基于準等重二甲基化標記的高通量蛋白質組選擇性交叉標記裝置

劉健慧,　張曉丹,　周　愿,　單亦初,　方　菲,　張麗華*,　張玉奎(. 中國科學院分離分析化學重點實驗室, 中國科學院大連化學物理研究所, 遼寧 大連 6023; 2. 中國科學院大學, 北京 00049)

近年來,蛋白質組定量方法的不斷發(fā)展推動了生物學與精準醫(yī)學等領域的深入理解。在實現準確定量的前提下,多時空變化、多變量、大樣本量的蛋白質組定量分析[1-4]可以更精準地揭示生物過程的發(fā)生發(fā)展機制,尋找重要的疾病標志物。因此,高通量的樣品預處理及定量分析已經成為近年來蛋白質組學方法發(fā)展的趨勢。

為了提高蛋白質組定量準確度,本課題組前期開發(fā)了基于質量虧損的準等重二甲基化標記(pIDL[5])策略,利用相差5.84 mDa的低相對分子質量的成對碎片離子可以實現基于二級譜的蛋白質組學相對定量。該方法定量結果與理論值相對偏差低于2%,動態(tài)范圍達到4個數量級,定量結果優(yōu)于現有基于MS1和MS/MS的相對定量方法,具有很高的定量準確度,并已在基于鳥槍法的全蛋白質組定量分析[5,6]、完整蛋白質定量分析[7]等領域得到了廣泛的應用。為了增加該方法的分析通量,可以結合選擇性二甲基化交叉標記策略[8,9]實現多樣品的等重標記及同時定量分析。但選擇性二甲基化標記策略需要兩步反應,其間需要進行溶劑交換操作。目前常見的標記方法為自由溶液反應結合固相萃取(SPE)柱溶劑交換,或在SPE柱上固相標記。自由溶液反應結合SPE柱溶劑交換方法[9]操作較復雜,需要固相萃取及凍干重溶等多步繁瑣的樣品預處理,樣品損失較大,且影響不同樣品之間的定量準確度;與之相比,SPE柱上固相標記策略[8]兩步標記反應均在柱上進行,標記肽段無需反復洗脫,且溶劑置換過程簡便,更利于實驗操作。但目前的裝置難以控制反應時間且難以同時進行多樣本標記,限制了其大規(guī)模的應用。

StageTip[10-12]、商品化ZipTip等集成化蛋白質組樣品預處理裝置憑借高效的脫鹽、富集、分級能力及操作簡便性,在大批量的樣品預處理過程中得到了廣泛的應用。其高效的溶劑交換能力及多樣品同時處理能力也大大有利于選擇性二甲基化標記策略。但目前,由于該裝置難以控制標記反應時間,仍未應用于蛋白質組選擇性二甲基化標記策略中。

基于此,本文將C18填料裝填入移液槍頭中,制成了StageTip標記裝置,通過控制離心力的大小保證標記反應時間及溶劑交換,發(fā)展了一種基于pIDL標記策略的高通量肽段選擇性交叉標記裝置(pIDL-StageTip),并優(yōu)化了標記試劑的反應條件,用標準蛋白質及人源全蛋白質組酶解產物評價了其標記效率及選擇性、定量準確度及精密度。

1　實驗部分

1.1　儀器、試劑與材料

乙腈(ACN)與甲醇購自Merck公司(德國),冰乙酸(CH3COOH)購自天津市大茂化學試劑廠,磷酸一氫鈉與磷酸二氫鈉購自天津市科密歐化學試劑開發(fā)中心,牛血清白蛋白(BSA)、甲醛及其同位素試劑(CH2O、13CH2O、13CD2O、CD2O)、氰基硼氫化鈉(NaBH3CN)、氰基硼氘化鈉(NaBD3CN)、重水(D2O)、α-氰基-4-羥基肉桂酸(CHCA)、三氟乙酸(TFA)購自Sigma-Aldrich公司(美國)。所有實驗用水均經過Milli-Q system (Millipore公司,美國)純化。

圓盤形SPE萃取膜購自3M公司(美國), 200 μL吸嘴、離心管購自Axygen公司(美國), C18硅膠填料(粒徑5 μm,孔徑15 nm)購自天津博納艾杰爾科技有限公司,C18分離材料(粒徑1.9 μm)購自Dr. Maisch公司(德國)。離心機購自Sigma公司(美國)。采用ultrafleXtreme MALDI TOF/TOF質譜儀(布魯克公司,德國)與EASY-nLC 1000高效液相色譜-Q-Exactive質譜聯(lián)用系統(tǒng)(賽默飛世爾科技公司,美國)評價效果。

圖 1　pIDL-StageTip制作的示意圖Fig. 1　Schematic representation of pseudo-isobaric dimethyl labeling-StageTips (pIDL-StageTips) production

1.2　選擇性二甲基化標記裝置的構建

構建步驟如圖1所示,將圓盤形SPE萃取膜裁剪成小塊,填入200 μL吸嘴中壓實。用鉆頭或鈍針等粗桿在離心管蓋上鉆孔?？刂瓶状笮?使吸嘴的高度低于離心機腔體高度,且吸嘴的下尖端高于離心管底0.5 cm以上。將吸嘴固定于帶孔的離心管上。將6 mg C18填料溶于150 μL甲醇中,離心填入填料并高轉速壓實,即可制得pIDL-StageTip裝置。

1.3　牛血清白蛋白(BSA)及細胞株YTS酶解產物的標記與分析

對肽段進行選擇性二甲基化標記,流程如圖2所示。

圖 2　肽段選擇性二甲基化標記流程圖Fig. 2　Flow chart for labeling steps of pIDL-StageTips

1.3.1pIDL-StageTip的活化、平衡和上樣

將200 μL 50%(v/v)ACN水溶液加入裝置中離心,重復多次,活化pIDL-StageTip。再用水相反復平衡,將BSA酶解產物加入裝置中,離心上樣,重復上樣3次。

1.3.2酸性條件下二甲基化選擇性標記肽段N端

在160 μL 1.5%(v/v) CH3COOH酸性溶液中加入20 μL相應的4%(v/v)甲醛及其同位素試劑和20 μL 0.6 mol/L氰基硼氘化鈉,或在180 μL 1.5%(v/v) CH3COOH酸性溶液中加入10 μL相應的4%(v/v)甲醛及其同位素試劑和10 μL 0.6 mol/L 氰基硼氫化鈉，配制成標記反應液。將反應液加入pIDL-StageTip中,利用1 500 g的離心力保證反應液逐漸流過C18填料,離心使標記試劑與肽段N端氨基反應。

1.3.3反應試劑沖洗及溶劑交換

加入水相沖洗標記試劑,再加入50 mmol/L pH 8.0磷酸鹽緩沖液,置換pIDL-StageTip至堿性條件。

1.3.4堿性條件下二甲基化標記肽段C端

在160 μL的50 mmol/L pH 8.0磷酸鹽緩沖液中加入20 μL相應的4%(v/v)甲醛及其同位素試劑和20 μL 0.6 mol/L氰基硼氫/氘化鈉,配制成標記反應液。將反應液加入pIDL-StageTip中,同酸性條件下操作,利用1 500 g的離心力反應10 min,使標記試劑與肽段C端賴氨酸上氨基反應。

1.3.5反應試劑的沖洗及洗脫

加入水相沖洗標記試劑,再加入80%(v/v) ACN水溶液反復洗脫標記后的肽段,收集洗脫液,待MALDI-TOF檢測。

1.3.6MALDI-TOF質譜分析

將7 mg/mL CHCA基質溶解于含0.1%(v/v) TFA的ACN/H2O(6∶4, v/v)溶液中。取2 μL標記后的肽段洗脫液點靶,干燥后再取2 μL CHCA基質點靶。干燥后進行MALDI-TOF分析。

1.3.7LC-MS質譜分析

高效液相色譜分離體系的流動相A為98%H2O+2%ACN+0.1%FA(均為體積分數,下同), B為98%ACN+2%H2O+0.1%FA。在C18毛細管分離柱(150 mm×100 μm)上以600 nL/min的流速梯度分離肽段:2%B(0 min)～6%B(0.1 min)～25%B (80 min)～40%B (110 min)～80%B (115 min)～80%B (125 min)。

Q-Exactive質譜儀采集模式為正離子模式,一級譜掃描范圍為m/z300～1 800,分辨率為70 000,自動增益控制(AGC)為3×106,最大離子注入時間為60 ms;二級譜分辨率為35 000,自動增益控制(AGC)為2×105,最大離子注入時間為110 ms,取TopN=12(前12強),隔離窗口m/z2.0,從m/z50.0開始采集,碰撞能量(NCE)為28。

2　結果與討論

2.1　裝置的設計

選擇性二甲基化交叉標記反應是根據肽段的N末端氨基和C末端賴氨酸側鏈氨基在pH酸性條件下反應速度不同的性質,依次在酸性、堿性條件下對肽段N末端和C末端進行不同的二甲基化標記的策略。該策略可以實現不同樣品的等重標記及二級譜碎片離子定量,結合本課題組[5]開發(fā)的pIDL策略,可以有效地提高蛋白質組定量準確度和分析通量。為了使該策略在大量樣品的定量分析中具有更高的可操作性和簡便性,本文發(fā)展了基于pIDL標記策略的高通量肽段末端選擇性交叉標記裝置。

如圖1所示,本裝置結構簡單,采用的吸嘴、離心管為實驗室常用耗材,簡單易得且成本低廉;只需要離心力即可完成裝填、樣品標記及溶劑置換,操作簡單,可同時標記大批量樣品,省時省力,滿足大量樣品分析的需求。由于吸嘴尖端裝填C18填料,尖端壓力有所增加,利于通過較低的離心力使標記試劑緩慢流過C18填料,避免壓力過低時流速不可控。最終確定1 500 g的離心力下,200 μL標記試劑經10 min通過pIDL-StageTip。因此,該裝置保證了標記反應時間的可控性、大量樣品標記的簡便性,是選擇性二甲基化交叉標記反應的理想裝置。

圖 3　NaBD3CN體系中不同反應時間對肽段RPCFSALT-PDETYVPK標記效率及選擇性的影響Fig. 3　Effect of different reaction times with NaBD3CN on labeling efficiency and selectivity of peptide RPCFSALTPDETYVPK

二甲基化標記使用甲醛及其同位素試劑與伯胺反應形成希夫堿,氰基硼氫化鈉或氰基硼氘化鈉再將其還原成甲基。酸性條件下由于溶液中含有大量的活潑氫,會與氰基硼氘化鈉中的氘原子發(fā)生明顯的回交,導致標記質量誤差。為避免這一現象,酸性條件下使用氰基硼氘化鈉做還原劑時,選擇重水作為溶液。但發(fā)現重水體系影響二甲基化反應速率,因此下面分別優(yōu)化酸性條件下使用NaBD3CN和NaBH3CN作還原劑的體系,保證對肽段標記的效率及選擇性。

2.2　酸性條件下NaBD3CN體系標記選擇性的優(yōu)化

我們采用BSA酶解產物中末端為賴氨酸的肽段考察標記效率及選擇性。為了更有效地考察酸性條件下的標記選擇性,這里只在酸性條件下對NaBD3CN還原的肽段N末端進行標記,選擇標記試劑為13CH2O與NaBD3CN,標記時間分別為10、20、30 min,考察可以實現N端完全標記且不會標記C末端賴氨酸的最佳反應時間。

如圖3所示,肽段RPCFSALTPDETYVPK自10 min起即標記完全,原始肽段質荷比1 881處肽段峰消失,標記后N末端增加32 Da,肽段質荷比1 913處出現肽段峰。由肽段峰面積計算,標記效率為100%。說明該裝置對肽段N端標記效率高,增加標記時間對標記效率并沒有明顯的影響。同時,為了避免酸性條件下對肽段C末端的賴氨酸同時標記,使標記選擇性降低,考察了標記時間對選擇性的影響。如果C末端的賴氨酸進行了標記,肽段質荷比為1 945。如圖3所示,標記10 min時未出現賴氨酸上非選擇性標記峰,標記選擇性100%。但20 min后,隨著反應時間的增加,賴氨酸上發(fā)生標記的現象更加明顯,說明反應時間過長會使標記選擇性有所降低,故選擇10 min作為酸性條件下NaBD3CN體系的標記時間較合理。

圖 4　NaBD3CN體系中不同反應時間對肽段GLVLIAFSQYLQQCPFDEHVK標記效率及選擇性的影響Fig. 4　Effect of different reaction time with NaBD3CN on labeling efficiency and selectivity of peptide GLVLIAFSQYLQQCPFDEHVK

為了考察不同肽段的標記最優(yōu)條件是否存在明顯差別,考察了肽段GLVLIAFSQYLQQCPFDEHVK的標記效果。如圖4所示,與肽段RPCFSALTPDETYVPK標記情況相似,原始肽段峰(m/z2 493)10 min后即消失,出現增加32 Da的N端標記后肽段峰(m/z2 525)。標記10 min時未見賴氨酸上非選擇性標記峰出現,標記選擇性仍可達到100%。但20 min后,隨著反應時間的增長,在質荷比2 557處出現強度越來越強的非選擇性賴氨酸二甲基化標記肽段峰。說明該反應條件對不同肽段的標記無明顯差異性。為了同時確保標記效率及選擇性,最終確定酸性條件下NaBD3CN體系的標記條件為:160 μL 1.5%(v/v) CH3COOH重水溶液中加入20 μL甲醛及其同位素試劑和20 μL NaBD3CN,配制成標記反應液,pIDL-StageTip裝置固相標記10 min。

2.3　酸性條件下NaBH3CN體系標記選擇性的優(yōu)化

將酸性條件下NaBD3CN體系優(yōu)化的反應條件應用于NaBH3CN體系中,發(fā)現C末端的賴氨酸標記現象明顯。以肽段RPCFSALTPDETYVPK為例(見圖5),利用13CH2O與NaBH3CN進行標記,N末端增加30 Da,肽段N端標記處(m/z1 911)峰強度最強,原始肽段處(m/z1 881)峰消失,但也出現了賴氨酸上非選擇性標記峰(m/z1 941)。相較于酸性條件下的NaBD3CN體系,標記選擇性較差,故需進一步優(yōu)化該體系的反應條件。

圖 5　相同酸性條件下NaBD3CN與NaBH3CN標記選擇性的差異Fig. 5　Differences of labeling selectivity between NaBD3CN and NaBH3CN under the same acidic condition

考慮到控制與NaBD3CN體系相同的標記時間有助于多種標記試劑的同時標記操作,故嘗試通過降低標記試劑濃度以提高標記選擇性。選擇總體積200 μL的反應液中含1、5或10 μL 4%(v/v) CH2O和0.6 mol/L NaBH3CN的標記試劑進行實驗。同樣選擇肽段RPCFSALTPDETYVPK為考察對象,如圖6所示,加入1 μL標記試劑后,原始肽段(m/z1 881)仍有很多未標記；加入5 μL標記試劑后標記效率明顯增高；加入10 μL標記試劑后原始肽段峰消失,標記效率達100%,實現了肽段的完全標記。3個標記濃度產生的賴氨酸非選擇性標記(m/z1 937)均不明顯,加入10 μL標記試劑后,標記選擇性達95%。因此,確定酸性條件下NaBH3CN體系的標記條件為:180 μL 1.5%(v/v) CH3COOH水溶液中加入10 μL 4%(v/v)甲醛及其同位素試劑和10 μL 0.6 mol/L NaBH3CN,配制成標記反應液,pIDL-StageTip裝置固相標記10 min。

圖 6　NaBH3CN體系不同標記試劑濃度對肽段RPCFSALT-PDETYVPK標記效率及選擇性的影響Fig. 6　Effect of different reagent concentrations with NaBH3CN on labeling efficiency and selectivity of peptide RPCFSALTPDETYVPK

圖 7　pIDL-StageTip裝置對肽段RPCFSALTPDETYVPK的標記效果Fig. 7　Labeling performance of peptide RPCFSALT-PDETYVPK using pIDL-StageTip

2.4　裝置標記效果評價

使用優(yōu)化后的條件,依次進行酸性條件、堿性條件下的標記即可完成肽段兩端的兩步標記。選擇13CD2O和NaBD3CN在酸性條件下標記肽段N端(36N),選擇CD2O和NaBH3CN在堿性條件下標記肽段C端(32KH),考察整個裝置兩步標記后的標記效果。36N-32KH標記后肽段共增加68 Da。如圖7所示,原始肽段RPCFSALTPDETYVPK上樣后,樣品溶液中無肽段峰,說明上樣完全,無樣品損失。標記后,m/z1 881處峰消失,m/z1 949處出現肽段峰,說明標記效率高,整套裝置可完成肽段兩端的兩步標記。

2.5　對復雜體系的標記及定量效果

蛋白質組研究對象常為由眾多蛋白質組成的復雜混合體系,為了滿足蛋白質組的研究需求,評價裝置的普適性,進一步利用人NK/T細胞淋巴瘤細胞株YTS酶解產物考察本裝置在復雜蛋白質組體系下的標記及定量效果。

對于酸性條件下的NaBH3CN體系,選擇13CH2O和NaBH3CN在酸性條件下標記肽段N端(30NL), CD2O和NaBD3CN在堿性條件下標記肽段C端(34KH),該種標記簡寫為30NL-34KH。對于酸性條件下NaBD3CN的體系,選擇CH2O和NaBD3CN在酸性條件下標記肽段N端(30NH),13CD2O和NaBH3CN在堿性條件下標記肽段C端(34KL),該種標記簡寫為30NH-34KL。接著對樣品進行LC-MS分析,鑒定時將肽段N端、C端的修飾及相應的非選擇性修飾都設置為可變修飾。通過計算鑒定到的各種修飾肽段的譜圖數,確定其標記效率及選擇性。結果表明,30NL-34KH的標記效率為99.96%±0.06%,標記選擇性為100%±0.00%。30NH-34KL的標記效率為99.92%±0.02%,標記選擇性為100%±0.01%。說明該裝置對復雜蛋白質組樣品標記仍具有很高的標記效率及選擇性,對于大規(guī)模蛋白質樣品標記具有廣泛的應用前景。

圖 8　質量比1∶1和 1∶10混合的人源復雜酶解產物定量比值箱線圖Fig. 8　Box plots for complex human digests at the mixing mass ratios of 1∶1 and 1∶10

將上述兩種標記產物分別按照重標與輕標1∶1和1∶10(w/w)混合,考察基于該裝置定量方法的準確度及精密度。蛋白質的定量比值的箱線圖如圖8所示,每種混合比例分別進行3次質譜重復測試,取定量到2次及2次以上的蛋白質進行分析。1∶1及1∶10混合的樣品定量比值的中值分別為0.94及0.08,相應的相對誤差為6.0%及20%。定量比值的分布很窄,取其以2為底的對數后SD值分別為0.19及0.19。對每個樣品質譜重復3次,3次技術重復定量比值的RSD值的中值分別為5.92%及9.43%。上述結果證明,利用該裝置標記樣品不會引入由標記效率、洗脫效率等方面造成的誤差,具有很高的定量準確度及精密度,有利于蛋白質組學的準確定量。

3　結論

本文發(fā)展了一種基于pIDL標記策略的高通量肽段末端選擇性交叉標記裝置,該裝置可以保證固相標記反應時間的可控性、大量樣品兩步標記的簡便性。實驗優(yōu)化了酸性條件下NaBD3CN與NaBH3CN體系的標記反應條件,實現了對標準蛋白質及人源蛋白質組復雜體系酶解產物高標記效率、高選擇性的二甲基化標記,有利于蛋白質組的高準確度、高精密度定量分析。整套標記可以在2 h內完成。該特點將利于細胞、組織、血液、尿液等蛋白質組樣品的多變量分析,實現高可操作性、高準確度、高通量的蛋白質組定量標記。

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