hsa_circ_RNA0023397和mi 106b在活動(dòng)性克羅恩病腸黏膜組織中的表達(dá)及意義

沈朵，陳洪，李紅霞，徐孝新，尹瑩

(1.東南大學(xué) 醫(yī)學(xué)院，江蘇 南京　210009; 2.東南大學(xué)附屬中大醫(yī)院 消化科，江蘇 南京　210009)

1　材料與方法

1.1　材料

1.2　腸黏膜組織來(lái)源

腸道黏膜組織活檢標(biāo)本收集自2014年9月至2017年3月在東南大學(xué)附屬中大醫(yī)院住院患者，通過(guò)結(jié)腸鏡及病理學(xué)檢查確診為活動(dòng)期CD的患者40例，其中男性25例，女性15例；最大年齡為60歲，最小年齡為19歲，平均年齡為32.3歲。對(duì)照病例選取就診于我院接受腸鏡檢查并行腸道黏膜組織活檢的健康體檢者，經(jīng)過(guò)病理學(xué)檢查提示為正常組織，總共有40例，其中男性26例，女性14例；最大年齡為55歲，最小年齡為25歲，平均年齡為34.9歲。兩組在性別構(gòu)成比、年齡等一般情況上無(wú)顯著差別，本研究對(duì)象術(shù)前均簽署知情同意書。

1.3　circRNAs組織芯片檢測(cè)

1.4　腸黏膜組織中mi 106b的表達(dá)情況檢測(cè)

用TRIzol提取腸黏膜組織總mRNA，逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)條件:16 ℃ 30 min，42 ℃ 30 min，85 ℃ 5 min；用實(shí)時(shí)定量PCR試劑盒進(jìn)行檢測(cè)，反應(yīng)條件:95 ℃ 5 min，95 ℃ 15 s，60 ℃ 1 min，40個(gè)循環(huán)。每個(gè)樣品設(shè)置3個(gè)復(fù)孔，PCR反應(yīng)后，Ct值通過(guò)設(shè)置固定閾值確定，取3次PCR的結(jié)果求平均Ct值。miRNA相對(duì)水平通過(guò)U6校正。

1.5　腸黏膜組織中ha circ_0023397的表達(dá)情況檢測(cè)

1.6　腸黏膜組織中自噬情況檢測(cè)

1.7　腸黏膜組織中ATG16L1蛋白表達(dá)檢測(cè)

1.8　統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2　結(jié)　　果

2.1　活動(dòng)期CD腸黏膜組織中mi 106b的表達(dá)情況

2.2　circRNA組織芯片結(jié)果及活動(dòng)期CD患者病變腸道黏膜組織中hsa_circ_0023397的表達(dá)情況

本課題組利用環(huán)狀RNA芯片(Arraystar公司)，對(duì)活動(dòng)期CD病變腸道黏膜的circRNA表達(dá)譜進(jìn)行了篩查(圖2)。采用實(shí)時(shí)定量PCR方法檢測(cè)40例活動(dòng)期CD患者病變腸道黏膜組織標(biāo)本及40例正常對(duì)照標(biāo)本中hsa_circ_0023397的表達(dá)水平，發(fā)現(xiàn)活動(dòng)期CD組織中hsa_circ_0023397表達(dá)低于健康對(duì)照組(P<0.01)(圖3A)。此外，統(tǒng)計(jì)分析提示，hsa_circ_0023397診斷活動(dòng)性CD的ROC曲線下的面積為0.844(P<0.01)(圖3B)，靈敏度和特異度分別為0.80和0.85。

A.差異表達(dá)circRNA的火山圖，紅點(diǎn)代表差異表達(dá)的具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的circRNA；B.各樣本circRNA譜系聚類分析圖，每列代表每個(gè)組織樣本的表達(dá)情況，每行代表每個(gè)circRNA,紅色表達(dá)高表達(dá)，綠色代表低表達(dá)
圖2circRNA芯片檢測(cè)結(jié)果
Fig2ResultsofcircRNAchiptest

A.qPCR 檢測(cè)結(jié)果，bP<0.01，ΔCt值高表示表達(dá)量低；B.hsa_circ_0023397的ROC曲線(P<0.01)
圖3hsa_circ_0023397在活動(dòng)期CD患者病變腸道黏膜組織和健康對(duì)照兩組中的表達(dá)水平
Fig3hsa_circ_0023397expressioninintestinalmucosatissuesofpatientswithactiveCDandhealthycontrols

2.3　自噬相關(guān)蛋白LC3的表達(dá)檢測(cè)

2.4　CD相關(guān)基因ATG16L1蛋白的表達(dá)檢測(cè)

利用Western Blot檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，在活動(dòng)期CD患者腸黏膜中ATG16L1蛋白較健康對(duì)照組表達(dá)下降(P<0.05)(圖5)。

圖4活動(dòng)期CD患者和健康對(duì)照腸黏膜中LC3蛋白的表達(dá)(aP<0.05)
Fig4ExpressionofLC3proteininintestinalmucosatissuesofpatientswithactiveCDandhealthycontrols(aP<0.05)

圖5活動(dòng)期CD患者和健康對(duì)照腸黏膜中ATG16L1蛋白的表達(dá)(aP<0.05)
Fig5ExpressionofATG16L1proteininintestinalmucosatissuesofpatientswithactiveCDandhealthycontrols(aP<0.05)

3　討　　論

[參考文獻(xiàn)]

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