25羥基維生素D3對(duì)糖尿病大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞NLRP3炎癥小體激活及炎癥反應(yīng)的影響

李昊　周海倫　郭峰　王琪　李偉

糖尿病患者長期的高血糖狀態(tài)可導(dǎo)致包括牙槽骨在內(nèi)的組織損傷愈合障礙，嚴(yán)重影響多種口腔疾病治療的實(shí)施。研究表明，糖尿病高血糖狀態(tài)引起損傷局部組織炎癥反應(yīng)過度，是這類疾病產(chǎn)生的重要原因[1]。骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(bone marrow mesenchymal stem cells，BMSCs)存在于包括牙槽骨在內(nèi)的多個(gè)部位的骨組織中，近年來，因能在多種疾病狀態(tài)下調(diào)節(jié)炎癥反應(yīng)而備受關(guān)注[2-3]。BMSCs可表達(dá)在機(jī)體免疫炎癥中發(fā)揮重要作用的核苷酸結(jié)合寡聚化結(jié)構(gòu)域樣受體蛋白3(nucleotide-binding oligomerization domain-like receptor protein 3，NLRP3)炎癥小體及其下游炎癥相關(guān)蛋白，如白介素1β(interleukin-1β，IL-1β)、白介素6(interleukin-6，IL-6)等多種炎癥因子，并在糖尿病高糖狀態(tài)下，在局部組織的炎癥反應(yīng)中有重要調(diào)節(jié)作用[4-5]。調(diào)節(jié)糖尿病狀態(tài)下BMSCs的炎癥反應(yīng)，可能影響損傷部位的炎癥狀態(tài)，改善組織愈合進(jìn)程。

25羥基維生素D3[25(OH)D3, D3] 是一種具有促進(jìn)新骨形成作用的活性藥物，來源廣泛，使用安全，目前有越來越多的研究顯示，該藥物還具有調(diào)節(jié)炎癥反應(yīng)的作用[6-7]。D3可通過作用于靶細(xì)胞上的維生素D受體(vitamin D receptor，VDR)，影響下游炎癥反應(yīng)信號(hào)通路，抑制過度的炎癥反應(yīng)，而VDR存在于包括BMSCs在內(nèi)的多種細(xì)胞中[7-8]，提示D3可能調(diào)節(jié)糖尿病狀態(tài)BMSCs的炎癥反應(yīng)，改善骨組織損傷局部的炎癥狀態(tài)，利于組織愈合。然而，該藥物對(duì)糖尿病狀態(tài)BMSCs炎癥反應(yīng)的影響及機(jī)制如何，目前尚未明確。

本研究用高糖培養(yǎng)基培養(yǎng)糖尿病大鼠BMSCs在體外模擬糖尿病狀態(tài)，并加入不同濃度的D3后，檢測細(xì)胞VDR、NLRP3、IL-1β等炎癥相關(guān)蛋白的表達(dá)，觀察用藥后BMSCs中NLRP3炎癥小體的激活及炎癥反應(yīng)的變化，為改善糖尿病狀態(tài)骨組織損傷局部的炎癥反應(yīng)及損傷愈合提供新思路。

1　材料與方法

1.1　試劑與儀器

D3、鏈脲佐菌(Sigma, 美國)； NLRP3兔抗鼠多克隆抗體(Cell Signaling Technology, 美國)； 維生素D受體(vitamin D receptor，VDR)、核因子κB(nuclear factor-κB，NF-κB)、含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶1(cysteinyl aspartate specific proteinase-1，Caspase-1)、IL-1β、IL-6、甘油醛-3-磷酸脫氫酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH)小鼠抗大鼠單克隆抗體、含CARD結(jié)構(gòu)域的凋亡相關(guān)顆粒樣蛋白(apoptosis-associated speck-like protein containing a caspase recruitment domain，ASC)兔抗鼠多克隆抗體(Santa Cruz， 美國)； 白介素18(interleukin-18，IL-18)兔抗鼠多克隆抗體(Abcam， 英國)； CD11b、CD44、CD45、CD90小鼠抗大鼠單克隆抗體、SP染色試劑盒(北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司)； Nikon 80i型顯微鏡(Nikon， 日本)； BIO-RAD Gel Doc XR+凝膠成像系統(tǒng)(BIO-RAD， 美國)。

1.2　實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與糖尿病動(dòng)物模型構(gòu)建

SPF級(jí)SD雄性大鼠20 只(廣西醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供)，4 周齡， 體質(zhì)量60～80 g，將所有動(dòng)物隨機(jī)分為正常組和糖尿病組，每組10 只。糖尿病組以高糖食物喂養(yǎng)4 周，空腹12 h后腹腔注射鏈脲佐菌素(35 mg/kg)， 1 周后取尾靜脈血檢測空腹血糖值，超過11.1 mmol/L者視為糖尿病模型構(gòu)建成功[9]。建模成功后，以常規(guī)鼠飼料喂養(yǎng)4 周，測定空腹血糖值后處死。正常組大鼠于相同周齡處死，處死前以常規(guī)鼠飼料喂食，未注射鏈脲佐菌素，處死前測定空腹血糖值確定未患糖尿病。

1.3　BMSCs的分離培養(yǎng)

處死所有大鼠后分離四肢長骨，在含10%青霉素/鏈霉素的α最低必需培養(yǎng)基(α minimum essential medium，αMEM)中去除表面軟組織，更換培養(yǎng)基后切斷干骺端沖出骨髓，經(jīng)過濾、離心后將所得細(xì)胞重懸于含10%胎牛血清、10%青霉素/鏈霉素的αMEM培養(yǎng)基中貼壁培養(yǎng)，獲得細(xì)胞[10]。

1.4　BMSCs的免疫細(xì)胞化學(xué)染色鑒定

將第3 代細(xì)胞制備細(xì)胞爬片，4%多聚甲醛固定，0.5%Triton X-100孵育后，用3% H2O2、封閉血清孵育，CD11b、CD44、CD45、CD90抗體(1∶200)作為一抗孵育，二抗工作液孵育后DAB顯色，顯微鏡下觀察。

1.5　25羥基維生素D3處理BMSCs

取第3 代細(xì)胞接種至24 孔板，每孔接種3×105個(gè)細(xì)胞。正常大鼠細(xì)胞在含5.5 mmol/L葡萄糖、10%胎牛血清的αMEM培養(yǎng)基中培養(yǎng)，作為正常對(duì)照組。糖尿病大鼠細(xì)胞在含24 mmol/L葡萄糖、10%胎牛血清的αMEM培養(yǎng)基中培養(yǎng)，模擬體外糖尿病狀態(tài)[11]，并分為糖尿病對(duì)照組、糖尿病低濃度組、糖尿病中濃度組和糖尿病高濃度組。正常對(duì)照組、糖尿病對(duì)照組：不加D3處理；糖尿病低濃度組、糖尿病中濃度組和糖尿病高濃度組每日分別加入1×10-5、 1×10-4、 1×10-3mmol/L的D3。加藥培養(yǎng)3 d后，收集各組細(xì)胞。

1.6　免疫印跡實(shí)驗(yàn)檢測BMSCs炎癥反應(yīng)相關(guān)蛋白的表達(dá)

收集細(xì)胞抽提蛋白后，以BCA法定量，常規(guī)SDS-PAGE凝膠電泳，濕轉(zhuǎn)后5%脫脂牛奶封閉l h，VDR、NF-κB、NLRP3、ASC、Caspase-1、IL-1β、IL-18、IL-6(1∶500)、GAPDH(1∶600)抗體作為一抗孵育2 h，羊抗小鼠或羊抗兔IgG抗體作為二抗(1∶3 000)孵育2 h，化學(xué)發(fā)光顯影，凝膠成像系統(tǒng)分析目的蛋白與內(nèi)參GAPDH條帶的相對(duì)灰度值。每組細(xì)胞蛋白免疫印跡實(shí)驗(yàn)重復(fù)6 次。

1.7　統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2　結(jié)　果

2.1　大鼠空腹血糖值

注射鏈脲佐菌素1 周后，糖尿病組大鼠均形成糖尿病，空腹血糖值為(14.82±1.27) mmol/L，正常組大鼠空腹血糖值為(5.32±0.79) mmol/L(P<0.01)；處死當(dāng)日，糖尿病組大鼠空腹血糖值為(18.19±2.14) mmol/L，正常組大鼠空腹血糖值為(4.77±0.81) mmol/L(P<0.01)。

2.2　免疫細(xì)胞化學(xué)染色

染色結(jié)果顯示，分離培養(yǎng)的細(xì)胞CD11b、CD45的表達(dá)呈陰性，CD44、CD90的表達(dá)呈陽性，符合BMSCs表面標(biāo)記物特征(圖 1)。

2.3　免疫印跡實(shí)驗(yàn)檢測各組BMSCs炎癥反應(yīng)相關(guān)蛋白的表達(dá)

加D3培養(yǎng)3 d后，正常對(duì)照組、糖尿病對(duì)照組與糖尿病低濃度組細(xì)胞VDR的表達(dá)量未見統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)，且均低于糖尿病中濃度組和糖尿病高濃度組(P<0.05)；與糖尿病各組相比，正常對(duì)照組細(xì)胞低表達(dá)NF-κB、NLRP3、ASC、Caspase-1、IL-1β、IL-18、IL-6(P<0.05)，糖尿病對(duì)照組與糖尿病低濃度組NF-κB、NLRP3、ASC、Caspase-1、IL-1β、IL-18、IL-6的表達(dá)量高于糖尿病中濃度組與糖尿病高濃度組(P<0.05)，但在糖尿病對(duì)照組與糖尿病低濃度組之間，在糖尿病中濃度組與糖尿病高濃度組之間，NF-κB、NLRP3、ASC、Caspase-1、IL-1β、IL-18、IL-6的表達(dá)未見統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)(圖 2， 表 1)。

圖 1分離培養(yǎng)的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞CD11b、CD44、CD45、CD90的表達(dá)(SP法, ×400)

Fig 1Expressions of CD11b, CD44, CD45 and CD90 in the cultured BMSCs(SP staining, ×400)

圖 2各組BMSCs炎癥相關(guān)蛋白表達(dá)(Western blot)

Fig 2Inflammation-related protein expression in BMSCs(Western blot)

注： A組, 正常對(duì)照組； B組, 糖尿病對(duì)照組； C組, 糖尿病低濃度組； D組, 糖尿病中濃度組； E組, 糖尿病高濃度組； ①： 與A組相比P<0.01； ②： 與B組相比P<0.01； ③： 與C組相比P<0.01

3　討　論

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與正常對(duì)照組相比，在體外模擬的糖尿病狀態(tài)下，糖尿病各組BMSCs的炎癥反應(yīng)相關(guān)蛋白NF-κB、NLRP3、ASC、Caspase-1、IL-1β、IL-18、IL-6表達(dá)水平顯著升高。既往研究表明，BMSCs在骨關(guān)節(jié)炎等多種疾病狀態(tài)下能參與免疫炎癥反應(yīng)，并發(fā)揮重要的調(diào)節(jié)作用；在糖尿病狀態(tài)易出現(xiàn)的高糖、活性氧簇等刺激因素作用下， BMSCs能過表達(dá)NLRP3及IL-1β、IL-6等炎癥反應(yīng)相關(guān)蛋白，這些蛋白的高表達(dá)，可對(duì)局部微環(huán)境中巨噬細(xì)胞等細(xì)胞的炎癥反應(yīng)有促進(jìn)作用[4-5,12-13]。而在糖尿病狀態(tài)下， 創(chuàng)傷局部的巨噬細(xì)胞等炎細(xì)胞產(chǎn)生過度的炎癥反應(yīng)，持續(xù)表達(dá)腫瘤壞死因子等促炎因子，抑制組織細(xì)胞再生，是包括骨組織在內(nèi)的糖尿病組織損傷愈合障礙發(fā)生的主要機(jī)制之一[13-14]。這些研究結(jié)果提示，調(diào)節(jié)BMSCs的炎癥反應(yīng)，可能成為治療該疾病的新策略。

NLRP3炎癥小體是近年發(fā)現(xiàn)的重要炎癥復(fù)合體之一，主要由NLRP3、ASC及Caspase-1組成。該炎癥小體在動(dòng)脈粥樣硬化、糖尿病等非感染性炎性疾病中發(fā)揮重要促炎作用，與糖尿病創(chuàng)傷部位的持續(xù)性炎癥密切相關(guān)[13]。有研究表明，高糖刺激活性氧及硫氧還蛋白相互作用蛋白產(chǎn)生增多后，可激活NLRP3炎癥小體，表現(xiàn)為NLRP3的表達(dá)上調(diào)，促進(jìn)ASC誘導(dǎo)Caspase-1的前體自我剪切，產(chǎn)生具有活性的Caspase-1，進(jìn)而降解IL-1β、IL-18的前體，誘導(dǎo)IL-1β及IL-18形成[13,15]。而在這一過程中，需要NF-κB的激活提供必要的信號(hào)[4]。NLRP3下游效應(yīng)分子IL-1β、IL-18的高表達(dá)，有利于誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞、T細(xì)胞等向促炎表型轉(zhuǎn)化，并誘導(dǎo)IL-6、腫瘤壞死因子等其他促炎蛋白表達(dá)，擴(kuò)大炎癥反應(yīng)[13,16]。在糖尿病心肌病、糖尿病難愈性創(chuàng)傷等炎癥性疾病中，病損部位NLRP3、IL-1β、IL-18等表達(dá)水平升高[17-18]。當(dāng)細(xì)胞NLRP3表達(dá)減少時(shí)，產(chǎn)生IL-1β及IL-18的水平降低，IL-6等其他效應(yīng)分子的表達(dá)也下調(diào)[4,19]。這些研究提示，抑制BMSCs中NLRP3炎癥小體的激活，可能改善糖尿病高糖狀態(tài)下創(chuàng)傷局部組織過度的炎癥反應(yīng)，利于組織愈合。

有越來越多的研究表明， D3可在牙周炎、氣道變應(yīng)性炎癥等多種炎性疾病中發(fā)揮炎癥調(diào)節(jié)作用[6-7]。D3能激活靶細(xì)胞上的VDR，抑制下游炎癥反應(yīng)相關(guān)信號(hào)通路，改善過度的炎癥反應(yīng)[6-7]。在本實(shí)驗(yàn)中，糖尿病中濃度組和糖尿病高濃度組的VDR表達(dá)量高于正常對(duì)照組、糖尿病對(duì)照組與糖尿病低濃度組，而后3 組的VDR表達(dá)量未見統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，提示D3可能需達(dá)到一定的濃度，才能產(chǎn)生激活VDR的作用。既往實(shí)驗(yàn)顯示，VDR可影響NF-κB DNA結(jié)合基序的功能，對(duì)NF-κB產(chǎn)生抑制作用，進(jìn)而抑制NF-κB下游信號(hào)通路的激活[20]。本研究顯示，應(yīng)用D3后，糖尿病中濃度組、糖尿病高濃度組的NF-κB及其下游蛋白NLRP3、ASC、Caspase-1、IL-1β、IL-18、IL-6的表達(dá)量明顯低于糖尿病對(duì)照組、糖尿病低濃度組，但在糖尿病對(duì)照組與糖尿病低濃度組之間的表達(dá)量未見統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，提示在高糖狀態(tài)下，D3達(dá)到有效濃度后，可能通過激活VDR抑制NF-κB，進(jìn)而抑制BMSCs中NLRP3炎癥小體的激活及下游促炎因子的產(chǎn)生，從而抑制炎癥反應(yīng)。

綜上所述，本研究結(jié)果證實(shí)，在高糖培養(yǎng)基體外模擬糖尿病狀態(tài)下，應(yīng)用D3能抑制BMSCs中NLRP3炎癥小體的激活及促炎因子IL-1β、IL-18、IL-6的表達(dá)，該抑制作用可能與激活VDR、抑制NF-κB有關(guān)。這些結(jié)果提示，D3可能抑制BMSCs的炎癥反應(yīng)，改善糖尿病局部組織的炎癥狀態(tài)，可能為治療糖尿病狀態(tài)下包括牙槽骨在內(nèi)的多種骨創(chuàng)傷愈合障礙提供新思路。

(致謝： 本研究在廣西重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室口腔頜面修復(fù)與重建研究實(shí)驗(yàn)室中完成，感謝楊亦萍、卿海云、曹陽老師的實(shí)驗(yàn)指導(dǎo)!)

[1]Mirza RE, Fang MM, Ennis WJ, et al. Blocking interleukin-1β induces a healing-associated wound macrophage phenotype and improves healing in type 2 diabetes[J]. Diabetes, 2013, 62(7): 2579-2587.

[2]袁林， 曹依娜， 楊征毅， 等. 人頜骨間充質(zhì)干細(xì)胞的外泌體在巨噬細(xì)胞調(diào)控中的作用[J]. 實(shí)用口腔醫(yī)學(xué)雜志, 2017, 33(3): 344-348.

[3]Bernardo ME, Fibbe WE. Mesenchymal stromal cells: sensors and switchers of inflammation[J]. Cell Stem Cell, 2013, 13(4): 392-402.

[4]Fu Y, Wang Y, Du L, et al. Resveratrol inhibits ionising irradiation-induced inflammation in MSCs by activating SIRT1 and limiting NLRP-3 inflammasome activation[J]. Int J Mol Sci, 2013, 14(7): 14105-14118.

[5]Chang TC, Hsu MF, Wu KK. High glucose induces bone marrow-derived mesenchymal stem cell senescence by upregulating autophagy[J]. PLoS One, 2015, 10(5): e0126537.

[6]Baeke F, Takiishi T, Korf H, et al. Vitamin D: modulator of the immune system[J]. Curr Opin Pharmacol, 2010, 10(4): 482-496.

[7]Li H, Xie H, Fu M, et al. 25-hydroxyvitamin D3 ameliorates periodontitis by modulating the expression of inflammation-associated factors in diabetic mice[J]. Steroids, 2013, 78(2): 115-120.

[8]Zhou S, LeBoff MS, Glowacki J. Vitamin D metabolism and action in human bone marrow stromal cells[J]. Endocrinology, 2010, 151(1): 14-22.

[9]Lambertucci AC, Lambertucci RH, Hirabara SM, et al. Glutamine supplementation stimulates protein-synthetic and inhibits protein-degradative signaling pathways in skeletal muscle of diabetic rats[J]. PLoS One, 2012, 7(12): e50390.

[10]范敬靜， 李東良， 何秀華， 等. 骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞向肝樣細(xì)胞的誘導(dǎo)及分化[J]. 中國組織工程研究與臨床康復(fù), 2011, 15(14): 2491-2494.

[11]García-Hernández A, Arzate H, Gil-Chavarría I, et al. High glucose concentrations alter the biomineralization process in human osteoblastic cells[J]. Bone, 2012, 50(1): 276-288.

[12]De Miguel MP, Fuentes-Julián S, Blázquez-Martínez A, et al. Immunosuppressive properties of mesenchymal stem cells: Advances and applications[J]. Curr Mol Med, 2012, 12(5): 574-591.

[13]郜敏， 劉琰， 章雄. NLRP3炎癥復(fù)合體與糖尿病慢性難愈性創(chuàng)面關(guān)系的研究進(jìn)展[J]. 中華損傷與修復(fù)雜志(電子版), 2015, 10(5): 55-59.

[14]Mirza R, Koh TJ. Dysregulation of monocyte/macrophage phenotype in wounds of diabetic mice[J]. Cytokine, 2011, 56(2): 256-264.

[15]Qiao J, Huang Y, Xia Y, et al. Busulfan and cyclosphamide induce liver inflammation through NLRP3 activation in mice after hematopoietic stem cell transplantation[J]. Sci Rep, 2015, 5:17828.

[16]吳瑩瑩， 劉洪臣. TNF-α、IL-1β及IL-6與糖尿病及牙周炎之間的關(guān)系[J]. 中華老年口腔醫(yī)學(xué)雜志, 2011, 9(2): 117-121.

[17]Luo B, Li B, Wang W, et al. Rosuvastatin alleviates diabetic cardiomyopathy by inhibiting NLRP3 inflammasome and MAPK pathways in a type 2 diabetes rat model[J]. Cardiovasc Drugs Ther, 2014, 28(1): 33-43.

[18]Mirza RE, Fang MM, Weinheimer-Haus EM, et al. Sustained inflammasome activity in macrophages impairs wound healing in type 2 diabetic humans and mice[J]. Diabetes, 2014, 63(3): 1103-1114.

[19]Dong Y, Fan C, Hu W, et al. Melatonin attenuated early brain injury induced by subarachnoid hemorrhage via regulating NLRP3 inflammasome and apoptosis signaling[J]. J Pineal Res, 2016, 60(3): 253-262.

[20]Li H, Li B, Wang Q, et al. Attenuation of inflammatory response by 25- hydroxyvitamin D3-loaded polylactic acid microspheres in treatment of periodontitis in diabetic rats[J]. Chin Chin J Dent Res, 2014, 17(2): 91-98.