氧化鋯表面紫外線處理對(duì)成骨細(xì)胞生物學(xué)行為的影響

侯小青　侯玉東　孫鑫　孫龍

隨著種植體材料的創(chuàng)新與美觀要求的提高，以及最常用鈦及鈦合金種植體存在的先天缺陷，如在前牙區(qū)唇側(cè)骨量較少的患者會(huì)透出灰色的顏色影響美觀，以及鈦粒子釋放、菌斑聚集較多等不足[1-2]，并且在頭頸部進(jìn)行磁共振檢查時(shí)，鈦種植體可形成局部透射偽影造成局部影像不清晰[3]；口腔全瓷種植體強(qiáng)度高、韌性高、具有牙齒顏色的氧化鋯材料成為制作口腔種植體的備選材料[4]。紫外線表面處理技術(shù)不需要附加或增加化學(xué)的方法改變種植體的表面形貌，是一種相對(duì)簡單干凈的技術(shù)，具有良好運(yùn)用前景； 研究表明[5]，紫外線照射鈦表面可使其產(chǎn)生超親水性表面、使表面能增大、接觸角變小、有利于骨結(jié)合、增加種植體成功率。噴砂技術(shù)是表面粗糙的常用方法之一，同樣具有成本低、加工方法簡單、不需高溫條件等特點(diǎn)。本實(shí)驗(yàn)通過紫外線照射不同粗糙度的氧化鋯表面，觀察其對(duì)MC3T3-E1生物學(xué)行為的影響，為促進(jìn)氧化鋯種植體早期骨結(jié)合提供理論參考。

1　材料與方法

1.1　材料

1.1.1細(xì)胞小鼠胚胎成骨細(xì)胞前體細(xì)胞 MC3T3-E1(中科院上海細(xì)胞庫)。

1.1.2主要試劑及儀器氧化鋯片(直徑12 mm，厚度3 mm，成都海利華生物科技有限公司)； α-MEM培養(yǎng)基、 胎牛血清(Hyclone，美國)； MTT(北京索萊寶科技有限公司)； 堿性磷酸酶(alkaline phosphatase，ALP)試劑盒(南京建成生物工程研究所)；茜素紅(上海源葉生物科技有限公司)；酶標(biāo)定量測試儀(Multiskan MS-352，雷勃， 芬蘭)；總RNA抽提試劑(Trizol)(Invitrogen，美國)； 反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)試劑盒、 實(shí)時(shí)定量熒光PCR試劑盒(SYBR Primix Ex TaqTM，Takara，日本)；熒光實(shí)時(shí)定量PCR儀(Rotor Gene 3000，Corbett，澳大利亞)。

1.2　實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1細(xì)胞培養(yǎng)將MC3T3-E1培養(yǎng)于含10% FBS的α-MEM培養(yǎng)基中，放置于37 ℃含5%的CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，3 d/次換液，細(xì)胞長至80%左右時(shí)，用0.25%的胰蛋白酶消化傳代種板。

1.2.2氧化鋯試件處理將氧化鋯片機(jī)械打磨后噴砂處理，各取一半用15 W UVC滅菌燈距離試件表面2 cm照射48 h，滅菌燈波長(250±20) nm。所有試件用75%酒精和蒸餾水清洗后，利用超聲清洗30 min后自然烘干備用。

1.2.3實(shí)驗(yàn)分組實(shí)驗(yàn)分4 組(n=3)，光滑對(duì)照組(S組)、光滑處理組(S-UV組)、粗糙對(duì)照組(R組)和粗糙處理組(R-UV組)，將4 組氧化鋯片置于含10%FBS的α-MEM培養(yǎng)基的24 孔板內(nèi)，將MC3T3-E1接種于板內(nèi)培養(yǎng)。

1.2.4MTT法檢測成骨細(xì)胞在氧化鋯表面的增殖取細(xì)胞計(jì)數(shù)約3×104個(gè)/ml細(xì)胞懸液接種至含4 組氧化鋯片的24 孔板內(nèi)，每組設(shè)3 個(gè)復(fù)孔， 3 d換液1 次，于37 ℃ 5% CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3、 5 d取出，吸去培養(yǎng)液，PBS輕柔清洗3 次，每孔加200 μl 5 mg/ml的MTT、 800 μl α-MEM， 37 ℃孵育4 h后小心吸去上清液，每孔加入1 ml DMSO生成紫色結(jié)晶物，放置于搖床10 min，每孔分別取3 份200 μl溶解液至96 孔板，空白孔調(diào)零，測定490 nm波長各孔的吸光度值。

1.2.5ALP活性測定取細(xì)胞計(jì)數(shù)約3×104個(gè)/ml細(xì)胞懸液接種至含四組氧化鋯片的24 孔板內(nèi)，每組設(shè)3 個(gè)復(fù)孔，待細(xì)胞貼壁后換成骨誘導(dǎo)液，3 d換液1 次。 培養(yǎng)3、 7 d后，吸去培養(yǎng)液，PBS輕柔清洗3 次，每孔加入1 ml裂解液(0.5% Triton X-100)反復(fù)吹打，置37 ℃過液，按試劑盒上的說明操作，測定405 nm波長每孔的吸光度值。

1.2.6茜素紅染色定量測定鈣結(jié)節(jié)形成細(xì)胞按上述方法培養(yǎng)，培養(yǎng)21 d后吸去培養(yǎng)液，用PBS輕柔清洗3 次，每孔加95%的乙醇溶液固定10 min，去離子水漂洗2 次，接著用40 mmol/L茜素紅溶液(用氨水調(diào)至pH4.2)在37 ℃下染色10 min，用去離子水漂洗3 次，晾干，在倒置相差顯微鏡下觀察和攝片。加入10%氯化十六烷基吡啶，室溫放置30 min，將AR析出，從每孔取出100 μl溶液加入96 孔板，測定562 nm波長每孔的吸光度值。

1.2.7RT-PCR檢測成骨細(xì)胞成骨相關(guān)蛋白骨鈣素(OCN)、護(hù)骨素(OPG)mRNA的表達(dá)細(xì)胞按上述方法處理，培養(yǎng)7、 14 d后吸去培養(yǎng)液，PBS清洗3 次，用Triton提取總RNA，按反轉(zhuǎn)錄試劑盒上的實(shí)驗(yàn)步驟合成cDNA。引物由上海生工生物工程公司合成。實(shí)時(shí)定量PCR反應(yīng)體系采用Takara公司SYBR Premix Ex TaqTM20 μl體系。將各時(shí)間點(diǎn)光滑對(duì)照組的基因表達(dá)量定義為1，計(jì)算每組的相對(duì)表達(dá)量。

1.3　統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2　結(jié)　果

2.1　成骨細(xì)胞在氧化鋯表面增殖情況

數(shù)據(jù)顯示，實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組的MC3T3-E1細(xì)胞隨時(shí)間變化，均呈上升趨勢。 3 d時(shí)粗糙組細(xì)胞增殖高于光滑組，在5 d時(shí)粗糙處理組細(xì)胞的增殖數(shù)量明顯大于其它各組(P<0.05, 圖 1)，光滑處理組與粗糙對(duì)照組無明顯差異。

圖 1MC3T3-E1細(xì)胞的增殖情況

Fig 1Proliferation of MC3T3-E1 cells

2.2　ALP活性測定情況

隨著時(shí)間增長，對(duì)照組與處理組ALP活性均為升高趨勢(圖 2)。 在7 d時(shí)粗糙處理組ALP活性均高于光滑組(P<0.05)，粗糙組間活性無明顯差異。

2.3　茜素紅染色測定鈣結(jié)節(jié)形成情況

在21 d時(shí)處理組鈣結(jié)節(jié)吸光度值高于對(duì)照組，粗糙組稍高于光滑組；粗糙處理組與對(duì)照組差異更為明顯(P<0.05， 圖 3)。

2.4　不同處理方法對(duì)成骨細(xì)胞OCN、OPG mRNA表達(dá)的影響

實(shí)驗(yàn)組OPG、OCN mRNA的表達(dá)均隨時(shí)間上調(diào)明顯(P<0.05)。 第7 天時(shí)， 處理組OPG、OCN mRNA的表達(dá)高于對(duì)照組，粗糙組表達(dá)高于光滑組； 第14 天， 2 組基因的表達(dá)差異更為明顯，粗糙處理表達(dá)量明顯高于其它各組(P<0.05)， 光滑處理組與粗糙對(duì)照組無明顯差異。

圖 2MC3T3-E1細(xì)胞的堿性磷酸酶活性

Fig 2Alkaline phosphatase activity of MC3T3-E1 cells

圖 3細(xì)胞鈣結(jié)節(jié)染色吸光度值

Fig 3Absorbency of the stained calcium nodus

3　討　論

評(píng)價(jià)骨內(nèi)段種植體的早期穩(wěn)定性往往采用骨結(jié)合率等指標(biāo)。種植體周圍成骨細(xì)胞活性及生物學(xué)性能對(duì)種植體骨周圍界面的形成起到關(guān)鍵的作用，而對(duì)種植體骨結(jié)合及生物活性的影響主要在于材料表面形貌及其化學(xué)組成[6]， 并且不同材料表面的不同改性方法可獲得不同的表面形貌和粗糙度，這將導(dǎo)致成骨細(xì)胞在種植體材料的表面所表現(xiàn)出的反應(yīng)不同。氧化鋯擁有優(yōu)秀的生物相容性和近乎完美的美學(xué)效果， 其彎曲強(qiáng)度為900～1 200 MPa， 壓縮強(qiáng)度可高達(dá)2 000 MPa[5]，完全可承受后牙的咀嚼力。在植入口內(nèi)后不會(huì)受到唾液齦溝液的腐蝕，并可以減少菌斑的聚集從而減少種植體周圍炎的發(fā)生[7]。Ko 等[8]研究，氧化鋯與鈦有相似的細(xì)胞附著形態(tài)。Depprich 等[9]研究顯示氧化鋯材料細(xì)胞附著和生長率高于鈦。氧化鋯種植體表面改性的方法為通過酸蝕噴砂等物理的方法獲得最適合的微米級(jí)別的表面粗糙度，或者在種植體表面添加生物活性材料等[10]。粗糙的表面增大了種植體表面積，合適的粗糙度可促進(jìn)細(xì)胞的早期附著，達(dá)到種植體早期穩(wěn)定，提高種植體遠(yuǎn)期成功率[11]。紫外線照射鈦種植體表面可增加其表面親水性，當(dāng)照射由于長時(shí)間儲(chǔ)存而老化的種植體后，重新獲得表面活性并獲得親水性，促進(jìn)成骨細(xì)胞粘附、增殖、分化、礦化和蛋白表達(dá)以及骨結(jié)合[12-14]。本實(shí)驗(yàn)將噴砂及紫外線照射2 種表面改性技術(shù)相結(jié)合應(yīng)用于氧化鋯，以期提高氧化鋯表面的生物活性，增加骨結(jié)合。

圖 4MC3T3-E1細(xì)胞中OPG、 OCN的mRNA表達(dá)

Fig 4The mRNA expression of OPG and OCN in MC3T3-E1 cells

MTT結(jié)果顯示，經(jīng)紫外線照射的氧化鋯試件比未經(jīng)照射的試件更能有效的促進(jìn)成骨細(xì)胞的增殖，且紫外線噴砂處理組的增殖效果更佳，明顯優(yōu)于其余各組。茜素紅染色結(jié)果提示，紫外線處理組的礦化程度要優(yōu)于未處理組，且紫外噴砂處理組的礦化程度相對(duì)較高。因此，經(jīng)紫外線照射后的試件能增加MC3T3-E1細(xì)胞的增殖與礦化，且噴砂粗糙組的效果更為顯著。ALP數(shù)據(jù)顯示，粗糙各組的活性高于光滑各組，且R組與R-UV之間無明顯差異，表明粗糙因素較紫外線因素對(duì)ALP活性的影響更為明顯。骨鈣素(OCN)是成骨細(xì)胞合成分泌的一種重要的非膠原蛋白，能夠與鈣結(jié)合，從而參與調(diào)節(jié)羥基磷灰石結(jié)晶生長，是反映成骨細(xì)胞分化成熟的指標(biāo)[15-16]。護(hù)骨素(OPG)是TNF受體超家族成員，研究證實(shí)[17]，OPG/RANKL/RANK系統(tǒng)是破骨細(xì)胞分化成熟的主要調(diào)節(jié)機(jī)制，抑制破骨細(xì)胞分化和骨吸收功能。RT-PCR數(shù)據(jù)顯示，UV組OCN、OPG mRNA表達(dá)隨時(shí)間變化均表現(xiàn)為上調(diào)，雖然單純噴砂組(R組)的表達(dá)量較低于光滑紫外處理組(S-UV組)，但噴砂紫外處理組(R-UV組)的表達(dá)量相較于其他組OCN、OPG mRNA表達(dá)上調(diào)更為顯著。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，噴砂處理的氧化鋯試件表面經(jīng)紫外線照射可使MC3T3-E1細(xì)胞的增殖與礦化明顯增加，且OCN、OPG mRNA表達(dá)明顯上調(diào)，故粗糙紫外線處理氧化鋯試件可促進(jìn)成骨細(xì)胞生物學(xué)功能，提高種植體早期骨結(jié)合。

雖然目前氧化鋯材料在口腔領(lǐng)域內(nèi)的應(yīng)用很廣泛，但氧化鋯材料轉(zhuǎn)化為種植體還需進(jìn)一步研究，應(yīng)在材料的機(jī)械性能、加工制作、表面處理技術(shù)及設(shè)計(jì)、臨床可靠性等做深入研究。

[1]Shon WJ, Chung SH, Kim HK, et al. Peri-implant bone formation of non-thermal atmospheric pressure plasma-treated zirconia implants with different surface roughness in rabbit tibiae[J]. Clin Oral Implants Res, 2014, 25(5): 573-579.

[2]程寧, 施斌. 氧化鋯種植體的研究進(jìn)展[J]. 口腔醫(yī)學(xué)研究, 2011, 27(12):1115-1117.

[3]Smeets R, Sch?llchen M, Gauer T, et al. Artefacts in multimodal imaging of titanium, zirconium and binary titanium-zirconium alloy dental implants: Aninvitrostudy[J]. Dentomaxillofac Radiol, 2017, 46(2): 20160267.

[4]韓建民, 工藤忠明, 林紅, 等. 氧化鋯種植體的體外細(xì)胞相容性研究[J]. 現(xiàn)代口腔醫(yī)學(xué)雜志， 2015， 29(2)：70-72.

[5]Piconi C, Maccauro G. Zirconia as a ceramic biomaterial[J]. Biomaterials, 1999, 20(1): 1-25.

[6]Sánchez MC, Fernández E, Llama-Palacios A, et al. Response to antiseptic agents of periodontal pathogens ininvitrobiofilms on titanium and zirconium surfaces[J]. Dent Mater, 2017, 33(4): 446-453.

[7]Gahlert M, R?hling S, Wieland M, et al. A comparison study of the osseointegration of zirconia and titanium dental implants. A biomechanical evaluation in the maxilla of pigs[J]. Clin Implant Dent Relat Res, 2010, 12(4): 297-305.

[8]Ko HC, Han JS, B?chle M, et al. Initial osteoblast-like cell response to pure titanium and zirconia/alumina ceramics[J]. Dent Mater, 2007, 23(11): 1349-1355.

[9]Depprich R, Ommerborn M, Zipprich H, et al. Behavior of osteoblastic cells cultured on titanium and structured zirconia surfaces[J]. Head Face Med, 2008, 4:29.

[10]孫偉, 徐耀卿, 李晶, 等. Y-TZP氧化鋯植入體的推出實(shí)驗(yàn)研究[J]. 口腔醫(yī)學(xué)研究， 2014, 34(7):512-516.

[11]Le Guéhennec L, Soueidan A, Layrolle P, et al. Surface treatments of titanium dental implants for rapid osseointegration[J]. Dent Mater, 2007, 23(7): 844-854.

[12]Hori N, Ueno T, Suzuki T, et al. Ultraviolet light treatment for the restoration of age-related degradation of titanium bioactivity[J]. Int J Oral Maxillofac Implants, 2010, 25(1): 49-62.

[13]Att W, Hori N, Iwasa F, et al. The effect of UV-photofunctionalization on the time-related bioactivity of titanium and chromium-cobalt alloys[J]. Biomaterials, 2009, 30(26): 4268-4276.

[14]Ueno T, Yamada M, Hori N, et al. Effect of ultraviolet photoactivation of titanium on osseointegration in a rat model[J]. Int J Oral Maxillofac Implants, 2010, 25(2): 287-294.

[15]趙煜, 李冰雁, 杜莉, 等. 磁性附著體模擬磁場對(duì)成骨細(xì)胞分化功能的影響[J]. 中華口腔醫(yī)學(xué)研究雜志, 2011, 5(2): 151-155.

[16]張小恒, 余占海, 張國英, 等. 轉(zhuǎn)化生長因子β1對(duì)大鼠牙周組織中白介素-6、骨鈣素水平的影響[J]. 口腔醫(yī)學(xué)研究, 2010, 26(2): 171-174.

[17]張薷文, 周延民, 趙靜輝. 種植體骨結(jié)合相關(guān)檢測手段研究現(xiàn)狀[J]. 實(shí)用口腔醫(yī)學(xué)雜志, 2013, 29(5): 730-733.