dá)最大值，之后再增大含量菌液光密度值不會(huì)增大反而隨之逐漸減小。而菌液光密度值越大代表著菌液量越多，所以乳糖發(fā)酵培養(yǎng)基NaCl含量為0.5%(w/v)處菌液產(chǎn)量最多，說明培養(yǎng)基的最佳NaCl含量為0.5%(w/v)。從圖8中也看得出0.5%氯化鈉含量對(duì)乳糖發(fā)酵培養(yǎng)基菌體菌較多。

3　結(jié)論

在酵母浸粉的發(fā)酵培養(yǎng)基優(yōu)化實(shí)驗(yàn)中測(cè)得菌體光密度值OD660在酵母浸粉含量為0.5%時(shí)最大；在魚粉蛋白胨的發(fā)酵培養(yǎng)基優(yōu)化實(shí)驗(yàn)中測(cè)得菌體光密度值OD660在魚粉蛋白胨含量為1.0%時(shí)最大；在乳糖的發(fā)酵培養(yǎng)基優(yōu)化實(shí)驗(yàn)中測(cè)得菌體光密度值OD660在乳糖含量為0.5%時(shí)最大；在氯化鈉的發(fā)酵培養(yǎng)基優(yōu)化實(shí)驗(yàn)中測(cè)得菌體光密度值OD660在氯化鈉含量為0.5%時(shí)最大。綜合分析得結(jié)論：0.5%(w/v)的酵母浸粉，1.0%(w/v)的魚粉蛋白胨，0.5%(w/v)的乳糖，0.5%(w/v)的氯化鈉，是為最佳的乳糖發(fā)酵培養(yǎng)基組分組成。

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