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    抑制Akt信號通路對病理性瘢痕成纖維細(xì)胞生長、細(xì)胞周期及凋亡的影響

    2018-04-02 09:39:34潘學(xué)洪王曉東
    關(guān)鍵詞:病理性纖維細(xì)胞細(xì)胞周期

    潘學(xué)洪,王曉東

    濰坊市益都中心醫(yī)院醫(yī)學(xué)美容科 山東濰坊 262500

    皮膚對創(chuàng)傷的修復(fù)方式分為2種,依次為簡單的表皮修復(fù)和深層真皮修復(fù),而真皮及皮下組織修復(fù)常常出現(xiàn)病理性瘢痕[1]。增生的病理性瘢痕一般高于周圍的正常皮膚組織,其表面充血呈現(xiàn)紅色,不僅嚴(yán)重影響美觀,還常常出現(xiàn)疼痛、瘙癢等現(xiàn)象[2]。病理性瘢痕以成纖維細(xì)胞過度增殖為主要病理學(xué)表現(xiàn),抑制病理性瘢痕成纖維細(xì)胞增殖、促進(jìn)細(xì)胞凋亡是病理性瘢痕治療的重要途徑[3]。蛋白激酶B(protein kinase B,Akt)信號通路具有調(diào)控細(xì)胞增殖、凋亡等作用,其磷酸化后生成磷酸化的Akt(p-Akt),激活A(yù)kt信號通路,抑制細(xì)胞凋亡,促進(jìn)細(xì)胞增殖[4]。有研究[5]顯示,Akt信號通路在病理性瘢痕組織中過度激活。本研究用Akt信號通路抑制劑處理病理性瘢痕成纖維細(xì)胞,探討其對病理性瘢痕成纖維細(xì)胞增殖、凋亡及細(xì)胞周期的影響,以期為病理性瘢痕的治療提供理論基礎(chǔ)。

    1 材料與方法

    1.1標(biāo)本及試劑收集2013年1月至2016年12月濰坊市益都中心醫(yī)院手術(shù)切除的病理性瘢痕組織50例,患者中男26例,女24例,年齡6~28歲,病程6~12個月。組織標(biāo)本采集均經(jīng)過患者及家屬知情同意。青鏈霉素、DMEM、胰蛋白酶為美國Sigma公司產(chǎn)品;胎牛血清為杭州四季青公司產(chǎn)品;Akt信號通路抑制劑LY294002為美國MCE公司產(chǎn)品;Annexin V-FITC/PI細(xì)胞凋亡檢測試劑盒為上海Bogoo公司產(chǎn)品;活化的含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶3(cleaved cysteinyl aspartate specific proteinase 3,Cleaved Caspase-3)抗體、活化的含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶9(cleaved cysteinyl aspartate specific proteinase 9,Cleaved Caspase-9)抗體為美國CTS公司產(chǎn)品;Akt抗體、p-Akt抗體為美國Santa Cruz公司產(chǎn)品。

    1.2細(xì)胞培養(yǎng)病理性瘢痕成纖維細(xì)胞分離培養(yǎng)方法參考文獻(xiàn)[6]。病理性瘢痕組織用生理鹽水洗滌3次后,將表皮以及皮下組織去除,用體積分?jǐn)?shù)75%的乙醇洗滌2次后,用含有青鏈霉素的PBS溶液洗滌3次,再用含有青鏈霉素的DMEM洗滌2次。將組織剪碎成大小約為1 mm3的組織塊,把組織塊涂在培養(yǎng)瓶的下壁,在組織塊上滴加2滴胎牛血清后,翻轉(zhuǎn)培養(yǎng)瓶,放在37 ℃、體積分?jǐn)?shù)5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2 h。將培養(yǎng)瓶再次翻轉(zhuǎn)至組織塊的貼壁面朝下,加入2 mL含有體積分?jǐn)?shù)20%胎牛血清的DMEM。每隔3 d更換1次培養(yǎng)液,培養(yǎng)14 d后,在組織塊周圍觀察有成纖維細(xì)胞出現(xiàn)后,將細(xì)胞培養(yǎng)液更換成含體積分?jǐn)?shù)15%胎牛血清的DMEM。當(dāng)細(xì)胞達(dá)到90%融合時,進(jìn)行傳代培養(yǎng)。用2.5 g/L的胰蛋白酶于37 ℃消化1 min。1 000 r/min離心10 min后,加入細(xì)胞培養(yǎng)液(含體積分?jǐn)?shù)15%胎牛血清),以12的比例接種培養(yǎng)。實驗用細(xì)胞均為第3代病理性瘢痕成纖維細(xì)胞。

    1.3MTT法檢測細(xì)胞增殖病理性瘢痕成纖維細(xì)胞以每孔1 000個細(xì)胞接種到96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中,觀察細(xì)胞貼壁后,在細(xì)胞培養(yǎng)液中加入適量的Akt信號通路抑制劑LY294002,使其終濃度為0、10、20、40、80 mg/L。培養(yǎng)48 h后,在每孔中加入20 μL的MTT溶液,37 ℃孵育4 h。將上清吸除后,加入150 μL的二甲基亞砜,觀察結(jié)晶物溶解后,酶標(biāo)儀檢測570 nm波長處每孔的吸光度值(A值),計算IC50。實驗重復(fù)3次,取均值。

    1.4流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞周期用IC50濃度的Akt信號通路抑制劑LY294002處理病理性瘢痕成纖維細(xì)胞48 h后,加入2.5 g/L的胰蛋白酶消化細(xì)胞,1 000 r/min離心10 min,棄上清,加入PBS洗滌2次,1 000 r/min離心10 min,棄上清,加入冰預(yù)冷的體積分?jǐn)?shù)70%的乙醇,4 ℃孵育1 h。1 000 r/min離心10 min后,棄上清,PBS 2 mL重懸細(xì)胞。再加入50 mg/L的PI 300 μL,4 ℃避光條件下染色30 min。流式細(xì)胞儀分析細(xì)胞周期。實驗重復(fù)3次,取均值。

    1.5流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡用IC50濃度的Akt信號通路抑制劑LY294002處理病理性瘢痕成纖維細(xì)胞48 h后,加入2.5 g/L的胰蛋白酶消化細(xì)胞,1 000 r/min離心10 min,棄上清,用冰預(yù)冷的PBS洗滌細(xì)胞2次,將細(xì)胞密度調(diào)整為106mL-1,1 000 r/min離心10 min,棄上清,加入300 μL的緩沖液,再加入5 μL的Annexin V-FITC和PI,流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡水平。實驗重復(fù)3次,取均值。

    1.6Westernblot檢測細(xì)胞中CleavedCaspase-3、CleavedCaspase-9、Akt、p-Akt水平用IC50濃度的Akt信號通路抑制劑LY294002處理病理性瘢痕成纖維細(xì)胞48 h后,將上清液吸除,加入RIPA裂解液,4 ℃裂解完全后,14 000 r/min離心15 min,吸取蛋白上清,與5×上樣緩沖液以體積比41的比例混勻后,煮沸變性。70 V電壓電泳至溴酚藍(lán)進(jìn)入到分離膠和濃縮膠交界處時,把電壓調(diào)整為110 V。2 h后,觀察溴酚藍(lán)進(jìn)入分離膠的底部時,關(guān)閉電源。200 mA冰浴轉(zhuǎn)膜90 min,將蛋白轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜上,牛血清白蛋白在室溫封閉2 h。與一抗4 ℃過夜反應(yīng)后,與辣根過氧化物標(biāo)記的二抗在室溫孵育2 h。顯色后,用Image J圖像處理軟件分析目的蛋白與GAPDH蛋白灰度值的比值,以此表示目的蛋白的表達(dá)水平。實驗重復(fù)3次,取均值。

    1.7統(tǒng)計學(xué)處理采用SPSS 21.0進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)處理。不同組間細(xì)胞A值的比較采用單因素方差分析,組間兩兩比較采用LSD-t檢驗;2組間細(xì)胞周期、凋亡率及Cleaved Caspase-3、Cleaved Caspase-9、Akt、p-Akt蛋白表達(dá)水平的比較均采用兩獨立樣本的t檢驗。檢驗水準(zhǔn)α=0.05。

    2 結(jié)果

    2.1細(xì)胞增殖檢測結(jié)果見表1。10、20、40、80 mg/L的Akt信號通路抑制劑作用后病理性瘢痕成纖維細(xì)胞的增殖活性逐漸降低,與0 mg/L作用組相比,差異均有統(tǒng)計學(xué)意義。計算其IC50為32.58 mg/L,后續(xù)用30 mg/L的Akt信號通路抑制劑處理病理性瘢痕成纖維細(xì)胞。

    表1 不同質(zhì)量濃度Akt信號通路抑制劑作用后病理性瘢痕成纖維細(xì)胞A值的變化(n=3)

    F=99.308,P<0.001;*:組間兩兩比較,P均<0.05

    2.2細(xì)胞周期檢測結(jié)果見表2。30 mg/L的Akt信號通路抑制劑作用后病理性瘢痕成纖維細(xì)胞被阻滯在G0/G1期。

    2.3細(xì)胞凋亡檢測結(jié)果見表2。30 mg/L的Akt信號通路抑制劑作用后病理性瘢痕成纖維細(xì)胞凋亡率明顯高于0 mg/L作用組,差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

    表2 Akt信號通路抑制劑作用后病理性瘢痕成纖維細(xì)胞周期及凋亡率的比較(n=3) %

    2.4CleavedCaspase-3、CleavedCaspase-9、Akt、p-Akt表達(dá)水平檢測結(jié)果見圖1和表3。30 mg/L的Akt信號通路抑制劑作用后病理性瘢痕成纖維細(xì)胞中Cleaved Caspase-3、Cleaved Caspase-9表達(dá)水平明顯高于0 mg/L作用組,而p-Akt表達(dá)水平明顯低于0 mg/L作用組,差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

    圖1 0、30 mg/L的Akt信號通路抑制劑作用后病理性瘢痕成纖維細(xì)胞中Cleaved Caspase-3、Cleaved Caspase-9、Akt、p-Akt表達(dá)水平

    表3 Akt信號通路抑制劑作用后病理性瘢痕成纖維細(xì)胞中Cleaved Caspase-3、Cleaved Caspase-9、Akt、p-Akt表達(dá)水平的比較(n=3)

    3 討論

    病理性瘢痕的形態(tài)較為多樣,常常高于正常的皮膚組織,表現(xiàn)為彈性差、質(zhì)脆等現(xiàn)象,在病變的早期,其表面呈現(xiàn)紫色或者是鮮紅色,在病變的晚期則呈現(xiàn)灰白色和蒼白色,同時常出現(xiàn)色素沉著的現(xiàn)象[7-9]。病理性瘢痕不僅嚴(yán)重影響美觀,還會損害正常組織的生理功能。目前對于病理性瘢痕的發(fā)病機制仍不清楚,燒傷、動物咬傷以及手術(shù)等醫(yī)療過程均能夠?qū)е虏±硇择:鄣漠a(chǎn)生,其產(chǎn)生的原因與成纖維細(xì)胞過度生長有關(guān),是一種病理性的纖維化過程[10]。成纖維細(xì)胞是皮膚創(chuàng)傷愈合的關(guān)鍵效應(yīng)細(xì)胞,其過度增殖也是瘢痕形成的主要原因[11]。

    Akt信號通路在心肌組織、腦組織、消化道等中均有廣泛表達(dá),并且在細(xì)胞生長、器官形成、胚胎發(fā)育過程中均有重要作用[12]。郭亮等[13]的研究顯示,運用Western blot、PCR和免疫組化等實驗技術(shù)檢測瘢痕組織和正常皮膚組織中Akt磷酸化水平發(fā)現(xiàn),瘢痕組織中Akt磷酸化水平高于正常皮膚組織。本研究首先體外分離培養(yǎng)了人病理性瘢痕成纖維細(xì)胞,用Akt信號通路特異性抑制劑作用后發(fā)現(xiàn),病理性瘢痕成纖維細(xì)胞的增殖活性降低,細(xì)胞生長受到抑制,細(xì)胞凋亡率升高,G0/G1期細(xì)胞增加。說明抑制Akt信號通路可以抑制病理性瘢痕成纖維細(xì)胞增殖,促進(jìn)細(xì)胞凋亡,阻滯細(xì)胞周期。

    細(xì)胞增殖、凋亡等生物學(xué)特性的發(fā)揮與細(xì)胞內(nèi)多種基因調(diào)控有關(guān),是一系列復(fù)雜過程的最終結(jié)果,Caspase蛋白家族是目前研究較多的與細(xì)胞凋亡發(fā)生有關(guān)的半胱氨酸蛋白酶。目前發(fā)現(xiàn)的Caspase蛋白家族成員至少有11種,根據(jù)其在凋亡信號轉(zhuǎn)導(dǎo)中的作用可以分為凋亡起始因子、凋亡執(zhí)行因子,其中Caspase-3是凋亡執(zhí)行因子,Caspase-9是凋亡起始因子[14-16]。正常情況下,細(xì)胞中的Caspase蛋白成員以無活性的酶原形式存在,當(dāng)受到外界信號刺激后活化發(fā)揮其生物學(xué)功能[17-18]。本研究結(jié)果顯示,Akt信號通路抑制劑作用后病理性瘢痕成纖維細(xì)胞中Cleaved Caspase-3、Cleaved Caspase-9表達(dá)水平升高。Caspase-3、Caspase-9活化水平升高,說明病理性瘢痕成纖維細(xì)胞凋亡增多,這與細(xì)胞凋亡檢測結(jié)果相一致。

    綜上所述,抑制Akt信號通路激活可以促進(jìn)病理性瘢痕成纖維細(xì)胞凋亡,阻滯細(xì)胞周期,抑制細(xì)胞生長,提高Caspase-3、Caspase-9活化水平,其作用機制需要在后續(xù)實驗中進(jìn)行探討。本研究結(jié)果為探討Akt信號通路在病理性瘢痕中的作用奠定了基礎(chǔ),為治療病理性瘢痕提供了理論依據(jù)。本研究存在一定的局限性,沒有探討Akt在體內(nèi)對瘢痕組織的作用,后續(xù)實驗中會對這一部分進(jìn)行完善和補充。

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