鴨疫里默氏菌的耐藥性及PCR檢測(cè)技術(shù)

林彬彬 林志敏 莆田市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究所 福建莆田 351144

鴨疫里默氏菌（Riemerella anatipestifer，RA），是一種屬于黃桿菌科的革蘭氏陰性菌，主要引起鴨、鵝、雞、火雞、野鴨等禽類(lèi)急性或慢性敗血癥。鴨疫里默氏菌病，也稱(chēng)為鴨傳染性漿膜炎，又名鴨疫巴氏桿菌病、新鴨病、鴨疫綜合征、鴨敗血癥。該病多見(jiàn)于8周齡以下雛鴨，尤以2～3周齡雛鴨最易感，主要有櫻桃谷鴨、番鴨、麻鴨等品種的鴨，可經(jīng)呼吸道、消化道、皮膚傷口等感染而發(fā)病，尤以腳蹼傷口最易感。感染后臨床表現(xiàn)為困倦、眼與鼻孔有分泌物、綠色下痢、共濟(jì)失調(diào)和抽搐，慢性病例出現(xiàn)斜頸，病理剖檢癥狀主要表現(xiàn)為纖維素性心包炎、肝周炎、氣囊炎，還可引起干酪性輸卵管炎、腦膜炎、結(jié)膜炎和關(guān)節(jié)炎等炎癥，導(dǎo)致禽肉品質(zhì)下降，飼料報(bào)酬降低，生長(zhǎng)周期延長(zhǎng)等間接危害[1]。有研究表明，健康鴨存在帶菌情況[2]。該病的病死率高，耐過(guò)及病愈鴨常出現(xiàn)生長(zhǎng)發(fā)育遲緩，伴有神經(jīng)癥狀而成為僵鴨，淘汰率高，給養(yǎng)鴨業(yè)帶來(lái)嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失，已成為我國(guó)養(yǎng)鴨業(yè)重點(diǎn)預(yù)防的主要細(xì)菌傳染病之一。鴨疫里默氏菌血清型眾多，目前報(bào)道共有25個(gè)血清型，在我國(guó)主要以1型、2型和10型為主[3]，各個(gè)血清型之間缺乏有效的交叉保護(hù)，且血清型和致病性之間無(wú)相關(guān)性，甚至同一血清型不同來(lái)源菌株的致病性都存在差異。

目前，對(duì)鴨疫里默氏菌病的防治主要依靠疫苗和藥物，但臨床上用藥的不規(guī)范，使得細(xì)菌耐藥現(xiàn)象和藥物殘留問(wèn)題日趨嚴(yán)重，由此引起的食品安全問(wèn)題也越來(lái)越受到人們的關(guān)注。本文就鴨疫里默氏菌的耐藥現(xiàn)狀、耐藥機(jī)制、分子生物學(xué)中PCR檢測(cè)技術(shù)的國(guó)內(nèi)相關(guān)研究進(jìn)行闡述。

1 鴨疫里默氏菌的耐藥現(xiàn)狀

國(guó)內(nèi)研究表明，我國(guó)鴨疫里默氏菌的耐藥現(xiàn)象十分嚴(yán)重，主要表現(xiàn)為雙重或多重耐藥，并且因時(shí)間地點(diǎn)的不同，菌株的耐藥性也存在一定差異。Zhong等[4]對(duì)1998-2005年我國(guó)部分地區(qū)分離的224株鴨疫里默氏菌進(jìn)行耐藥性監(jiān)測(cè)，結(jié)果表明，所有分離菌株對(duì)β-內(nèi)酰胺類(lèi)藥物顯示高水平耐藥；對(duì)阿米卡星、亞胺培南、頭孢哌酮和新霉素的耐藥率最低。張濟(jì)培等[5]對(duì)珠三角地區(qū)分離的100株鴨源及鵝源鴨疫里默氏菌進(jìn)行藥敏試驗(yàn)，結(jié)果表明，63株菌株具有雙重或多重耐藥現(xiàn)象，93%菌株對(duì)慶大霉素耐藥，97%菌株對(duì)奧格門(mén)丁敏感，其它藥物敏感度依次為大觀霉素、青霉素、環(huán)丙沙星、氨芐西林、鏈霉素、諾氟沙星、羅紅霉素、磺胺甲惡唑、利福平和卡那霉素。程龍飛等[6]對(duì)2006-2012年福建省及鄰近省份分離的423株鴨疫里默氏菌進(jìn)行藥敏試驗(yàn)，結(jié)果表明，所有分離菌株均對(duì)多種藥物表現(xiàn)耐藥性，50%以上菌株耐受的藥物有多粘菌素B、卡那霉素、復(fù)方新諾明、林可霉素、四環(huán)素、克林霉素、利福平和氟哌酸，50%以上菌株敏感的藥物有氟苯尼考、頭孢拉定、頭孢氨芐、阿莫西林、頭孢唑啉和壯觀霉素。雍燕等[7]對(duì)廣東3個(gè)地區(qū)分離的16株鴨疫里默氏菌進(jìn)行藥敏試驗(yàn)，結(jié)果表明，所有分離菌株均對(duì)頭孢類(lèi)、氟苯尼考、阿莫西林高度敏感；對(duì)多西環(huán)素、大觀霉素比較敏感；對(duì)恩諾沙星、新霉素、安普霉素存在不同程度的耐藥。

1.1 耐藥性產(chǎn)生的生化機(jī)制 主要有4種方式。

1.1.1 產(chǎn)生滅活酶 常見(jiàn)的滅活酶有滅活頭孢類(lèi)抗生素的β-內(nèi)酰胺酶（水解酶）、滅活氨基糖苷類(lèi)抗生素的鈍化酶、滅活氯霉素的乙酰轉(zhuǎn)移酶、滅活大環(huán)內(nèi)酯類(lèi)藥物的酯酶和滅活林可霉素的核苷酸轉(zhuǎn)移酶，可對(duì)進(jìn)入細(xì)菌菌體內(nèi)的抗生素進(jìn)行修飾和水解而使其失去生物活性。蔡秀磊[8]首次在鴨疫里默氏菌中檢測(cè)到 aadA5、aac6-II、catB3、aadAl四種不同的耐藥基因盒，其中aadA5、aadA1基因編碼核苷轉(zhuǎn)移酶，介導(dǎo)對(duì)氨基糖苷類(lèi)藥物產(chǎn)生耐藥性；aac6-II基因編碼?；D(zhuǎn)移酶，介導(dǎo)對(duì)氨基糖苷類(lèi)藥物的耐藥；catB3基因編碼氯霉素乙酰轉(zhuǎn)移酶，介導(dǎo)對(duì)氯霉素產(chǎn)生耐藥性。俞慧等[9]對(duì)構(gòu)建的鴨疫里默氏菌強(qiáng)毒力和弱毒力菌株之間遺傳差異表達(dá)基因文庫(kù)經(jīng)dotblot雜交和PCR驗(yàn)證，得到34個(gè)強(qiáng)弱毒株基因組差異片段，測(cè)定的序列經(jīng) BLAST、DNAStar和PSORTb分析，結(jié)果表明有1個(gè)片段所在基因編碼β-內(nèi)酰胺酶，與細(xì)菌耐藥性有關(guān)。楊芳芳等[10]采用PCR方法對(duì)2005-2006年臨床分離到的38株鴨疫里默氏菌進(jìn)行 ant（3，，）-Ia、aac（6，）-Ib 和 aph（3，）-IIa三種氨基糖苷類(lèi)鈍化酶基因的檢測(cè)表明，ant（3，，）-Ia、aac（6，）-Ib 和 aph（3，）-IIa 三種氨基糖苷類(lèi)鈍化酶基因在其實(shí)驗(yàn)室分離到的38株RA中已普遍存在，且多重耐藥現(xiàn)象比較嚴(yán)重。

1.1.2 改變抗生素作用的靶位 抗生素作用的靶位（如核糖體和核蛋白）由于發(fā)生突變或被細(xì)菌產(chǎn)生的某種酶修飾而使抗菌藥物無(wú)法發(fā)揮作用以及抗生素作用的靶酶 （如青霉素結(jié)合蛋白和DNA促旋酶）的結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，使之與抗生素的親和力降低。螺旋酶gyrA的喹諾酮類(lèi)藥物決定區(qū)（QDRD）的突變是喹諾酮類(lèi)藥物耐藥菌株產(chǎn)生的主要原因[11]。孫亞妮等[12]對(duì)臨床分離的31株鴨疫里默氏菌螺旋酶gyrA的喹諾酮耐藥決定區(qū)進(jìn)行克隆和序列分析，結(jié)果表明，30株諾氟沙星高度、中度耐藥菌株均出現(xiàn)gyrA的基因突變，氨基酸發(fā)生改變，Ser83突變?yōu)镮le83/Arg83，Gly87全部突變?yōu)锳sp87，而環(huán)丙沙星耐藥菌株基因突變未發(fā)現(xiàn)明顯的規(guī)律性。

1.1.3 降低外膜通透性，阻止或減少抗生素進(jìn)入菌體 仲崇岳[13]測(cè)定了72株對(duì)苯唑西林、青霉素G和頭孢吡肟耐藥的鴨疫里默氏菌在加入抑制劑羰基氰間氯苯腙（CCCP）后的最小抑菌濃度（MIC），發(fā)現(xiàn)鴨疫里默氏菌對(duì)苯唑西林、青霉素G、頭孢吡肟的耐藥率依次下降，而經(jīng)β-內(nèi)酰胺酶表型和基因型檢測(cè)均為陰性，但通過(guò)頭孢吡肟誘導(dǎo)試驗(yàn)和外膜蛋白電泳發(fā)現(xiàn)在14.4～20 kD和45 kD處各有兩條條帶發(fā)生缺失，而誘導(dǎo)株加入CCCP后，MIC值只下降為原來(lái)一半，說(shuō)明該誘導(dǎo)株對(duì)頭孢吡肟的耐藥性可能是由膜通透性降低引起的。

1.1.4 增強(qiáng)主動(dòng)外排系統(tǒng)，把進(jìn)入菌體的抗生素泵出菌體外 細(xì)菌中含有一種能量依賴(lài)性外排系統(tǒng)，可對(duì)抗生素主動(dòng)泵出。仲崇岳[13]對(duì)經(jīng)CCCP處理前后鴨疫里默氏菌對(duì)藥物敏感性的變化進(jìn)行研究，初步總結(jié)出鴨疫里默氏菌對(duì)氨基糖苷類(lèi)、喹諾酮類(lèi)和β-內(nèi)酰胺類(lèi)藥物的耐藥性與耐藥泵介導(dǎo)的耐藥有關(guān)。金龍翔[14]對(duì)25株臨床分離的鴨疫里默氏菌對(duì)諾氟沙星、恩諾沙星、環(huán)丙沙星、氧氟沙星、左氧氟沙星五種氟喹諾酮類(lèi)藥物的MIC值和同時(shí)加入CCCP后的MIC值進(jìn)行比較，結(jié)果表明CCCP可使耐藥菌對(duì)除左氧氟沙星外的藥物的敏感性增強(qiáng)，提示主動(dòng)外排在鴨疫里默氏菌對(duì)氟喹諾酮類(lèi)藥物的耐藥機(jī)制中發(fā)揮了重要的作用。

1.2 耐藥性產(chǎn)生的遺傳機(jī)制 主要有2種方式。

1.2.1 基因突變 突變一般發(fā)生于染色體DNA，但也可發(fā)生于質(zhì)粒DNA或轉(zhuǎn)座子上的DNA。耐藥菌株的形成是自發(fā)突變加上藥物選擇的結(jié)果。金龍翔[14]采用PCR方法對(duì)25株 RA的 gyrA、gyrB、parC、parE全基因分別進(jìn)行測(cè)序，并分析其在喹諾酮耐藥決定區(qū)的基因突變和氨基酸的替換情況，認(rèn)為gyrA基因QRDR的點(diǎn)突變扮演了最主要角色，parE基因QRDR同時(shí)發(fā)生雙位點(diǎn)突變很可能也發(fā)揮了一定作用。

1.2.2 外源耐藥基因的獲得 攜帶耐藥基因的基因元件（質(zhì)粒、轉(zhuǎn)座子、整合子、噬菌體）通過(guò)轉(zhuǎn)化、轉(zhuǎn)導(dǎo)、接合等方式由供體菌轉(zhuǎn)移到受體菌中，細(xì)菌獲得外源耐藥基因，形成耐藥菌株或多重耐藥株，耐藥基因也因此在細(xì)菌間廣泛傳播。R質(zhì)粒是與細(xì)菌耐藥相關(guān)的DNA片段，可介導(dǎo)耐藥基因在細(xì)菌間轉(zhuǎn)移和交換，在細(xì)菌耐藥性傳播中發(fā)揮重要作用。轉(zhuǎn)座子可在基因組中改變自身位置，攜帶耐藥基因，利于細(xì)菌間耐藥基因交換。整合子存在于質(zhì)粒、轉(zhuǎn)座子或染色體上，可隨轉(zhuǎn)座子在染色體和質(zhì)粒間移動(dòng)，可隨質(zhì)粒在細(xì)菌間轉(zhuǎn)移。基因盒可以被切除和整合，在細(xì)菌多重耐藥性的形成中發(fā)揮重要作用。楊芳芳等[10]利用PCR方法對(duì)38株RA中質(zhì)粒介導(dǎo)喹諾酮類(lèi)藥物耐藥的 qnr基因（qnrA、qnrB、qnrC、qnrD 和 qnrS）和外排泵基因（QepA、oqxAB）分別進(jìn)行檢測(cè)和測(cè)序分析，結(jié)果表明，38株RA中由質(zhì)粒介導(dǎo)的喹諾酮類(lèi)藥物耐藥基因僅檢測(cè)到qnrS基因。邢琳琳[15]對(duì)1996-2014年實(shí)驗(yàn)室自臨床病死鴨分離到的79株鴨疫里默氏菌及模式株ATCC11845進(jìn)行紅霉素最小抑菌濃度（MIC）試驗(yàn)和耐藥性機(jī)制研究，結(jié)果表明，鴨疫里默氏菌多重耐藥區(qū) （MRR）中的ermF、ermFU或ereD基因可引起鴨疫里默氏菌的紅霉素耐藥，其中ermFU基因可能是來(lái)自CTnDOT轉(zhuǎn)座子元件，ermF基因可能來(lái)自于轉(zhuǎn)座子Tn4351。蔡秀磊[8]根據(jù)已知的Ⅰ型整合子序列，應(yīng)用PCR方法對(duì)22株臨床分離的鴨疫里默氏菌進(jìn)行檢測(cè)和測(cè)序分析，結(jié)果表明，所有分離菌株均為Ⅰ型整合酶基因陽(yáng)性，1株菌株捕獲了耐藥基因盒aadA5，21株分離菌株順次捕獲了耐藥基因盒aac6-Ⅱ、catB3和aadA1，證明了整合子結(jié)構(gòu)是鴨疫里默氏菌耐藥性傳播的重要機(jī)制之一。

2 分子生物學(xué)中PCR檢測(cè)技術(shù)的應(yīng)用

臨床上常根據(jù)臨床癥狀和剖檢變化對(duì)鴨疫里默氏菌病作出初步診斷，但還需對(duì)鴨疫里默氏菌進(jìn)行分離鑒定才能確診。不過(guò)在病原分離方面存在費(fèi)時(shí)、費(fèi)力、分離率不太高等不足，在血清學(xué)檢測(cè)方面一次只能檢測(cè)到一種血清型的鴨疫里默氏菌，若沒(méi)有獲得所有陽(yáng)性血清，就會(huì)造成漏檢。近年來(lái)，分子生物學(xué)檢測(cè)技術(shù)迅速發(fā)展，以PCR技術(shù)的應(yīng)用尤為廣泛。不少學(xué)者也建立了基于鴨疫里默氏菌外膜蛋白基因ompA或16S rRNA的PCR方法來(lái)檢測(cè)鴨疫里默氏菌病。胡青海等[16]建立了基于鴨疫里默氏菌ompA基因序列的PCR檢測(cè)方法，可檢測(cè)出1、2、6、10、14、15型和一株未定型的鴨疫里默氏菌菌株，可用于鴨疫里默氏菌的鑒定和快速診斷 （取腦組織）。譚秋杉[17]建立了基于鴨疫里默氏菌16S rRNA基因序列的PCR檢測(cè)方法，可檢測(cè)到在浙江省流行的1、2、10、11型4種主要血清型的RA標(biāo)準(zhǔn)株、臨床分離株和病料樣品，具有一定的普遍適用性。謝永福等[18]建立了基于鴨疫里默氏菌16S rRNA基因序列的巢氏PCR檢測(cè)方法，可檢測(cè)出1、2、10型和其實(shí)驗(yàn)室分離的未知型鴨疫里默氏菌菌株，具有早期檢測(cè)雛鴨感染鴨疫里默氏菌的潛力。丁云竹等[19]建立了基于16S rRNA和danB基因序列的雙重PCR檢測(cè)方法，可檢測(cè)出其實(shí)驗(yàn)室提供的 1、2、6、8、15型和其他未定型的鴨疫里默氏菌菌株，可對(duì)分離的RA疑似菌株進(jìn)行快速檢測(cè)和鑒定，也可以直接用于臨床樣品中RA的檢測(cè)。程龍飛等[20]建立了基于大腸桿菌gapA基因、禽源多殺性巴氏桿菌KMT1基因、鴨疫里默氏菌OmpA基因序列的環(huán)介導(dǎo)間接PCR檢測(cè)方法，可同時(shí)檢測(cè)水禽3種常見(jiàn)病原菌（大腸桿菌、禽源多殺性巴氏桿菌、鴨疫里默氏菌），是一種特異性好、靈敏度高的快速病原學(xué)診斷方法。

實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)，是在常規(guī)PCR技術(shù)的基礎(chǔ)上，加入一條經(jīng)標(biāo)記的熒光探針，利用熒光信號(hào)積累實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)整個(gè)PCR過(guò)程，最后通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)對(duì)未知模板進(jìn)行定量分析的方法。該技術(shù)是在封閉的體系內(nèi)完成檢測(cè)，最終結(jié)果無(wú)需經(jīng)過(guò)電泳檢測(cè)，可有效避免樣品間的交叉污染，有很高的敏感性、特異性強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)，在鴨疫里默氏菌病上的應(yīng)用也越來(lái)越多。段澤等[21]根據(jù)鴨疫里默氏菌莢膜多糖蛋白基因序列設(shè)計(jì)引物和探針，建立了檢測(cè)RA的實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法，最低能檢測(cè)到RA的DNA模板為2.0拷貝/μL，可用于鴨疫里默氏菌感染的快速診斷、流行病學(xué)調(diào)查和鴨產(chǎn)品的檢疫等。謝永平等[22]根據(jù)鴨疫里默氏菌外膜蛋白（OmpA）基因保守區(qū)序列設(shè)計(jì)引物和探針，建立了直接檢測(cè)RA的實(shí)時(shí)熒光定量PCR快速方法，最低能檢測(cè)到RA的DNA模板為8.0拷貝/μL，可適用于RA的快速診斷、流行病學(xué)調(diào)查、種鴨引進(jìn)隔離檢疫、活鴨及其產(chǎn)品國(guó)內(nèi)市場(chǎng)和進(jìn)出口檢驗(yàn)檢疫。劉拂曉等[23]根據(jù)鴨疫里默氏菌16S rRNA基因保守區(qū)序列設(shè)計(jì)特異性引物和探針，建立了檢測(cè)RA的熒光定量PCR方法，RA的DNA模板最低檢測(cè)限可至1.0拷貝/μL，能很好地應(yīng)用于RA的快速檢測(cè)。萬(wàn)春和等[24]根據(jù)鴨疫里默氏菌鐵依賴(lài)抑制子基因（RaDtxR）為靶基因設(shè)計(jì)引物和探針，建立了檢測(cè)RA的熒光定量PCR方法，RaDtxR基因最低檢測(cè)下限為4.27×102拷貝/μL，可用于RA感染的早期檢測(cè)，也可用于明確不同毒力RA在鴨只體內(nèi)的動(dòng)態(tài)載量，該方法操作簡(jiǎn)便、特異性強(qiáng)、敏感性高、重復(fù)性好。

3 展 望

鴨疫里默氏菌病是目前危害養(yǎng)鴨業(yè)的主要細(xì)菌傳染病之一，其造成的雛鴨死亡、僵鴨及鴨場(chǎng)的持續(xù)性感染使養(yǎng)殖戶(hù)們?cè)馐苤卮蟮慕?jīng)濟(jì)損失。鴨疫里默氏菌血清型眾多，再加上臨床上用藥不規(guī)范，使其耐藥性情況越來(lái)越嚴(yán)重，耐藥菌株越來(lái)越多，臨床上易與大腸桿菌病等混合感染，導(dǎo)致對(duì)鴨疫里默氏菌病的防治和診斷也越來(lái)越困難。因此，有必要加強(qiáng)對(duì)鴨疫里默氏菌的耐藥機(jī)制研究，建立快速、特異、簡(jiǎn)便的檢測(cè)方法，為臨床上快速診斷和合理用藥防治鴨疫里默氏菌病提供依據(jù)。