川藏黑豬NR5A2基因克隆及生物信息學(xué)分析

（四川省畜牧科學(xué)研究院養(yǎng)豬研究所，四川省動物遺傳育種重點實驗室，四川成都 610000）

NR5A2屬于核受體超家族 NR5A亞家族，是一種重要的孤兒受體，與體細胞編程、動物胚胎發(fā)育及分化、類固醇激素生成和癌癥等有密切關(guān)系，在成年哺乳動物中NR5A2 主要在肝、腸和卵巢等組織中表達，特別是在卵巢組織中高表達。在卵巢組織中，NR5A2 在顆粒細胞和黃體細胞中特異表達，而在卵泡膜細胞和間質(zhì)細胞中不表達，說明 NR5A2 在卵巢顆粒細胞和黃體細胞中發(fā)揮重要作用。牛卵巢優(yōu)勢卵泡和排卵前卵泡顆粒細胞中 NR5A2 基因的表達水平極顯著高于小卵泡、黃體細胞，說明卵巢顆粒細胞中的 NR5A2 在哺乳動物卵泡發(fā)育和優(yōu)勢化過程中發(fā)揮重要的作用。NR5A2 在調(diào)控哺乳動物卵泡發(fā)育、成熟和排卵等方面具有重要作用，是雌性動物繁殖力的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子。本研究以我國自主培育豬種川藏黑豬為研究對象，采用克隆測序技術(shù)獲得川藏黑豬NR5A2 基因編碼區(qū)序列，利用生物信息學(xué)方法分析其序列特征。

1 材料與方法

1.1 試驗動物

川藏黑豬母豬來自四川省畜牧科學(xué)研究院養(yǎng)豬科研基地，杜長大商品豬來自龍泉宏業(yè)屠宰場，各3頭，所有試驗豬經(jīng)屠宰后立即采取卵巢組織樣，置于液氮中帶回實驗室，用于提取組織總RNA。

1.2 RNA提取和反轉(zhuǎn)錄

采用 Trizol 試劑（Invitrogen，USA）一步法提取卵巢組織總RNA，用反轉(zhuǎn)錄試劑盒（Promega，USA）反轉(zhuǎn)錄成 cDNA，具體步驟按說明書操作。反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物-30 ℃ 保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 NR5A2基因ORF擴增

利用ORF Finder工具，尋找NR5A2基因可能的ORF，發(fā)現(xiàn)了全長為1506bp的完整ORF。在NCBI上尋找包含NR5A2基因ORF上下游mRNA的序列為模板設(shè)計引物引物如下：Forward primer：GCTGCACTTTTTCTTACGCCA

Reverse primer：TAGTGTTGCTTAGAGCCGTTCA

1.4 NR5A2 基因編碼區(qū)克隆和測序

以川藏黑豬卵巢組織 cDNA 為模板，擴增 NR5A2 基因編碼區(qū)序列。PCR 反應(yīng)體系：1 μL 模板，1 μL dNTPs，1 μL 上、下游引物（10 μmol·L -1），2 μL 10 × Buffer，0.2 μL Taq 聚合酶（TaKaRa），加雙蒸水至終體積 20 μL。PCR 反應(yīng)條件：94 ℃ 5 min；94 ℃ 1 min，退火 30 s，72 ℃ 1 min，35 個循環(huán)；72 ℃ 10 min。PCR產(chǎn)物經(jīng) 0.8% 瓊脂糖凝膠電泳檢測，用回收試劑盒（Axygen，USA）純化，純化的目的片段與 pMD19-T 載體（TaKaRa）連接，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化 DH5α 感受態(tài)細胞；挑取陽性克隆，用質(zhì)粒提取試劑盒（Axygen，USA）提取質(zhì)粒，由Invitrogen 公司進行測序。

1.5 NR5A2 基因的序列分析

川藏黑豬 NR5A2 基因編碼區(qū)序列的整理、翻譯和比對使用DNAStar 和 DNAMAN 軟件。用 ExPASy Pro-teomics Server在線軟件預(yù)測氨基酸的理化性質(zhì)。利用BioEdit對川藏黑豬NR5A2氨基酸疏水性進行分析。采用SWISS-MODEL 在線分析軟件來進行預(yù)測NR5A2 蛋白的三級結(jié)構(gòu)。

1.6 哺乳動物 NR5A2 基因進化分析

利用 BLAST 在線軟件 從 GenBank 數(shù)據(jù)庫中獲取其他哺乳動物NR5A2 基因編碼區(qū)序列，包括虎鯨（NW_004438658.1）、綿羊（JN182926）、大熊貓（NW_003217343.1）、黑猩猩（X M_001142695）、人（NM_205860）、牛（NM_001206816）、小鼠（NM_030676）、大鼠（NM_021742）等。利用 DNAStar 軟件進行序列的整理、比對。采用 DNASP 5.0軟件統(tǒng)計多態(tài)位點，分析核苷酸多樣度（π），進行中性檢驗，計算序列間的非同義替代數(shù)（dN）、同義替代數(shù)（dS）和 dN /dS 值。利用 MEGA 5.0 軟件計算序列間的轉(zhuǎn)換數(shù)（Ts）、顛換數(shù)（Tv）、轉(zhuǎn)換 / 顛換比值（Ts / Tv），并以雞（NM_205078）為外類群，采用最大似然法構(gòu)建哺乳動物系統(tǒng)發(fā)育樹。

2 結(jié)果與分析

2.1 RNA電泳圖

川藏黑豬和商品豬組織總RNA電泳圖見圖1，根據(jù)設(shè)計的引物進行NR5A2基因PCR擴增，擴增產(chǎn)物電泳圖見圖2。

圖1 川藏黑豬和商品豬組織總RNA電泳圖

圖2 川藏黑豬和商品豬NR5A2基因PCR擴增產(chǎn)物電泳圖

2.2 NR5A2核酸堿基同源度分析

序列經(jīng)過克隆、比對，剪切，獲得了全長為1506bp的完整ORF，通過測序得知其序列組成特征見表1。Pos#1、Pos#2、Pos#3分別代表密碼子第一、二、三位。從表1可看出，A+T含量低于G+C。同源性分析發(fā)現(xiàn)NR5A2基因的核苷酸序列與虎鯨、山羊、大熊貓、黑猩猩、人、牛、小鼠、大鼠等哺乳動物的一致性分別為93.0%、91.4%、83.9%、83.7%、90.4%、91.6%、75.4%、77.9%。川藏黑豬的NR5A2基因與引物源序列（XM_021064001）一致性99.87%，共有2個非保守位點T1209C、G1451C。

表1 川藏黑豬基因NR5A2編碼區(qū)核苷酸組成特征

2.3 NR5A2氨基酸序列同源度分析和頻率分析

NR5A2基因編碼區(qū)序列編碼包含了501個氨基酸殘基的蛋白質(zhì)，如圖3所示。氨基酸使用頻率見表2。氨基酸序列同源比對發(fā)現(xiàn)川藏黑豬與虎鯨、牛、山羊、人、黑猩猩、大熊貓、大鼠、小鼠的一致性分別為86.5%、85.6%、85.6%、86.9%、86.9%、86.5%、79.8%和79.4%。

2.4 NR5A2蛋白理化性質(zhì)和疏水性分析

ExPASy顯示NR5A2基因的分子量為57.3KD，等電點理論值為8.09，Met在N端，體外半衰期30h，蛋白的不穩(wěn)定系數(shù)為51.60，預(yù)測顯示該蛋白結(jié)構(gòu)不穩(wěn)定。脂溶指數(shù)81.18，疏水性均值Grand average of hydropathicity（GRAVY）-0.385，具有較強的疏水性，見圖4。

圖3 川藏黑豬 NR5A2 基因的核苷酸序列和預(yù)測的氨基酸序列

圖4 NR5A2基因蛋白的疏水性

表2 NR5A2基因氨基酸頻率

圖5 NR5A2蛋白三級結(jié)果預(yù)測

2.5 NR5A2蛋白質(zhì)三級結(jié)果預(yù)測

三級結(jié)構(gòu)預(yù)測顯示川藏黑豬 NR5A2 蛋白主要由 11 個 α 螺旋和 2個 β 折疊組成，形成 ααααααββααααα 結(jié)構(gòu)（圖5）。

表3 NR5A2基因堿基對組成頻數(shù)

2.6 NR5A2基因進化與系統(tǒng)發(fā)育分析

利用得到的川藏黑豬NR5A2基因完整編碼區(qū)和NCBI上下載的牛、山羊、大熊貓、人、黑猩猩、虎鯨、大鼠以及小鼠的NR5A2基因的編碼區(qū)序列進行比對和剪齊，其中保守位點（C）1125個，占總位點的74.7%；變異位點（V）381個，占總位點的25.3%；簡約信息位點（Pi）277個，占變異位點72.7%；單態(tài)位點（S）104個，占總變異位點的27.3%。堿基替換變異類型中轉(zhuǎn)換數(shù)106次，顛換數(shù)57次，轉(zhuǎn)換/顛換比值R為1.85。

圖6 基于NR5A2基因構(gòu)建的哺乳動物的系統(tǒng)發(fā)育樹

根據(jù)哺乳動物 NR5A2 基因核甘酸序列，以鳥類中的雞為外類群，構(gòu)建了哺乳動物 8 個物種的系統(tǒng)發(fā)育樹，結(jié)果見圖 6。哺乳動物 9個物種明顯地聚為 4 大類：偶蹄目中的牛、羊、川藏黑豬和鯨魚首先聚為一類；奇蹄目中的馬單獨聚為一類；靈長目中的人和黑猩猩聚為一類；嚙齒目中的大鼠和小鼠聚為一類，熊貓單獨聚為一類。在偶蹄目中，?？浦信：途d羊首先聚為一類，然后與鯨魚聚在一起，再與豬聚在一起，可見系統(tǒng)發(fā)育樹與經(jīng)典的分類結(jié)果是一致的。

3 討論

NR5A2目前發(fā)現(xiàn)的核受體超家族基因是核受體（nuclear receptors，NRs）超家族中的重要一員，成員大致可以分為 7 個亞家族（即 NR0 - NR6），它們在結(jié)構(gòu)上均比較保守，一般由以下 4 個結(jié)構(gòu)域構(gòu)成：①A /B 結(jié)構(gòu)域，含有一個 AF － 2 基序；②C 結(jié)構(gòu)域，即 DNA 結(jié)合域（DNA-binding domain，DBD），這個結(jié)構(gòu)域高度保守，由 2 個鋅指組成；③D 結(jié)構(gòu)域，這個結(jié)構(gòu)域充當(dāng) DBD 和 LBD 結(jié)構(gòu)域間的鉸鏈；④E 結(jié)構(gòu)域，即配體結(jié)合域（ligand-binding domain，LBD）。NR5A2 隸屬于 NR5 亞家族 A組，在 NR5A 的所有成員中，與 DNA 結(jié)合的特異性是由 DBD 結(jié)構(gòu)域 C 末端 26 個氨基酸殘基組成的 Ftz － F1 盒（Ftz － F1 box）所決定研究發(fā)現(xiàn) NR5A2 通過 CYP19A1 基因調(diào)節(jié)雌激素（E2）的合成，從而促進大鼠顆粒細胞的增殖，本文通過克隆測序獲得了川藏黑豬 NR5A2 基因編碼區(qū)序列，發(fā)現(xiàn)其與哺乳動物其他物種核苷酸的序列的同源性為 75%～93%，氨基酸序列的同源性為79%～87%，可見 NR5A2 基因在不同哺乳動物中具有一定的保守性。進一步分析發(fā)現(xiàn)，川藏黑豬 NR5A2 蛋白與哺乳動物其他物種一樣，都具有 DNA 結(jié)合域、配體結(jié)合域和 Ftz －F1 盒等保守結(jié)構(gòu)域，推測川藏黑豬 NR5A2 蛋白與哺乳動物其他物種一樣在卵泡發(fā)育、成熟和排卵等方面具有重要作用。