微流控技術(shù)在臨床檢測(cè)中的應(yīng)用

沈韌 萬諒 賈艷偉

微流控技術(shù)是一種對(duì)微尺度流體（微升到皮升量級(jí)）進(jìn)行精確控制和操縱的技術(shù)。近二三十年來，得益于納米制造技術(shù)的成熟與生化技術(shù)對(duì)操縱微量液體的需求，微流控技術(shù)取得了飛速的發(fā)展。與傳統(tǒng)的檢測(cè)方法相比，基于微流控平臺(tái)的檢測(cè)技術(shù)具有節(jié)省樣本與試劑用量，反應(yīng)速度更快，高通量，易便攜，自動(dòng)化潛力高等優(yōu)勢(shì)。1998年Burns等［1］提出的將多種生物、化學(xué)分析功能整合在一張微小芯片上的“芯片實(shí)驗(yàn)室”（lab-on-a-chip，LOC）的概念，展示了微流控技術(shù)應(yīng)用于臨床檢測(cè)、精準(zhǔn)醫(yī)療的美好前景。近年來，開發(fā)“芯片實(shí)驗(yàn)室”，又稱“微型全分析系統(tǒng)”，已經(jīng)發(fā)展為一個(gè)物理、微電子、材料、化學(xué)、生物、醫(yī)學(xué)等多學(xué)科交叉的新型研究領(lǐng)域。本文主要介紹了微流控技術(shù)的分類、原理，以及其在臨床核酸檢測(cè)、免疫蛋白檢測(cè)、藥物篩查等方面的應(yīng)用，以展示該技術(shù)在臨床檢測(cè)領(lǐng)域的應(yīng)用前景及挑戰(zhàn)。

1 微流控的分類及原理

微流控技術(shù)有很多不同的細(xì)分領(lǐng)域?；诒徊倏氐囊后w形態(tài)，微流控技術(shù)可簡(jiǎn)單分為連續(xù)流體微流控（continuous-flow microfluidics）和液滴微流控（droplet microfluidics）?；谝后w移動(dòng)的路徑，微流控技術(shù)可分為通道微流控（channel-based microfluidics）和基于開放平臺(tái)的微流控技術(shù)（open platform microfluidics）。

通道微流控通過在玻璃、硅片、高分子聚合物如聚二甲基矽氧烷（polydimethylsiloxane，PDMS）、聚甲基丙烯酸甲酯（polymethyl methacrylate，PMMA）等材料上構(gòu)建微流通道［2-5］，利用閥門、泵等部件控制液體流速。由于PDMS價(jià)格便宜、制造方便、透明、具有較高的生物相容性，基于PDMS的微流控芯片獲得了廣泛的應(yīng)用。

基于開放平臺(tái)的微流控技術(shù)使得被操控的液滴不限于在通道中流動(dòng)，比如基于電潤(rùn)濕現(xiàn)象［6］（electrowetting on dielectric，EWOD）開發(fā)的數(shù)字微流控技術(shù)（digital microfluidics，DMF）［7］。液體在介電表面的電潤(rùn)濕現(xiàn)象是指當(dāng)液滴位于鍍有一層疏水性介電層的平面電極陣列之上，對(duì)電極通電時(shí)，液滴與通電電極接觸位置的接觸角會(huì)變小，從而促使液滴移動(dòng)。因此可以通過電路控制來操控微升到皮升量級(jí)的離散液滴進(jìn)行移動(dòng)、融合、分裂等動(dòng)作。此外，除了加以電場(chǎng)驅(qū)動(dòng)液滴［8-10］，還有利用光敏材料的光驅(qū)動(dòng)型［11］、利用壓電材料的力驅(qū)動(dòng)型［12］和表面聲波驅(qū)動(dòng)型［13］等數(shù)字微流控技術(shù)。與傳統(tǒng)的管道式微流技術(shù)相比，數(shù)字微流控技術(shù)無需泵、閥門等外接部件即可對(duì)離散液滴進(jìn)行獨(dú)立控制，也更容易與溫控系統(tǒng)整合，更具有集成化、自動(dòng)化的潛力。

此外，紙質(zhì)微流控［14］也屬于基于開放平臺(tái)的微流控技術(shù)，其原理是通過在紙基質(zhì)上構(gòu)建親水通道來驅(qū)動(dòng)液滴被動(dòng)移動(dòng)。由于紙基質(zhì)成本與其它基質(zhì)相比大為降低，紙質(zhì)微流控技術(shù)也吸引了眾多研究者的目光［7，15］。

2 微流控在臨床檢測(cè)領(lǐng)域的應(yīng)用及進(jìn)展

微流控技術(shù)的發(fā)展促進(jìn)了臨床檢測(cè)領(lǐng)域“即時(shí)檢驗(yàn)”（point-of-care testing，POCT）［16］概念的誕生與發(fā)展。“即時(shí)檢驗(yàn)”是指在照顧病人的當(dāng)下即可使用的醫(yī)學(xué)檢測(cè)方法，其檢測(cè)設(shè)備需要具有便攜性、操作簡(jiǎn)單、檢測(cè)速度快、結(jié)果準(zhǔn)確可靠，可由非專業(yè)檢驗(yàn)人員甚至病人自己操作，可極大減輕專業(yè)醫(yī)學(xué)檢測(cè)人員的負(fù)擔(dān)。目前微流控技術(shù)已在臨床檢測(cè)的多個(gè)方面如核酸檢測(cè)、免疫測(cè)定、耐藥性檢測(cè)等獲得應(yīng)用。

2.1 在核酸檢測(cè)中的應(yīng)用

在對(duì)臨床樣本中的DNA或RNA進(jìn)行分析之前，需要先將核酸分子從原始樣本中提取、純化。微流控芯片中最常用的核酸提純方法是磁珠法［17］。Sista等人［18］在數(shù)字微流控芯片上利用磁珠法從人全血樣本中成功提純?nèi)嘶蚪MDNA，并用于后續(xù)的聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR）。在該系統(tǒng)中，血液樣本在芯片上相繼與裂解液、DNA捕獲磁珠、清洗液、洗脫液結(jié)合。通過激活電極移動(dòng)液滴，配合位于芯片底部的磁力裝置，可實(shí)現(xiàn)不同液滴與磁珠的結(jié)合與分離，從而完成DNA提純過程。許多微流控芯片在提取核酸時(shí)，會(huì)通過加熱來加速細(xì)胞裂解［19-20］。鑒于對(duì)核酸進(jìn)行后續(xù)分析通常需要控溫裝置，這種設(shè)計(jì)在不增加設(shè)備復(fù)雜度的同時(shí)可以提高核酸提取的效率。除了磁珠法、加熱法等方法，一些微流控芯片利用介電泳效應(yīng)（dielectrophoresis trapping）［21］、等速電泳分離［22］等微流控領(lǐng)域獨(dú)有的技術(shù)來完成核酸分子的提純。此外，為了滿足第二代測(cè)序技術(shù)對(duì)于更高純度核酸樣本的需求，Choi等人［23］利用慣性聚焦技術(shù)（inertial focusing），使全血、血漿樣本中的巨細(xì)胞病毒顆粒在通過螺旋形的微流通道后與血細(xì)胞分離，降低了樣本中人類基因的比例，減少了后續(xù)測(cè)序的背景噪音。

作為一種高特異性、高靈敏度、反應(yīng)快速的核酸擴(kuò)增手段，PCR在微流控領(lǐng)域的應(yīng)用也得以充分開發(fā)。精確的溫度控制系統(tǒng)是完成PCR的基本條件?；跍乜氐膶?shí)現(xiàn)方法，可以簡(jiǎn)單地將微流控芯片上的PCR方法分為2類：靜止PCR和動(dòng)態(tài)PCR。在靜止PCR方法中，反應(yīng)液在PCR過程中位置不變，通過對(duì)固定反應(yīng)點(diǎn)的升降溫來實(shí)現(xiàn)熱循環(huán)。如Chang等人［24］利用金屬鉑作為加熱元件和感溫元件對(duì)固定的PCR反應(yīng)位點(diǎn)進(jìn)行溫控，成功在數(shù)字微流控芯片上擴(kuò)增出二型登革病毒核酸。在動(dòng)態(tài)PCR方法中，反應(yīng)液在幾個(gè)具有特定溫度的恒溫域之間受控地來回移動(dòng)，以此實(shí)現(xiàn)反應(yīng)液的熱循環(huán)。Sista等人［18］開發(fā)的用于PCR的微流控芯片具有一個(gè)60℃恒溫域和一個(gè)95℃恒溫域，反應(yīng)液在2個(gè)恒溫域之間移動(dòng)，18 min即可完成40個(gè)循環(huán)的PCR反應(yīng)。PCR與微流控技術(shù)的結(jié)合還突破了傳統(tǒng)PCR方法反應(yīng)速度的極限。對(duì)于液滴微流控來說，微小液滴具有的高表面積與體積比使得熱量傳導(dǎo)更快、更均一，可極大加速PCR反應(yīng)進(jìn)程。Wheeler等人［25］從反應(yīng)熱動(dòng)力學(xué)、DNA聚合酶等角度探索了在微流控芯片上進(jìn)行超快速PCR的極限，利用適合于進(jìn)行快速PCR的SpeedSTARTMHS DNA聚合酶或KAPA2G DNA聚合酶，并減少在變性、退火、延伸各步驟的停留時(shí)間，在3 min以內(nèi)完成了35個(gè)循環(huán)的PCR擴(kuò)增反應(yīng)。陳天藍(lán)等人［26］設(shè)計(jì)的數(shù)字微流控芯片用鉻電極作為溫控系統(tǒng)，可以使液滴超快速升降溫，在7 s之內(nèi)完成對(duì)SYBR和特異性分子信標(biāo)探針的溶解曲線分析。與傳統(tǒng)的PCR設(shè)備相比，不喪失靈敏度的前提下，在大部分微流控芯片上進(jìn)行PCR可以至少減少50%的反應(yīng)時(shí)間和70%的樣本消耗［7］。

除了與PCR技術(shù)結(jié)合，各種基于微流控芯片的等溫核酸擴(kuò)增技術(shù)也得以開發(fā)。雖然在靈敏度和特異性方面與PCR有差別，但由于等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)對(duì)溫度的精準(zhǔn)控制要求較低，開發(fā)者更容易將相應(yīng)設(shè)備小型化、便攜化。萬諒等人［27］開發(fā)的便攜式微流控設(shè)備，可在不到一個(gè)鞋盒大小的數(shù)字微流控平臺(tái)上實(shí)現(xiàn)對(duì)布魯氏菌基因的環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增（loop-mediated isothermal amplification，LAMP）及檢測(cè)。在67℃40 min的擴(kuò)增反應(yīng)之后，通過對(duì)分子信標(biāo)探針的熔解曲線分析，不到5 min即可完成對(duì)目的基因的檢測(cè)。Laili等人［28］開發(fā)的微流控核酸檢測(cè)芯片則結(jié)合了滾環(huán)擴(kuò)增技術(shù)（rolling circle replication，RCA）和微流電泳技術(shù)，在37℃60 min的RCA擴(kuò)增反應(yīng)后，可通過在微流通道中進(jìn)行電泳分離來檢測(cè)樣本中是否含有霍亂弧菌的目的基因。

鑒于微流控領(lǐng)域反應(yīng)液的微小體積，更需要高靈敏度的檢測(cè)方法來檢測(cè)樣本中的核酸分子。目前微流控芯片上開發(fā)的實(shí)時(shí)PCR方法最常用的是熒光檢測(cè)法［29］，通過SYBR等非特異性嵌入式染料或者Taqman探針、分子信標(biāo)探針等特異性熒光探針來檢測(cè)目的基因。小型發(fā)光二極管可被整合到微流控系統(tǒng)中，代替較大的汞燈、水銀燈等作為激發(fā)光源。除了實(shí)時(shí)PCR，研究者們?cè)诟鞣N微流控平臺(tái)上整合了核酸雜交技術(shù)［13］、毛細(xì)管電泳技術(shù)［30］、焦磷酸測(cè)序技術(shù)［31］、DNA光學(xué)圖譜技術(shù)［32］等核酸分析方法，作為核酸擴(kuò)增產(chǎn)物的后續(xù)檢測(cè)分析方法。

2.2 在免疫分析中的應(yīng)用

基于抗原抗體之間特異性結(jié)合的免疫分析法是臨床診斷領(lǐng)域最常用的檢測(cè)方法之一。傳統(tǒng)的免疫分析方法，如酶聯(lián)免疫吸附法（enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA），具有成本低，易操作的優(yōu)點(diǎn)，但耗時(shí)長(zhǎng)、費(fèi)人力、需要額外設(shè)備如酶標(biāo)儀等特性也阻礙了其應(yīng)用于即時(shí)檢測(cè)?；谖⒘骺仄脚_(tái)的免疫分析方法［33-34］，可以促進(jìn)抗原抗體之間的吸附，減少反應(yīng)時(shí)間，實(shí)現(xiàn)自動(dòng)控制，整合小型光學(xué)探頭使設(shè)備小型化，實(shí)現(xiàn)即時(shí)檢測(cè)的目標(biāo)。

誘餌抗原（或抗體）的包被、液相的轉(zhuǎn)移和反應(yīng)信號(hào)的捕捉是酶免分析試驗(yàn)最基本的3個(gè)方面。

誘餌抗原（或抗體）的包被對(duì)酶免試驗(yàn)的靈敏度和特異性有著極大影響。平面介質(zhì)（如PDMS、玻璃等）、磁珠和非磁性微球是微流控領(lǐng)域3類最常用的包被介質(zhì)。Kevin等人［35］將蛋白質(zhì)的包被整合到PDMS聚合過程中，由于該方法簡(jiǎn)單易行并具有較高包被效率，在PDMS微流芯片的應(yīng)用具有很大潛力。

在通道型微流控芯片中，液相轉(zhuǎn)移常通過操縱泵和閥門來完成，也可以利用離心力等方法完成。Wang等人［36］通過微型氣動(dòng)泵和微型氣動(dòng)閥，完成了在PDMS芯片上對(duì)丙肝病毒（hepatitis C virus，HCV）抗體的酶免檢測(cè)。Lai等人［37］基于微離心力開發(fā)的酶免分析芯片，可將酶免試驗(yàn)整合到一張普通光碟大小的微流設(shè)備中。在數(shù)字微流控芯片中，液相的更換通常由電極驅(qū)動(dòng)液體移動(dòng)配合著磁力裝置完成。Wheeler等人［38］設(shè)計(jì)的數(shù)字微流控芯片中，位于芯片底部的磁力裝置用于固定或移動(dòng)包被了風(fēng)疹病毒表面抗原的磁珠，驅(qū)動(dòng)電極來控制樣本、酶標(biāo)記物、顯色液等不同液滴與磁珠融合、分離，可同時(shí)完成風(fēng)疹病毒IgM和IgG的自動(dòng)化檢測(cè)。

傳統(tǒng)實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行的酶免分析方法中，通常使用酶標(biāo)儀測(cè)吸光度來確認(rèn)反應(yīng)結(jié)果。而微流控設(shè)備多數(shù)選擇用熒光信號(hào)來檢測(cè)芯片上酶免反應(yīng)的結(jié)果。相比于吸光度，熒光信號(hào)靈敏度和特異性都更高，且將現(xiàn)有的熒光標(biāo)記系統(tǒng)用于微流控芯片上可實(shí)現(xiàn)多重檢測(cè)。Tohid等人［39］設(shè)計(jì)的PDMS微流芯片可以在單一通道完成對(duì)五種抗體的多重檢測(cè)。除了光學(xué)信號(hào)，電化學(xué)信號(hào)也常應(yīng)用于微流控芯片上去檢測(cè)酶免反應(yīng)結(jié)果［40-42］，通過檢測(cè)被免疫反應(yīng)改變的電勢(shì)、電流、電壓、電容、電阻等因素，可以獲得定量結(jié)果。與光學(xué)信號(hào)相比，電化學(xué)信號(hào)不需要額外的激發(fā)光源，更容易被整合到小型化的微流控系統(tǒng)中，而且電化學(xué)信號(hào)的檢測(cè)靈敏度不受光程、液體濁度等因素的影響，用于微流控系統(tǒng)有著天然的優(yōu)勢(shì)。

2.3 在細(xì)胞分析中的應(yīng)用

開發(fā)能夠進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)、分選、分析的微流控芯片也是微流控領(lǐng)域的一大研究熱點(diǎn)。微流控技術(shù)小型化、高通量的特點(diǎn)使得其具有利用珍貴稀少的組織細(xì)胞樣本進(jìn)行高通量分析的潛力，為精準(zhǔn)醫(yī)療、個(gè)性化醫(yī)療提供支持［43］。Irena等人［44］驗(yàn)證了在數(shù)字微流控芯片上進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)、藥物細(xì)胞毒性分析實(shí)驗(yàn)的可行性。該實(shí)驗(yàn)中，普朗尼克F68作為添加劑被加入液滴中，以減少芯片表面對(duì)細(xì)胞及蛋白質(zhì)的吸附，從而降低驅(qū)動(dòng)液滴所需的電壓，以免對(duì)細(xì)胞造成傷害。Ada等人［45］研發(fā)的PDMS微流控芯片利用特殊設(shè)計(jì)的微流通道生成含單細(xì)胞的液滴，可以在2.4 cm×2.4 cm大小的芯片上實(shí)現(xiàn)對(duì)腫瘤細(xì)胞系以及原生腫瘤組織細(xì)胞的藥物篩查。

基于微流控芯片的3D細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)也是近年來微流控技術(shù)應(yīng)用于生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的一類發(fā)展方向。與傳統(tǒng)的2D細(xì)胞培養(yǎng)方法相比，3D環(huán)境下進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)能更好地模擬體內(nèi)真實(shí)的細(xì)胞生長(zhǎng)環(huán)境、反應(yīng)細(xì)胞與胞外基質(zhì)的相互作用。Yu等人［46］設(shè)計(jì)的PDMS芯片中，多個(gè)平行的細(xì)胞培養(yǎng)腔與微小通道交聯(lián)，模擬了體內(nèi)組織與毛細(xì)血管網(wǎng)之間的相互作用。Raty等人［47］的實(shí)驗(yàn)結(jié)果證明小鼠胚胎細(xì)胞在微流通道中的生長(zhǎng)速度比傳統(tǒng)平板培養(yǎng)更接近體內(nèi)真實(shí)生長(zhǎng)速率。而Yeong等人［48］將PDMS形成的特殊結(jié)構(gòu)與多孔細(xì)胞培養(yǎng)板結(jié)合，灌注水凝膠形成多個(gè)平行的3D細(xì)胞培養(yǎng)腔體，構(gòu)建了一個(gè)與傳統(tǒng)細(xì)胞分析、藥物篩選等實(shí)驗(yàn)方法完全兼容的、高通量的3D細(xì)胞培養(yǎng)微流控平臺(tái)。

除了基于細(xì)胞培養(yǎng)的微流控芯片，能代替大型流式細(xì)胞設(shè)備的微型細(xì)胞分選芯片也是一個(gè)研究焦點(diǎn)。除了通過熒光標(biāo)記、大小等因素進(jìn)行分選，微流控芯片還可以通過介電泳效應(yīng)對(duì)細(xì)胞進(jìn)行分選。在非均勻電場(chǎng)中，不同極性的細(xì)胞會(huì)朝著不同電場(chǎng)強(qiáng)度的地方遷移，利用介電泳效應(yīng)和經(jīng)特殊設(shè)計(jì)的微流通道，Takahashi等人［49］完成了高通量細(xì)胞分選。此外，慣性微流體技術(shù)也常被應(yīng)用于細(xì)胞分選。Kwon等人［50］利用螺旋形的微流通道，使得死細(xì)胞、細(xì)胞碎片等在通過微流控芯片后從細(xì)胞培養(yǎng)液中析出，可進(jìn)一步應(yīng)用于灌注式細(xì)胞培養(yǎng)。Abdulla等人［51］設(shè)計(jì)的多個(gè)微流通道級(jí)聯(lián)的微流控芯片無需對(duì)細(xì)胞進(jìn)行任何標(biāo)記就可以將循環(huán)腫瘤細(xì)胞（circulating tumor cells，CTC）從稀釋的全血樣本中分離，且分離出的CTC保持高存活率，便于進(jìn)行后續(xù)藥物篩查等試驗(yàn)。

3 展望

近年來，微流控技術(shù)在臨床診斷領(lǐng)域的應(yīng)用研究極大促進(jìn)了現(xiàn)場(chǎng)、即時(shí)檢測(cè)和精準(zhǔn)、個(gè)性化醫(yī)療的發(fā)展。盡管現(xiàn)時(shí)微流控技術(shù)的全面推廣還受限于制備過程中的復(fù)雜操作、芯片對(duì)生化成分的吸附等一系列問題，但隨著新材料、新技術(shù)、新發(fā)現(xiàn)的不斷涌出，有著來自各個(gè)學(xué)科的研究人員對(duì)微流控技術(shù)持續(xù)的研究與改善，微流控技術(shù)在臨床診斷領(lǐng)域乃至基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究領(lǐng)域的巨大潛能毋庸置疑。微流控技術(shù)的產(chǎn)業(yè)化也將推動(dòng)臨床檢測(cè)方法朝著小型化、快速化、高通量、便攜性、自動(dòng)化的方向發(fā)展，“芯片實(shí)驗(yàn)室”的廣泛應(yīng)用指日可待。