MALDI-TOF MS與16SrDNA方法對(duì)腸桿菌科微生物鑒定比較分析

魏　超，代曉航，郭靈安，劉　煒，趙　歡

(1.四川省農(nóng)科院分析測試中心，四川 成都　610066；2.華西師范大學(xué)生命科學(xué)院，四川 南充　637009)

基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時(shí)間質(zhì)譜(matrix assisted laser desorption ionization-time of flight mass spectrometry, MALDI-TOF MS)是一種軟電離新型有機(jī)質(zhì)譜技術(shù)，是檢測和鑒定多肽、蛋白質(zhì)的強(qiáng)有力工具[1]，已被用于微生物檢測。微生物核糖體蛋白和外周蛋白具有特異性，其主要為遺傳因素控制，受培養(yǎng)環(huán)境、培養(yǎng)基成分等外部因素影響較小。MALDI-TOF MS具有靈敏度高、準(zhǔn)確度高和樣品處理速度快等特點(diǎn)，其通過基質(zhì)輔助電離微生物蛋白質(zhì)測得蛋白質(zhì)和多肽的分子質(zhì)量，形成獨(dú)特的蛋白質(zhì)片段組指紋圖，通過特征性模式峰積累計(jì)算實(shí)現(xiàn)對(duì)微生物的鑒定[2-5]。

農(nóng)產(chǎn)品表面微生物菌落構(gòu)成復(fù)雜，即食類果蔬表面致病微生物易引起大規(guī)模衛(wèi)生事件，在美國與歐盟的食品風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估中為主要研究對(duì)象[6]。由于農(nóng)產(chǎn)品的生產(chǎn)處理過程長期暴露在一定的空間環(huán)境，表面易感染腸桿菌科微生物，其部分菌屬常引起人類腹瀉和腸道感染，如沙門氏菌屬、志賀氏菌屬等，還有部分菌屬會(huì)在一定條件下引起機(jī)會(huì)感染為條件致病菌[7]。

本實(shí)驗(yàn)擬采用MALDI-TOF MS和16SrDNA方法對(duì)農(nóng)產(chǎn)品表面腸桿菌進(jìn)行鑒定和歸類，并研究這2種方法的歸類學(xué)比較，旨在為高效、快速的農(nóng)產(chǎn)品微生物鑒定提供理論支持。

1　實(shí)驗(yàn)部分

1.1　儀器

基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時(shí)間質(zhì)譜儀：日本島津公司產(chǎn)品；PCR擴(kuò)增儀：美國SimpliAmp公司產(chǎn)品；微生物自動(dòng)鑒定儀：法國梅里埃公司產(chǎn)品；高壓滅菌鍋：上海三申公司產(chǎn)品；HF-safe-1200生物安全柜：上海立申公司產(chǎn)品。

1.2　試劑

DNA提取試劑盒：日本Takara公司產(chǎn)品；正向引物(F27) 5-AGAGTTTGATCMTGGCTCAG-3，反向引物(R1492)5-TACGGYTACCTTGTTACGACTT-3的引物合成及測序：成都擎科公司產(chǎn)品；乙腈、乙醇：均為色譜純，美國Fisher Scientific公司產(chǎn)品；甲酸(色譜純)：美國Tedia公司產(chǎn)品；氰基-4-羥基肉桂酸(CHCA)：美國Sigma公司產(chǎn)品；實(shí)驗(yàn)用水為ddH2O。

1.3　樣品及來源

10株微生物來源于金桔表面，符合腸桿菌科微生物特征并得到生化水平鑒定。分離方法為采用腸桿菌科顯色培養(yǎng)基和伊紅美藍(lán)(EMB)對(duì)金桔表面微生物進(jìn)行盲篩，采用營養(yǎng)瓊脂純化分離單菌落，對(duì)第二代純化單菌落進(jìn)行MALDI-TOF MS分析及16SrDNA測序。

1.4　MALDI-TOF MS對(duì)腸桿菌的鑒定及相關(guān)性分析

1.4.1樣品前處理取菌適量，加入0.75 mL乙醇-水溶液(75∶25，V/V)，振蕩1 min，離心去上清液；加入0.75 mL 70%乙酸水溶液振蕩1 min，再加入0.75 mL乙腈振蕩均勻，離心1 min；取1 μL點(diǎn)至靶板，加入1 μL CHCA基質(zhì)(10 g/L，溶劑為乙腈-水溶液(1∶1，V/V))，晾干。

1.4.2質(zhì)譜條件線性模式 mode liner SARAMIS；能量75 Hz；收集質(zhì)荷比m/z2 000～20 000；樣品掃描方式：Regular Circular，直徑1 000.00 μm，間距100.00 μm，每樣品疊加200個(gè)收集峰。

1.4.3微生物鑒定及相關(guān)分析將質(zhì)譜圖譜導(dǎo)入MYLA數(shù)據(jù)庫與標(biāo)準(zhǔn)菌株的譜圖進(jìn)行多重比較，通過比對(duì)質(zhì)荷比與標(biāo)識(shí)峰得到微生物鑒定相關(guān)結(jié)果，根據(jù)收集微生物蛋白質(zhì)圖譜的質(zhì)荷比和峰面積進(jìn)行微生物之間的相關(guān)性分析，獲得系統(tǒng)發(fā)育圖譜。

1.5　16SrDNA鑒定及相關(guān)性分析

1.5.116SrDNA PCR反應(yīng)體系25 μL PCR反應(yīng)體系中，包含12.5 μL MasterMix(Taq酶、dNTP混合物、MgCl2以及反應(yīng)緩沖液)，各1 μL 27f和1492r引物、1 μL模板 DNA、9.5 μL ddH2O。

1.5.216SrDNA PCR反應(yīng)條件95 ℃預(yù)變性 5 min；PCRK擴(kuò)增程序94 ℃ 30 s、60 ℃ 30 s、72 ℃ 30 s，共進(jìn)行35個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸 7 min。

1.5.3微生物鑒定及相關(guān)性分析將PCR產(chǎn)物進(jìn)行雙向測序并拼接，測序結(jié)果提交NCBI blast比對(duì)，選取最高得分值獲取鑒定相關(guān)結(jié)

果。將微生物16SrDNA序列在PRIMER PREMIER軟件上整理，采用MAGA6.0軟件鄰接法(neighbor-joining)進(jìn)行序列分析，構(gòu)建發(fā)育樹。

2　結(jié)果與討論

2.1　MALDI-TOF MS與16SrDNA對(duì)10株腸桿菌科微生物鑒定比較

微生物MALDI-TOF MS鑒定結(jié)果列于表1，質(zhì)譜圖示于圖1。MALDI-TOF MS對(duì)微生物鑒定為蛋白水平，對(duì)微生物的質(zhì)譜前處理目的為促進(jìn)微生物細(xì)胞破碎，蛋白質(zhì)物質(zhì)析出，同時(shí)樣品中含有糖類和脂類，分子質(zhì)量低于2 000的譜峰多為雜質(zhì)峰且很難識(shí)別，所以選取分子質(zhì)量在2 000～20 000的收集峰進(jìn)行識(shí)別。微生物16SrDNA鑒定結(jié)果列于表2。兩種方法與微生物生化法的鑒定結(jié)果屬級(jí)一致，生化法對(duì)部分微生物只能鑒定到屬級(jí)別，MALDI-TOF MS與16SrDNA均可將微生物鑒定到種級(jí)。MALDI-TOF MS與16SrDNA在微生物屬級(jí)鑒定結(jié)果相同，但種級(jí)鑒定結(jié)果有2個(gè)偏差，表現(xiàn)在MALDI-TOF MS對(duì)3株微生物均鑒定為肺炎克雷伯菌(Klebsiellapneumoniae)，16SrDNA鑒定結(jié)果分別為肺炎克雷伯菌、產(chǎn)酸克雷伯菌(Klebsiellaoxytoca)和克雷伯菌(Klebsiellasp.)。

表1　微生物MALDI-TOF MS鑒定結(jié)果Table 1　Identification results of microorganism by MALDI-TOF MS

注：a.11220001 1B4；b.11220003 1C1；c.11220003 1C3；d. y32016 1H3；e.y32016 1I2；f.dy2016111J1；g.dy2016111J3；h.y201611 1L1；i.dy201611 1L4；j.2A1；k.大腸桿菌ATCC 8739圖1　MALDI-TOF MS微生物圖譜 Fig.1　Microorganism mass spectra of MALDI-TOF MS

編號(hào)No.置信率Identification/%鑒定結(jié)果Identificationresults中文名稱Chinesenames種Species屬GenusGENEBANK最似標(biāo)本號(hào)dy2016111L499肺炎克雷伯菌pneumoniaeKlebsiellaKU254764.1dy2016111J1100產(chǎn)酸克雷伯菌oxytocaKlebsiellaCP009274.2dy2016111J3100大腸埃希氏菌coliEscherichiaCP019008.1y2016111L1100產(chǎn)酸克雷伯菌sp.KlebsiellaKF761520.1y320161H399生癌腸桿菌cancerogenusEnterobacterNR118449.7y320161I299阪崎腸桿菌sakazakiiCronobacterNR044977.1112200031C199陰溝腸桿菌cloacaeEnterobacterCP011650.1112200031C399分散泛菌dispersaPantoeaHQ706112.1112200011B499日溝維腸桿菌gergoviaeEnterobacterKX981861.12A199粘質(zhì)沙雷菌marcescensSerratiaNC019344.1

隨著微生物研究不同生物技術(shù)方法的發(fā)展與應(yīng)用，腸桿菌科微生物的分類位置一直在變化[7]，微生物蛋白質(zhì)合成受基因水平控制，16SrDNA為控制核糖體蛋白生成的一段保守序列，可作為微生物區(qū)別手段；而MALDI-TOF MS鑒定是基于微生物整體蛋白質(zhì)水平，選取重要特征標(biāo)識(shí)峰進(jìn)行識(shí)別。2種方法選擇的數(shù)據(jù)源有一定聯(lián)系，但鑒定所需數(shù)據(jù)來自2個(gè)不同的方向。2種方法對(duì)金桔分離的腸桿菌科微生物均獲得了有效的鑒定結(jié)果，雖然2株克雷伯菌種級(jí)有偏差，但其余8株微生物屬級(jí)、種級(jí)均一致。

2.2　MALDI-TOF MS與16SrDNA微生物相關(guān)分析比較

對(duì)MALDI-TOF MS測得的微生物標(biāo)識(shí)峰質(zhì)荷比及峰面積進(jìn)行了相關(guān)分析，建立的樹狀圖(相對(duì)相差<0.08%)示于圖2。圖2直觀地反映了分離的10種微生物在蛋白質(zhì)水平的相關(guān)性和親緣位置，其中3株克雷伯菌的親緣位置最近；日溝維菌和大腸埃希氏菌歸于1個(gè)分支；陰溝腸桿菌和生癌腸桿菌對(duì)于1個(gè)分支親緣關(guān)系較接近；但粘質(zhì)沙雷菌和其余腸桿菌在2個(gè)大分支下顯示親緣關(guān)系較遠(yuǎn)。16SrDNA鄰近連接方法系統(tǒng)發(fā)育歸類示于圖3。圖3反

映了分離腸桿菌在16SrDNA水平下的親緣關(guān)系與位置，其中，克雷伯屬3株菌相對(duì)偏差較小，歸于1個(gè)分支；生癌腸桿菌和陰溝腸桿菌有0.002差異，歸于1個(gè)分支；阪崎腸桿菌和分散泛菌歸于1個(gè)分支；粘質(zhì)沙雷菌與其余腸桿菌差異較大，與其他腸桿菌分為2個(gè)分支。MALDI-TOF MS基于微生物蛋白質(zhì)基質(zhì)解析電離后，收集峰面積與保留時(shí)間進(jìn)行相關(guān)計(jì)算，其計(jì)算方法與16SrDNA鄰近連接方法基本一致，所給譜圖均為無根樹。2種歸類方法對(duì)克雷伯菌(Klebsiella)的3株微生物的歸類方向相同，且都認(rèn)定生癌腸桿菌和陰溝腸桿菌的相似度較高，并歸于1個(gè)分支?？傮w來看，在2種

計(jì)算方法下，金桔表面分離的腸桿菌科微生物的歸類樹狀圖譜差異較大，不同屬微生物的分支地位及下級(jí)分支均不同?？梢?，對(duì)于微生物的相關(guān)分析，2種方法的差異較大。

16SrDNA是一段含有1 542個(gè)堿基的保守序列，該序列編碼核糖體RNA的一個(gè)亞基，結(jié)構(gòu)示于圖4[8]。16SrDNA是細(xì)菌的系統(tǒng)分類研究中最有用、最常用的分子鐘，其種類少，含量大(約占細(xì)菌RNA含量的80%)，分子大小適中，存在于所有生物中，其進(jìn)化具有良好的時(shí)鐘性質(zhì)[9]，是普遍認(rèn)可的微生物歸類學(xué)手段。實(shí)驗(yàn)證明，雖然微生物外周蛋白和核糖體蛋白特異性受其基因組，乃至整個(gè)基因組調(diào)控，但MALDI-TOF MS對(duì)微生物蛋白質(zhì)峰的收集是在基質(zhì)解析的程度[10]，對(duì)收集標(biāo)識(shí)峰計(jì)算相對(duì)數(shù)據(jù)容量較小，比16SrDNA測序方法信息量低，這可能是二者在做歸類學(xué)分析時(shí)產(chǎn)生差異的原因之一。

圖3　16SrDNA方法系統(tǒng)發(fā)育樹圖Fig.3　Dendrogram of 16SrDNA

圖4　16SrDNA結(jié)構(gòu)圖Fig.4　Structure diagram of 16SrDNA

3　結(jié)論

16SrDNA對(duì)微生物的鑒定是學(xué)科內(nèi)通用方法，相對(duì)認(rèn)可度較高。MALDI-TOF MS是較先進(jìn)的微生物鑒定方法，其原理基于微生物外周蛋白和核糖體蛋白的保守性，對(duì)微生物鑒定結(jié)果的準(zhǔn)確度較高，分辨率在種屬級(jí)，可作為一般條件下微生物鑒定的高效準(zhǔn)確方法，但蛋白質(zhì)標(biāo)識(shí)峰歸類法與普遍認(rèn)可的基因?qū)W方法在腸桿菌科微生物歸類中差異較大，為提高M(jìn)ALDI-TOF MS準(zhǔn)確性，還需要進(jìn)一步豐富微生物數(shù)據(jù)收集容量及優(yōu)化相應(yīng)算法。

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