高濃度七氟醚通過(guò)抑制VEGF/PI3K/AKT信號(hào)通路誘導(dǎo)神經(jīng)干細(xì)胞凋亡的研究

尹楠 嚴(yán)恩石 劉莉 孫強(qiáng)

隨著宮內(nèi)胎兒治療技術(shù)的發(fā)展，麻醉藥物對(duì)胎兒及新生兒中樞神經(jīng)功能的影響也越來(lái)越引起更多的關(guān)注和研究。七氟醚作為臨床常見(jiàn)的吸入麻醉藥物，通常在2﹪的吸入濃度就可以達(dá)到維持孕期手術(shù)的最低濃度劑量，一旦吸入濃度超過(guò)3.5﹪就會(huì)對(duì)母體的血液循環(huán)產(chǎn)生影響，進(jìn)而影響胎兒的血供和健康[1-2]。最近的研究發(fā)現(xiàn)：在大腦早期發(fā)育階段接觸麻醉藥物會(huì)引起神經(jīng)的退行性改變和學(xué)習(xí)能力的受損，進(jìn)而出現(xiàn)神經(jīng)發(fā)育損傷和嬰兒出生后的認(rèn)知功能障礙[3-4]。因此七氟醚作為臨床中最為常見(jiàn)的吸入麻醉藥物，也是孕期手術(shù)患者首選的麻醉維持藥物，但是七氟醚對(duì)胚胎神經(jīng)干細(xì)胞生長(zhǎng)發(fā)育的研究卻十分有限。

神經(jīng)干細(xì)胞是一類具有高度的自我更新、增殖和多項(xiàng)分化潛能的細(xì)胞，因此中樞發(fā)育的窗口期神經(jīng)干細(xì)胞的數(shù)量和功能狀態(tài)會(huì)直接影響大腦的發(fā)育以及胎兒出生后的認(rèn)知學(xué)習(xí)功能[5-6]。最新的研究也證實(shí)了體外培養(yǎng)的大鼠神經(jīng)干細(xì)胞接受七氟醚的刺激后會(huì)影響其自我更新能力，但其潛在的分子機(jī)制尚不清楚[7-8]。

在本研究中，通過(guò)孕中期母鼠暴露于不同濃度七氟醚后，研究出生后小鼠的行為認(rèn)知功能以及神經(jīng)干細(xì)胞的凋亡情況，探索孕中期七氟醚暴露誘導(dǎo)神經(jīng)干細(xì)胞發(fā)生凋亡的具體潛在分子機(jī)制。

材料與方法

一、實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及儀器

實(shí)驗(yàn)動(dòng)物選擇SPF級(jí)雌性孕14 d的SD大鼠，購(gòu)自南京醫(yī)科大學(xué)附屬口腔醫(yī)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，相關(guān)實(shí)驗(yàn)內(nèi)容獲得醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)[CZEC（2017）-09]。MP150電生理記錄儀（美國(guó)Biopac公司）；熒光顯微鏡（日本Nikon公司）。

二、方法

1.分組方式：實(shí)驗(yàn)前動(dòng)物自由飲水?dāng)z食，自然光照明。以計(jì)算機(jī)生成隨機(jī)數(shù)字的方法將所有孕中期大鼠隨機(jī)分為3組，對(duì)照組，低濃度七氟醚組，高濃度七氟醚組，每組48只孕鼠。

2.建模方法：將14 d孕期的SD大鼠放入配有麻醉氣體檢測(cè)儀的麻醉箱內(nèi)，高濃度組吸入七氟醚濃度為3.5﹪，持續(xù)2 h；低濃度組吸入七氟醚濃度為2﹪，持續(xù)2 h，吸入氧濃度均為30﹪，對(duì)照組大鼠吸入30﹪濃度的氧氣，持續(xù)2 h。整個(gè)實(shí)驗(yàn)過(guò)程中大鼠始終保持自主呼吸，監(jiān)測(cè)大鼠脈搏、血壓、呼吸、心率，麻醉過(guò)程發(fā)生低血壓時(shí)進(jìn)行鼠尾靜脈注射0.3 mg/kg的腎上腺素。麻醉結(jié)束后將所有孕鼠放回飼養(yǎng)環(huán)境待特定時(shí)間點(diǎn)取胎鼠或子代大鼠腦組織進(jìn)行冰凍切片備用，時(shí)間點(diǎn)包括七氟醚吸入后6、24和 48 h，出生當(dāng)天（P 0），出生后 14 d（P 14），出生后28 d（P 28），每個(gè)時(shí)間點(diǎn)設(shè)置8只孕鼠以備實(shí)驗(yàn)取材。

3.免疫印跡法檢測(cè)胎鼠和新生小鼠海馬組織中Nestin及腦組織中血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（vascular endothelial growth factor，VEGF），磷 脂 酰 肌 醇 激酶（phosphatidylinositol 3-kinase，pi3k），蛋 白 激 酶B（AKT）和p-AKT的蛋白含量：檢測(cè)七氟醚麻醉后6 h胎鼠大腦組織中的VEGF，PI3K，p-AKT和AKT水平以及麻醉后6、24和48 h和出生后P 0、P 14、P 28幼鼠海馬組織中Nestin的表達(dá)水平，每只母鼠取3只胎鼠作為重復(fù)。

每組稱取0.1 g的組織樣品，加入500 μl蛋白裂解液處理組織后采用組織勻漿機(jī)充分粉碎勻漿，4℃，8 000×g，離心10 min，保留上清液以BAC 蛋白定量每個(gè)樣品的蛋白濃度，配平和煮樣變性后，經(jīng)SDS-PAGE凝膠電泳后轉(zhuǎn)膜至PVDF膜上，5﹪脫脂牛奶封閉2 h，抗VEGF、抗PI3K、抗p-AKT和抗 AKT 抗體分別以 1:1 000，1:200，1:200，1:200和1:100稀釋，并在4℃孵育過(guò)夜，以GAPDH作為內(nèi)參。隔天棄掉一抗，以TBST洗膜3次，每次10 min，后室溫孵育二抗2 h（1:10 000稀釋），重復(fù)TBST洗膜3次后，以天能ECL顯影系統(tǒng)進(jìn)行曝光，采用Image-Pro Plus6.0軟件測(cè)定條帶的灰度值，以目標(biāo)蛋白與GAPDH條帶的灰度值之比表示目標(biāo)蛋白的表達(dá)水平。

4.Nestin / TUNEL免疫熒光雙標(biāo)染色：選取麻醉后6、24和48 h以及在出生后P 0、P 14、P 28的胎鼠或幼鼠腦組織進(jìn)行免疫熒光染色（n= 8只妊娠母鼠，每只母鼠取3只胎鼠作為重復(fù)），采用4﹪多聚甲醛進(jìn)行組織固定后切成8 mm的冠狀腦切片，每只大鼠使用3個(gè)腦切片，與10﹪牛血清白蛋白在37 ℃的培養(yǎng)箱中孵育30 min進(jìn)行封閉，與抗Nestin抗體（1:100）于4 ℃冰箱孵育過(guò)夜。次日PBS沖洗3遍后，避光滴加兔抗鼠的二抗、TUNEL試劑（1:10）和 TRITC（1:50），37℃避光孵育 2 h，然后用 PBS洗滌3次，加入DAPI染色液孵育5 min后，用封固劑覆蓋載玻片，熒光顯微鏡下讀片。Nestin陽(yáng)性為紅色，代表神經(jīng)干細(xì)胞特異性標(biāo)志，鑒定為NSCs。DAPI陽(yáng)性為藍(lán)色，標(biāo)記細(xì)胞核。TUNEL陽(yáng)性為綠色，代表凋亡細(xì)胞。

5.細(xì)胞計(jì)數(shù)：在熒光顯微鏡上讀取免疫熒光圖像，并使用Image J軟件進(jìn)行圖像分析，計(jì)數(shù)海馬組織中神經(jīng)干細(xì)胞和凋亡神經(jīng)干細(xì)胞的數(shù)量，每只幼鼠以5個(gè)隨機(jī)切片進(jìn)行陽(yáng)性細(xì)胞的定量分析。

三、統(tǒng)計(jì)學(xué)分析方法

采用SPSS 22.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，免疫熒光染色圖像統(tǒng)計(jì)陽(yáng)性著色細(xì)胞數(shù)量，免疫印跡圖像進(jìn)行灰度值掃描后行半定量分析數(shù)據(jù)以± s表示。對(duì)照、低劑量和高劑量3組間比較進(jìn)行單因素方差分析，然后進(jìn)行Bonferroni事后檢驗(yàn)。以P＜0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

一、妊娠中期七氟醚暴露對(duì)孕鼠生命體征的影響

記錄七氟醚暴露過(guò)程中孕鼠的生命體征及低血壓等不良事件的發(fā)生情況證實(shí)，高濃度和低濃度的七氟醚暴露均會(huì)增加孕鼠術(shù)中低血壓事件的發(fā)生，其中對(duì)照組低血壓事件0，低濃度七氟醚暴露組低血壓事件2例，高濃度七氟醚暴露組低血壓事件3例，均以鼠尾靜脈注射0.3mg/kg的腎上腺素進(jìn)行糾正后恢復(fù)，但是不同濃度七氟醚暴露組之間低血壓事件的發(fā)生率差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

二、妊娠中期七氟醚暴露對(duì)胎兒及新生兒海馬組織中Nestin表達(dá)的影響

進(jìn)行Nestin的免疫染色證實(shí)：與對(duì)照組相比，低濃度七氟醚組的Nestin陽(yáng)性細(xì)胞在任何時(shí)間點(diǎn)差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。相反，在全部的6個(gè)時(shí)間點(diǎn)，高濃度七氟醚組中Nestin陽(yáng)性細(xì)胞的數(shù)量減少（P＜0.05，圖 1、2，表 1）。Western Blot結(jié)果證實(shí)，高濃度七氟醚組Nestin蛋白水平在所有時(shí)間點(diǎn)均低于對(duì)照組（P＜0.05，圖3）。這些結(jié)果均表明，妊娠中期高濃度的七氟醚暴露會(huì)抑制子代小鼠大腦中神經(jīng)干細(xì)胞的發(fā)育。

圖1 熒光顯微鏡下觀察各組胎鼠大腦神經(jīng)干細(xì)胞（Nestin染色，×400）

圖2 熒光顯微鏡下觀察出生后各組小鼠大腦神經(jīng)干細(xì)胞（Nestin染色，×400）

表1 在不同時(shí)間點(diǎn)Nestin染色陽(yáng)性細(xì)胞所占比例的定量分析（x± s）

圖3 免疫印跡檢測(cè)不同時(shí)間點(diǎn)大腦組織中Nestin蛋白的表達(dá)水平

三、妊娠中期七氟醚暴露對(duì)子代小鼠神經(jīng)干細(xì)胞凋亡情況的影響

Nestin / TUNEL雙標(biāo)染色陽(yáng)性被認(rèn)為是發(fā)生凋亡的神經(jīng)干細(xì)胞，從圖4、5的免疫熒光染色可見(jiàn)，在七氟醚暴露后的所有時(shí)間點(diǎn)，低濃度七氟醚組合對(duì)照組之間發(fā)生凋亡的神經(jīng)干細(xì)胞數(shù)量差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，但是高濃度七氟醚組小鼠在暴露后的6、24和48 h以及出生后的P 0、P 14發(fā)生凋亡的神經(jīng)干細(xì)胞數(shù)量高于對(duì)照組（P＜ 0.05，表2）。表明妊娠中期暴露于高濃度七氟醚會(huì)誘導(dǎo)胚胎及新生小鼠大腦的神經(jīng)干細(xì)胞發(fā)生凋亡。

四、妊娠中期七氟醚暴露對(duì)胎兒大腦中BAX，BAD，VEGF，PI3K，AKT和p-AKT蛋白水平的影響

Western Blot檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，高濃度七氟醚組VEGF，PI3K和p-AKT蛋白表達(dá)水平低于對(duì)照組，但是AKT總蛋白的表達(dá)在3組之間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，與此同時(shí)PI3K-AKT信號(hào)通路下游的凋亡相關(guān)蛋白BAX和BAD在高濃度組的表達(dá)高于對(duì)照組和低濃度組，證實(shí)妊娠中期暴露于高濃度的七氟醚會(huì)降低VEGF，PI3K和p-AKT蛋白水平，抑制EGFR-PI3K-AKT信號(hào)通路并誘導(dǎo)凋亡信號(hào)通路的活化，促使神經(jīng)干細(xì)胞發(fā)生早期凋亡。（圖6）

討 論

研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)妊娠中期進(jìn)行高濃度七氟醚的暴露會(huì)降低胎鼠及子代小鼠腦組織中VEGF，PI3K和p-AKT蛋白水平并誘導(dǎo)神經(jīng)干細(xì)胞發(fā)生凋亡，從而對(duì)子代的神經(jīng)干發(fā)育及認(rèn)知功能產(chǎn)生負(fù)作用，但是對(duì)于妊娠期七氟醚暴露造成的中樞功能障礙發(fā)生的具體機(jī)制一直不清楚。有學(xué)者認(rèn)為海馬組織中神經(jīng)干細(xì)胞數(shù)量的減少是子代動(dòng)物發(fā)生認(rèn)知功能障礙發(fā)生的基礎(chǔ)[9-10]。

圖4 熒光顯微鏡下觀察各組妊娠中期七氟醚暴露后胎鼠大腦神經(jīng)細(xì)胞（Nestin和TUNEL免疫熒光雙標(biāo)染色，×400）

圖5 熒光顯微鏡下觀察出生后各組七氟醚暴露后小鼠大腦神經(jīng)細(xì)胞（Nestin和TUNEL免疫熒光雙標(biāo)染色，×400）

表2 不同時(shí)間點(diǎn)Nestin和TUNEL染色雙陽(yáng)性細(xì)胞定量分析（± s）

表2 不同時(shí)間點(diǎn)Nestin和TUNEL染色雙陽(yáng)性細(xì)胞定量分析（± s）

注：與對(duì)照組比較，aP ＜ 0.05，與低濃度組比較，bP ＜ 0.01

分組 動(dòng)物數(shù) 6 h 24 h 48 h P 0 P 14 P 28對(duì)照組 8 0.91±0.07 0.96±0.04 0.95±0.05 0.97±0.03 0.96±0.03 0.95±0.05低濃度組 8 1.01±0.08 1.09±0.13 1.24±0.11a 1.01±0.09 1.22±0.12a 1.09±0.13高濃度組 8 2.62±0.21ab 2.49±0.17ab 2.51±0.13ab 2.21±0.15ab 1.89±0.14ab 1.69±0.19ab F值 399.00 364.37 524.52 378.31 158.33 66.83 P 值 ＜ 0.01 ＜ 0.01 ＜ 0.01 ＜ 0.01 ＜ 0.01 ＜ 0.01

圖6 妊娠中期七氟醚暴露6 h后，免疫印跡檢測(cè)胎鼠腦組織中BAX，BAD，VEGF，PI3K，p-AKT和AKT的表達(dá)水平

妊娠中期是胚胎神經(jīng)發(fā)育的重要時(shí)期，在此期間，大腦中神經(jīng)前體細(xì)胞通過(guò)增殖、凋亡、遷移和分化逐漸形成海馬組織[11]。因此，在此期間接觸麻醉藥物會(huì)影響神經(jīng)干細(xì)胞的數(shù)量和功能，從而導(dǎo)致中樞認(rèn)知功能障礙[12]。在本研究中，發(fā)現(xiàn)在妊娠中期接觸高濃度七氟醚可以使胎兒大腦以及出生后子代的海馬組織中的神經(jīng)干細(xì)胞數(shù)量減少，由于神經(jīng)干細(xì)胞數(shù)量的減少會(huì)影響后續(xù)海馬發(fā)育并導(dǎo)致學(xué)習(xí)和記憶功能障礙。TUNEL和Nestin的免疫熒光染色顯示高濃度七氟醚所引起神經(jīng)干細(xì)胞凋亡作用會(huì)持續(xù)到出生后的第14天。這提示保護(hù)性或代償性機(jī)制可能在出生后第28天能在一定程度上減少凋亡神經(jīng)干細(xì)胞的數(shù)量。然而，這種保護(hù)機(jī)制并不能逆轉(zhuǎn)高濃度七氟醚的神經(jīng)損傷效應(yīng)。同時(shí)本研究觀察到在高濃度七氟醚組中，與七氟醚暴露后的6、24和48 h的胎鼠相比，出生后第0天的幼鼠的細(xì)胞凋亡降低，因此推測(cè)隨著時(shí)間的推移，胎兒會(huì)啟動(dòng)某種類型的補(bǔ)償機(jī)制。但是，由于妊娠中期對(duì)海馬組織發(fā)育至關(guān)重要，高濃度七氟醚造成的損害仍然存在。

VEGF對(duì)神經(jīng)系統(tǒng)的發(fā)育至關(guān)重要，由于VEGF介導(dǎo)的血管生成對(duì)胚胎發(fā)育非常重要，VEGF的缺失會(huì)引發(fā)神經(jīng)干細(xì)胞出現(xiàn)凋亡[13-14]。本研究結(jié)果首次發(fā)現(xiàn)，暴露于高濃度七氟醚會(huì)下調(diào)胎鼠大腦中的PI3K和p-AKT蛋白水平。既往研究表明，激活PI3K / AKT途徑可減少麻醉誘導(dǎo)的神經(jīng)干細(xì)胞凋亡，增強(qiáng)學(xué)習(xí)和記憶能力，例如采用米諾環(huán)素預(yù)處理激活PI3K / AKT途徑以減少因接觸氯胺酮引起的神經(jīng)損傷并改善成年期的行為表現(xiàn)[15]；利用右美沙芬通過(guò)激活PI3K / AKT信號(hào)通路減少異丙酚誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡和認(rèn)知障礙[16]，綜合以上結(jié)果，認(rèn)為高濃度七氟醚可通過(guò)抑制VEGF / PI3K / AKT通路從而誘導(dǎo)神經(jīng)干細(xì)胞發(fā)生凋亡。

綜上所述，本研究證實(shí)：臨床實(shí)踐中常用的低濃度七氟醚對(duì)神經(jīng)干細(xì)胞凋亡或數(shù)量不會(huì)造成影響，這表明它可以在妊娠期婦女的手術(shù)中安全的使用，但是，高濃度七氟醚會(huì)導(dǎo)致神經(jīng)干細(xì)胞發(fā)生凋亡和數(shù)量的減少，從而打破了細(xì)胞增殖和細(xì)胞死亡之間的平衡，擾亂了中樞神經(jīng)系統(tǒng)的正常發(fā)育，導(dǎo)致后代的學(xué)習(xí)和記憶功能出現(xiàn)障礙。因此，應(yīng)盡量避免在懷孕期間使用高濃度的七氟醚進(jìn)行麻醉和手術(shù)。