快速檢測技術在水產(chǎn)品檢測中的應用現(xiàn)狀及發(fā)展前景

鄭 琳,王小博

(佛山職業(yè)技術學院,廣東佛山 528000)

水產(chǎn)品因具有獨特的風味和豐富的營養(yǎng),且能提供多種有益元素,而越來越受消費者的喜愛。2016年全國水產(chǎn)品總產(chǎn)量達6.70×107t,比上年增長3.69%。其中,養(yǎng)殖產(chǎn)量4.94×107t,同比增長3.99%。然而我國水產(chǎn)品出口量僅為4.06×106t,所占比重極低[1]。水產(chǎn)品的品質及質量嚴重影響了其出口產(chǎn)量[2]。近些年來水產(chǎn)品安全問題的形勢日趨嚴峻,各種污染物是導致我國食品安全事故的重要原因。快速檢測是指包括樣品處理在內(nèi)，能夠在短時間內(nèi)能對樣品進行檢測并出具結果的行為，所需儀器設備簡單、便攜，能夠實現(xiàn)現(xiàn)場檢測。食品快速檢測技術,是相對于常規(guī)的理化檢測、微生物檢測、儀器檢測而言的,其特點是檢測耗時短,對儀器設備等條件的要求較低,可現(xiàn)場實施檢測。水產(chǎn)品快速檢測在水產(chǎn)食品安全監(jiān)管中發(fā)揮了不可替代的作用,有效保障了水產(chǎn)品的品質安全。本文對水產(chǎn)品面臨的安全風險及近年來發(fā)展的快速檢測技術的應用現(xiàn)狀及發(fā)展前景進行了綜述。

1 我國水產(chǎn)品面臨的安全風險

1.1 生物性危害

水產(chǎn)品中生物性危害導致的疾病占所有危害的80%以上,且多為不確定因素,難以控制,是導致水產(chǎn)品食源性疾病的主要因素[3]。依附于水產(chǎn)品中的致病微生物可通過食物鏈對人產(chǎn)生多種危害,主要表現(xiàn)為敗血癥、胃腸炎、肝炎、腹痛、發(fā)熱、傷寒、皮炎、痢疾等。水產(chǎn)品中生物性危害大致來源于兩類：一類是水產(chǎn)品自身帶有的致病菌,廣泛存在于養(yǎng)殖水域中,主要包括副溶血弧菌(V.parahaemolyticus)、李斯特菌(L.monocytogenes)、肉毒梭菌(Clostridiumbotulinum)等[4];另一類是人為污染的致病菌,主要是水產(chǎn)品在養(yǎng)殖、生產(chǎn)、加工過程中受到的污染,如大腸桿菌(E.coli)、沙門氏菌(Salmonellaspp.)、金黃色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)等[5]。鮮活水產(chǎn)品自身攜帶的致病菌含量往往很低,但其在加工、運輸、貯藏、銷售過程中會極易受到污染并迅速繁殖,進而對人體產(chǎn)生危害[6]。病毒也是常見的誘發(fā)食源性疾病的有害因子,水產(chǎn)品中的雙殼軟體動物易于攜帶病毒進而導致食源性疾病暴發(fā)。但是通常水產(chǎn)品中只有少數(shù)幾種病毒可引起相關的疾病,如甲肝病毒(HapatitisAvirus,HAV)、諾如病毒(Norovirus,NV)、小杯病毒(Calicivirus)等。水產(chǎn)品自身一般較少含有病毒,主要來源于受污染的水域及加工過程中帶病毒的食品加工者[6]。此外,寄生蟲(如線蟲、絳蟲、吸蟲等),水產(chǎn)品自身所帶的毒素(如河豚毒素、貝類毒素、藍藻毒素等),以及一些過敏原等都是影響人類健康的生物性危害。

1.2 化學性危害

由于環(huán)境污染、化學試劑的濫用等原因,化學污染物成為導致我國食品安全事故的主要原因,占水產(chǎn)品安全事故的6.96%[7]。水產(chǎn)品化學污染物包括藥物殘留、毒素殘留、重金屬、環(huán)境污染物以及食品加工過程形成的有害物質。藥物殘留是目前我國水產(chǎn)品最為嚴重的危害因素之一,由于養(yǎng)殖動物防病和生長發(fā)育的需要,養(yǎng)殖戶在養(yǎng)殖過程中會有意或無意中通過直接或間接渠道添加或投放漁藥或動物激素,這些藥物或激素往往殘留于動物肌肉或組織中,并且由于其具有耐熱耐酶解等特性,很難在加工過程中去除,進而殘留于水產(chǎn)品中。近年來，由于漁藥及非法添加物濫用等導致的水產(chǎn)品污染事件時有發(fā)生。2015、2017年食藥監(jiān)總局抽查結果發(fā)現(xiàn),中國市售鮮活水產(chǎn)品抽查結果發(fā)現(xiàn)鯉魚、鱸魚等多存在恩諾沙星超標,甚至一些桂魚、黑魚中違規(guī)添加孔雀石綠等[8],多寶魚、黑魚、鱖魚等存在孔雀石綠、硝基呋喃代謝物和氯霉素超標[9]。重金屬主要來源于受污染的養(yǎng)殖環(huán)境,并在水產(chǎn)動植物中富集。目前養(yǎng)殖水域污染日發(fā)嚴重,這一危害在水產(chǎn)品中表現(xiàn)的尤為突出。同時富集于環(huán)境中的各類污染物,如多環(huán)芳烴、多氯聯(lián)苯、多溴聯(lián)苯等也會對水產(chǎn)品帶來嚴重的污染。此外,水產(chǎn)品在生產(chǎn)、銷售過程中使用的各類化學添加劑、清潔劑,包裝中的化學物質污染等都是水產(chǎn)品化學污染物的重要來源。

1.3 物理性危害

水產(chǎn)品的物理性危害通常是指從外部進入水產(chǎn)品中的物體及異物,一般包括在食品中非正常性出現(xiàn)的能引起疾病(包括心理創(chuàng)傷和對消費者帶來傷害)任何物理性物質。引起物理性危害的因素多種多樣,如捕撈、運輸過程中帶入的金屬、玻璃、昆蟲、泥沙、涂料碎片、紙張碎片、骨頭碎片、機械碎屑等,以及生產(chǎn)、加工過程中帶入的毛發(fā)、首飾、器具、塑料、棉線等[10],都會給消費者帶來物理傷害。同時,進入水產(chǎn)品中的放射性物質也是引起物理傷害的重要因素。

2 快速檢測技術

水產(chǎn)品中危害物常規(guī)的檢測技術主要包括:生物學檢測技術,如致嘔吐實驗、毒生長抑制實驗、細胞毒性實驗等等;以及儀器設備檢測技術,如光譜法、色譜法、氣/液相-質譜聯(lián)用法等等。這些方法特異性強、靈敏度高、檢測限低、精確度高,往往可以達到理想的檢測水平。但是,在實際檢測過程中,這些常規(guī)檢測技術前處理繁瑣,耗時較多,操作只能局限于實驗室樣品,同時所需儀器造價高昂,檢測成本高,技術要求苛刻,不適合對大批量樣品檢測及現(xiàn)場快速篩查。水產(chǎn)品作為一種高速消耗品,市場流通性強、產(chǎn)品貨架期短,常規(guī)的檢測方法難以滿足水產(chǎn)品快速檢測的要求。為滿足對水產(chǎn)品質量安全實時有效監(jiān)控,水產(chǎn)品的快速檢測技術因其快捷性和高效性，得到了快速發(fā)展,目前常見的快速檢測技術主要有免疫技術、化學檢測技術、傳感器技術、生物芯片技術以及分子生物學技術、ATP生物發(fā)光技術等。

2.1 免疫分析技術

免疫分析技術是目前生物學檢測中用途最廣泛的一種快速檢測方法。它是采用對各種示蹤物質(熒光素、同位素或酶等)標記抗體(或抗原)進行抗原-抗體反應,并對免疫復合物中的標記物的測定,對各種目標物,進行定性、定量分析的一種檢測技術。免疫技術具有高度精確、靈敏、特異的特點,對樣品前處理要求較低、操作簡單,檢測過程中不需要大型貴重儀器,檢測成本低,特別適合對高通量樣本的快速檢測[11]。免疫分析技術主要包括酶聯(lián)免疫、放射性免疫、化學發(fā)光免疫和熒光免疫、膠體金免疫等。常用于檢測食品中藥物殘留、微生物、生物毒素及真菌毒素等有害物質。

2.1.1 酶聯(lián)免疫檢測技術 酶聯(lián)免疫檢測技術指通過酶標記抗體(或抗原)進行的抗原抗體反應,然后通過酶與底物產(chǎn)生顏色反應,用于對目標物定量測定的分析技術。該法操作簡便,樣品前處理簡單,可直接對樣品進行檢測。由于酶促反應效率高,可迅速而高倍數(shù)地放大反應效果,大大提高了靈敏度。目前已經(jīng)開發(fā)了一系列ELISA 檢測試劑盒,被廣泛應用于恩諾沙星、磺胺類、氯霉素等藥物殘留[12-13]及真菌毒素[14]、貝類毒素[15]等的快速檢測。盡管酶聯(lián)免疫法檢測快捷、高效,但由于樣品前處理簡化易受樣本基質干擾,導致測試結果易出現(xiàn)假陽性現(xiàn)象,同時所需抗原抗體的研究技術高、制作條件苛刻、成本昂貴。

2.1.2 膠體金免疫層析技術 膠體金免疫層析技術是以膠體金作為顯色媒介的示蹤標志物,同時利用抗原抗體特異性結合的原理,并在層析過程完成這一反應,進而達到檢測目的的一種免疫標記技術。膠體金是由氯金酸在還原劑(如磷、抗壞血酸、枸櫞酸鈉、鞣酸等)的作用下,聚合成特定大小的金顆粒,并在靜電作用下形成穩(wěn)定的膠體狀態(tài)[16]。膠體金本身為紅色,當抗原與抗體特異性反應的金顆粒達到特定數(shù)目時,不需要加入發(fā)色試劑便可觀察到紅色條帶,根據(jù)紅色條帶顏色深淺即可對檢測結果進行判斷。膠體金免疫層析技術使用方便、反應迅速、成本低廉,不需要特殊的儀器設備,特異性強、穩(wěn)定性好、靈敏度高、應用范圍廣,特別適合大批量樣本的現(xiàn)場快速篩查。目前,膠體金免疫層析技術已被廣泛的應用于水產(chǎn)品中毒素殘留、藥物殘留、食源性致病菌的檢測。如羅敏[17]制備了能同時檢測水產(chǎn)品中多種磺胺類藥物殘留的膠體金免疫層析試紙條,檢測靈敏度可達到100 ng/mL,符合國家對該類藥物的殘留檢測限量標準,適用于磺胺類藥物的多殘留檢測;Zhou等[18]建立了河豚魚組織中的河豚毒素膠體金一步免疫層析法,其檢測靈敏度達到了20 ng/mL,準確性非常高,同時檢測耗時短,適合現(xiàn)場快速檢測。

2.1.3 放射性免疫分析技術 放射性免疫分析是利用同位素對抗原或抗體進行標記,然后與被測的抗體或抗原結合,形成具有放射性的抗原抗體復合物,進而對其進行分析的一種檢測技術。它既具有免疫反應的高特異性,又具有放射性測量的高靈敏度,因此能精確測定各種具有免疫活性的極微量的物質。該法幾乎能應用于所有激素的分析(包括多肽類和固醇類激素),還能用于各種蛋白質、抗原以及一些小分子物質和藥物的分析,應用范圍極其廣泛。如鄭晶[19]應用放射性免疫分析方法快速篩檢烤鰻中四環(huán)素族藥物殘留,檢測限可達到50 μg/kg,檢測全過程可在80 min內(nèi)完成。但是,該法只能測得具有免疫活性的物質,對失去免疫活性的物質不可檢測。因此放射性免疫分析技術測定結果與生物測定結果可能不一致,同時存在放射性污染問題,因此在使用時應多加注意。

2.1.4 化學發(fā)光免疫分析技術 化學發(fā)光免疫分析是用化學發(fā)光劑直接標記抗體或抗原的一類免疫檢測方法,既包含了免疫化學反應又增加了化學發(fā)光反應部分?；瘜W發(fā)光免疫分析方法因其靈敏度高、特異性好、分析速度快、操作簡便等優(yōu)勢,在食品安全檢測領域得到了快速發(fā)展。Wu等[20]建立了磺胺-5-甲氧嘧啶的化學發(fā)光免疫分析方法,該方法可使其檢測限達到 3.2 μg/mL,檢測結果極其準確;Tao等[21]以scFv 單鏈抗體建立了魚和蝦中ENR等20 種喹諾酮類藥物殘留的化學發(fā)光免疫檢測方法,檢測結果與LC-MS/MS 檢測結果符合度較高,能滿足當前各國對水產(chǎn)品中喹諾酮藥物殘留限量的要求。但是,化學發(fā)光免疫分析法依舊存在許多不足,例如發(fā)光體系較為單一、檢測儀器較大、小分子檢測的精密度有限等問題。隨著研究深入,以及基因工程,抗原、抗體的制備廣泛應用,相信不久的將來，化學發(fā)光免疫分析法會更加完善。

2.1.5 熒光免疫分析技術 熒光免疫技術是將免疫學方法與熒光標記技術結合起來的一種痕量檢測方法。采用熒光物質標記抗體或抗原分子,再與被測物發(fā)生特異性結合,利用熒光分析儀測定熒光物質受激發(fā)光照射后發(fā)出的熒光強度或偏振幅度等,進而實現(xiàn)對目標物質的定性定量分析。熒光免疫分析技術由于其高特異性近年來得到了廣泛應用。如Yang等[22]采用熒光免疫技術對水樣中克百威進行了檢測,其檢出限可達2.3 ng/mL,進而保證了水產(chǎn)養(yǎng)殖環(huán)境的安全。但是,相比于ELISA檢測技術，熒光免疫法靈敏度相對偏低,同時基質效應會對熒光測定帶來干擾。

2.2 化學比色法

化學比色法是運用快速產(chǎn)生明顯顏色的化學反應來檢測目標物質,通過比較或分析有色物質溶液顏色及深度來定性、半定量的檢測方法?；瘜W比色法常用來檢測水產(chǎn)品中的藥物殘留、重金屬殘留、有害物質以及微生物等。如周秀錦[23]等采用化學比色法檢測水產(chǎn)品中殘留的磺胺類藥物,靈敏度最低可達 50 μg/kg,能夠實現(xiàn)水產(chǎn)樣品中多種磺胺類藥物的現(xiàn)場快速檢測。該法操作非常簡單,反應效果極其明顯,價格低廉,非常適合對高通量樣本的快速檢測。但是,化學比色法一次只能檢測一種或者一類有害物質,同時顯色反應往往需要加熱,易受其他物質的干擾,精確度低,不適宜對精度要求較高、定量樣品的檢測。

2.3 生物傳感器技術

生物傳感器是利用一種對生物物質敏感的元件并能夠產(chǎn)生與待測物質濃度成比例的信號傳導器結合起來的一種分析裝置,可以將生物學信息轉換為電信號進行檢測的儀器[24]。接收器上固定的敏感材料(抗原、抗體、核酸等生物活性物質)能與被檢因子發(fā)生特異性結合,并產(chǎn)生一系列的物理化學信號,經(jīng)換能器將信號轉變成電信號后并被放大,從而完成對目標物質的測定。與其他檢測技術相比,生物傳感器具有專一性強、準確度高、分析速度快、操作簡單、檢測成本低、可重復使用等優(yōu)點[24]。根據(jù)生物傳感器中分子識別元件的不同,生物傳感器可分為5類:酶傳感器、免疫傳感器、微生物傳感器、組織傳感器、細胞器傳感器。酶傳感器是將酶作為生物敏感元件,其特點是選擇性好,可直接在復雜試樣中進行測定,響應速度快,靈敏度高,能夠實現(xiàn)在線監(jiān)測;免疫傳感器是基于抗原抗體特異性識別功能的一類生物傳感器,其不僅節(jié)約了檢測時間，提高了靈敏度和準確度,也使得測定過程變得簡單,易于實現(xiàn)自動化;微生物傳感器是由固定化微生物細胞與電化學裝置結合而成的新型生物傳感器,該傳感器價格低廉、易于完成、使用壽命長;組織傳感器以動、植物組織薄層切片作為感受器的一類生物傳感器,其特點是相對穩(wěn)定,且易于取材及推廣;細胞器傳感器由將活細胞作為敏感元件的一類生物傳感器,其可完成實時、動態(tài)、快速和微量的生物檢測,同時污染相對較低。生物傳感器技術在水產(chǎn)品危害物質檢測中已被廣泛應用,主要用于對藥物殘留、食品添加劑、有毒有害物質、食品成分及鮮度的檢測[25]。根據(jù)抗體與氯霉素代謝物氯霉素-葡萄糖苷酸有很好的免疫交叉反應,Ashwin等[26]建立了動物產(chǎn)品中檢測氯霉素的免疫傳感器芯片技術,將其進一步應用到了水產(chǎn)檢測中并取到了良好的效果;Andrea等[27]利用2種方法將抗體通過共價作用與納米孔硅片薄膜進行生物結合,制成了檢測病毒的微生物傳感器并對MS2病毒進行了檢測,結果發(fā)現(xiàn)其檢測效果高效、靈敏度極高。盡管生物傳感器優(yōu)勢較強,但也存在明顯不足,如酶傳感器易受干擾,免疫傳感器制作復雜、價格昂貴,細胞傳感器再生性細胞選擇較為單一等等,都制約著生物傳感器的發(fā)展。

2.4 分子生物學技術

分子生物學檢測技術是一種通過檢測分子水平的線性結構(如核酸序列)來對目標物(通常為微生物)進行鑒定的一種檢測技術。分子生物學技術主要包括基因探針技術、聚合酶鏈反應(PCR)等。

2.4.1 基因探針技術 基因探針技術又叫分子雜交技術,是根據(jù)核酸分子變性、復性以及高度的堿基互補配對原則,將一段特異性核酸序列(DNA或者RNA)進行標記制成基因探針,并進行分子雜交實驗,同時對樣本與標記的基因探針形成的雜交信號進行檢驗,據(jù)此判定首件樣本中是否含有目標物。與其他檢測方法相比,基因探針技術,特異性強,靈敏度高,檢測時間短,操作簡單、結果精確[28]。目前,基因探針技術已被廣泛應用于水產(chǎn)品中各類致病微生物、病毒等的檢測。盡管基因探針技術有著不可比擬的優(yōu)勢,但是依然存在著明顯的不足,例如檢測成本較高、效率較低,因此在以后的應用中還需要不斷的完善。

2.4.2 PCR檢測技術 PCR檢測技術,它是一種體外放大擴增特定的核酸片段的分子生物學技術。其原理是利用微生物遺傳物質中各菌屬菌種高度特異性的核酸序列,從己知序列庫中找到特異的引物片段以及所需擴增的目的基因片段,對提取得到的核酸片段進行擴增,并對擴增結果進行觀察判斷[29]。PCR檢測技術操作簡單、準確度高、特異性強、檢測時間短,能對檢測樣品同時進行定性定量分析。在水產(chǎn)品中常被用來檢測微生物及生物毒素。如,Asim[30]通過 PCR 技術對牡蠣中的沙門氏菌進行檢測,其檢出限可達1～10 CFU/g;Galluzzi[31]等建立了PCR 技術檢測貽貝中的麻痹性神經(jīng)毒素的方法,并取得了良好的檢測結果。

2.5 生物芯片技術

生物芯片是指將抗體、抗原、核苷酸、cDNA、genomic DNA、多肽等生物分子固定于固相載體上,形成生物分子點陣列,通過分子雜交或特異性結合的方式,進而達到對目標物快速檢測[32]。生物芯片技術具有快速、準確、靈敏、高通量和適用范圍廣等特點。生物芯片可分為基因芯片、免疫芯片、蛋白芯片。生物芯片技術可以同時將大量探針固定于支持物上,可實現(xiàn)同時檢測多種目標分子,而且檢測效率高、周期短[23]。生物芯片技術已被用于檢測水產(chǎn)品中的各類有害污染物。Zou等[34]建立了可同時檢測水產(chǎn)品中3種漁藥殘留的小分子微陣列芯片,檢測時間大大縮短,檢測回收率高、結果準確;左鵬等[35]利用蛋白芯片競爭法快速準確測定動物源性食品中氯霉素、磺胺二甲嘧啶的殘留量,該方法快速、準確、高效。

2.6 ATP生物發(fā)光檢測技術

ATP 生物發(fā)光檢測技術是當熒光素酶(Lciferase)、熒光素(Luciferin)、三磷酸腺苷(ATP)和O2為底物,在Mg2+存在時,能將微生物產(chǎn)生的化學能轉化為光能。由于微生物細胞裂解時會有ATP釋放出,因此在有O2時,熒光素會與之發(fā)生氧化反應并發(fā)出熒光,根據(jù)熒光的強弱,即可對微生物污染狀況進行檢測。與傳統(tǒng)的微生物檢測方法相比,ATP生物發(fā)光法具有簡便、快速、靈敏、高效的特點,同時檢測儀器小型化便于攜帶,非常適合現(xiàn)場實時監(jiān)測。ATP生物發(fā)光技術,已被廣泛的應用于檢測產(chǎn)品以及生產(chǎn)、養(yǎng)殖環(huán)境中微生物的含量。李利霞等[36]建立的食品中細菌總數(shù)的ATP生物發(fā)光檢測技術,檢測結果非常準確,加標回收率均在82.2%以上;通過比較,Deininger[37]發(fā)現(xiàn)ATP生物發(fā)光法的檢測結果與傳統(tǒng)微生物檢測結果相一致,進一步說明了該法準確性好、適用性強。

3 展望

食品快速檢測技術,可以及時控制、減輕、消除食品突發(fā)事故及有毒有害物質對人體潛在的危害,降低食品中毒發(fā)生率,提高工作效率,因此大力發(fā)展食品安全快速檢測技術是一項利國利民的大事。隨著研究的深入,水產(chǎn)品中的有害物質將會被充分認識,一些未知的有害物質也會被逐步發(fā)現(xiàn),這些污染物的含量往往是極其微量的。但是目前應用的水產(chǎn)品快速檢測技術,檢測限依舊偏高,痕量污染物難以被檢出,這就促使快速檢測技術要達到更低的檢測限、更高的靈敏度。同時快速檢測技術,尤其是免疫檢測技術,往往存在假陽性率較高的情況，這大大影響了快速檢測的準確性,干擾了檢測結果的精度。因此,未來幾年,在保證檢測時間盡可能短的前提下,食品快速檢測技術要盡可能的提高檢測精度,避免假陽性出現(xiàn),提高檢測結果的準確性,并逐漸實現(xiàn)由定性、半定量檢測到定量檢測。隨著高新技術的普及應用,檢測儀器更加趨向于智能化、微型化、一體化、便攜化、集成化,進而達到可以快速準確的進行現(xiàn)場實時檢測甚至實現(xiàn)在復雜混合物中對污染物直接進行檢測。

因此,隨著研究的不斷深入,食品快速檢測技術正朝著簡捷化、多元化、高效化、痕量化、標準化、經(jīng)濟化以及高通量、專一性的方向發(fā)展。同時隨著養(yǎng)殖環(huán)境污染加劇,養(yǎng)殖條件惡化,針對水產(chǎn)品中各類有毒有害物質、藥物殘留、致病微生物等的檢測會逐步趨向日?；?并在保障水產(chǎn)品的安全中發(fā)揮越來越重要的作用。

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