4種不同石竹屬植物的抗旱性分析

王軍娥，景維坤，王佳敏，亢秀萍

(山西農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝學(xué)院，山西 太谷 030801)

植物生長過程與外界環(huán)境密切相關(guān)，其中包括溫度、光照、水分、土壤和養(yǎng)分等。目前全球面臨著水資源嚴(yán)重缺乏的局面，我國很多地區(qū)屬于干旱或者半干旱。因此，水資源短缺的現(xiàn)狀，嚴(yán)重制約我國農(nóng)業(yè)的快速發(fā)展[1]。石竹科(Caryophyllaceae)石竹屬(DianthusL.)植物大多數(shù)為多年生草本植物，花色艷麗、花期較長且適應(yīng)性強，在園林綠化中應(yīng)用廣泛。山西省內(nèi)由于自然降雨量少，干旱環(huán)境制約石竹屬植物的觀賞價值和園林應(yīng)用效果[2-3]。目前，關(guān)于石竹屬植物的干旱脅迫研究多集中在水分脅迫對植株單個機理如形態(tài)、生理或光合特性等的影響方面[4-5]。研究表明，對任何單項指標(biāo)和機理的研究都有一定局限性，不能有效、準(zhǔn)確地評價植物抗旱性[6]。采用隸屬函數(shù)法對多個指標(biāo)進(jìn)行綜合評價，可以消除個別指標(biāo)帶來的片面性，從而提高篩選的可靠性[7]。

本試驗通過分析干旱脅迫下4種不同石竹屬植物的形態(tài)變化、生理機制和相關(guān)基因表達(dá)量的變化，探討干旱對石竹屬植物生長發(fā)育的影響，進(jìn)而篩選出抗旱能力較強的石竹材料，為石竹屬植物的抗旱種質(zhì)資源篩選以及在山西省園林綠化中的應(yīng)用提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗地概況

本試驗在山西省晉中市太谷縣山西農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝學(xué)院園藝植物遺傳育種實驗室和花卉實踐教學(xué)基地內(nèi)完成。該地區(qū)處于東經(jīng)112°28′～113°08′，北緯37°12′～37°32′，年平均氣溫5℃～10℃，年平均降雨量462.9 mm。

1.2 試驗材料

試驗材料為石竹科石竹屬的瞿麥(DianthussuperbusL.)、常夏石竹(Dianthusplumarius)、中國石竹(DianthuschinensisL.)和須苞石竹(DianthusbarbatusL.)，編號分別為D1、D2、D3和D4，由山西農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝學(xué)院花卉種質(zhì)資源創(chuàng)新團(tuán)隊收集并保存。在試驗中，均選用純度高、充實飽滿、發(fā)芽率高的種子播種，選取長至8片真葉的幼苗進(jìn)行后續(xù)干旱脅迫處理。

1.3 試驗設(shè)計

本試驗栽培基質(zhì)為(園土∶樹皮∶沙子=3∶1∶1)，其中園土為山西太谷本地土壤(褐土)。播種前每盆基質(zhì)加5 g復(fù)合肥(N∶P∶K=1∶1∶1)，盆+基質(zhì)2.2 kg，澆透底水后，盆+基質(zhì)+水為3.96 kg，每盆土壤含水量一致。待石竹幼苗長至8片真葉時，選生長健壯、長勢一致的幼苗進(jìn)行干旱脅迫處理。每種390株(每盆種10株，13盆，花盆規(guī)格為36 cm×20 cm×16 cm)，重復(fù)3次。置于溫室內(nèi)，緩好苗后進(jìn)行干旱脅迫。

每種取3盆作對照，另外10盆經(jīng)干旱脅迫處理。對照組正常澆水，干旱處理組自然干旱，直至干旱死亡。在干旱脅迫處理0、2、4、6、8、10 d和12 d分別采頂部第3～4個葉片，液氮速凍后置于-80℃超低溫冰箱保存。每個指標(biāo)重復(fù)3次，并記錄其生長狀況，具體標(biāo)準(zhǔn)見表1。

表1 石竹屬植物生長狀況分級標(biāo)準(zhǔn)

1.4 測定項目及方法

1.4.1 生理指標(biāo) 葉片相對含水量的測定采用烘干稱重法[8]。葉綠素含量測定采用丙酮浸提法[10]。可溶性蛋白含量測定采用考馬斯亮藍(lán)G-250比色法[9]。丙二醛含量測定采用硫代巴比妥酸比色法[10]。超氧化物酶歧化酶活性測定采用氮藍(lán)四唑光還原法[10]。脯氨酸含量測定采用茚三酮顯色法[10]。

1.4.2 實時熒光定量PCR 本試驗使用RNAprep Pure Plant Kit(DP441，TIANGEN)試劑盒提取石竹葉片RNA，用PrimeScriptTMRT reagent Kit(Takara)將提取的RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA。以18srRNA為內(nèi)參基因，SYBR?Premix Ex TaqTM II(Takara)實時定量試劑盒，比較抗逆性相關(guān)基因DtPOD和DtSOD在4種不同石竹屬植物中的表達(dá)情況。

1.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析

采用隸屬函數(shù)法[11]對不同石竹品種的抗旱能力進(jìn)行綜合評價。隸屬函數(shù)值的計算公式如下：

U(Xi)=(Xi-Xmin)/(Xmax-Xmin)

(1)

或

U(Xi)=1-(Xi-Xmin)/(Xmax-Xmin)
i= 1，2，3，…

(2)

式中，Xi為某一指標(biāo)的測定值/對照值，Xmin為所有供試材料該指標(biāo)測定值/對照值中的最小值，Xmax為所有供試材料該指標(biāo)測定值/對照值中的最大值。若所用指標(biāo)與抗旱性呈正相關(guān)，用式(1)，反之用式(2)。計算出不同石竹品種的抗旱隸屬值平均值，平均值越大，抗旱性越強。

2 結(jié)果與分析

2.1 干旱脅迫下4種不同石竹屬植物的形態(tài)變化

由表2可知，在干旱脅迫前期，4種植物的生長變化不明顯；當(dāng)干旱脅迫處理4～8 d時，中國石竹(D3)和須苞石竹(D4)率先開始萎蔫，而常夏石竹(D2)和瞿麥(D1)仍保持正常生長；當(dāng)干旱脅迫處理8～12 d，隨著干旱脅迫程度加重，常夏石竹(D2)和瞿麥(D1)開始出現(xiàn)萎蔫，而中國石竹(D3)和須苞石竹(D4)則受傷程度加重，停止生長甚至達(dá)到半致死程度。從外部形態(tài)變化可知4種石竹屬植物的抗旱性大小為：常夏石竹(D2)>瞿麥(D1)>須苞石竹(D4)>中國石竹(D3)。

2.2 干旱脅迫下4種不同石竹屬植物相關(guān)生理特性分析

2.2.1 干旱脅迫下石竹屬4種植物土壤含水量變化 由圖1可知，在整個干旱脅迫期間土壤含水量呈明顯下降趨勢，4種石竹屬植物的土壤含水量下降趨勢基本保持一致；4種植物土壤含水量在同一時期差異較小，但常夏石竹(D2)的土壤含水量在整個干旱脅迫過程中的整體水平較其它材料高。

表2 干旱脅迫下4種不同石竹屬植物的生長狀況

圖1 干旱脅迫下土壤含水量變化Fig.1 The variation of soil moisture content under drought stress

2.2.2 干旱脅迫對石竹屬4種植物葉片相對含水量的影響 由圖2(A)可知，隨著干旱脅迫天數(shù)的增加，4種石竹屬植物葉片相對含水量整體呈下降趨勢。干旱脅迫處理0～4 d時，各材料葉片相對含水量下降趨勢基本一致。在干旱脅迫4 d時，瞿麥(D1)、常夏石竹(D2)、中國石竹(D3)和須苞石竹(D4)的葉片相對含水量分別比對照組下降了17.94%、16.66%、22.88%和22.09%；在干旱脅迫10 d時，常夏石竹(D2)的葉片相對含水量最高，為43.63%，中國石竹(D3)最低，為22.72%。

2.2.3 干旱脅迫對石竹屬4種植物葉片葉綠素含量的影響 由圖2(B)可以看出，4種石竹屬植物在干旱脅迫過程中，葉片葉綠素含量整體上呈先升后降的趨勢。在干旱脅迫第4 d時，4種植物Chl含量均達(dá)到最高，隨后呈下降趨勢。在干旱脅迫第12 d時，4種石竹屬材料葉片中的Chl含量從高到低依次為：常夏石竹(D2)>瞿麥(D1)>須苞石竹(D4)>中國石竹(D3)。

2.2.4 干旱脅迫對石竹屬4種植物葉片丙二醛含量的影響 干旱脅迫下，丙二醛含量越多，則表明植物組織對逆境的防御能力越弱。由圖2(C)可知，在干旱脅迫下，4種植物的丙二醛含量變化呈持續(xù)上升趨勢。在干旱脅迫第10 d，4種不同材料丙二醛含量分別比對照組增加了451.61%、353.45%、724.32%、647.95%；在干旱脅迫12 d時，4種不同石竹屬植物的丙二醛含量由大到小為：中國石竹(D3)>須苞石竹(D4)>瞿麥(D1)>常夏石竹(D2)。

2.2.5 干旱脅迫對石竹屬4種植物葉片可溶性蛋白含量的影響 由圖2(D)可知，在干旱脅迫第4 d時，中國石竹(D3)和須苞石竹(D4)的可溶性蛋白含量分別增加31.23%和29.92%。在干旱脅迫第12 d，瞿麥(D1)和常夏石竹(D2)的可溶性蛋白含量呈上升趨勢，分別為對照的53.97%和63.12%，中國石竹(D3)和須苞石竹(D4)可溶性蛋白含量則急劇下降，僅為對照的7.11%和8.88%。

2.2.6 干旱脅迫對石竹屬4種植物葉片SOD活性的影響 由圖2(E)可知，4種石竹屬植物葉片SOD活性在干旱脅迫前期均呈現(xiàn)升高趨勢。在干旱脅迫4～8 d期間，瞿麥(D1)和常夏石竹(D2)SOD活性緩慢上升，而中國石竹(D3)和須苞石竹(D4)SOD活性上升幅度較大；在干旱脅迫8～12 d，瞿麥(D1)和常夏石竹(D2)SOD活性繼續(xù)保持緩慢上升，而中國石竹(D3)和須苞石竹(D4)SOD活性則大幅度下降。在干旱脅迫后期，4種石竹屬植物仍保持較高的SOD酶活性，均高于初始水平，表明SOD酶活性與植物的抗旱性密切相關(guān)。

2.2.7 干旱脅迫對石竹屬4種植物葉片脯氨酸含量的影響 由圖2(F)可知，在干旱脅迫期間，4種石竹屬植物葉片脯氨酸含量呈上升趨勢。在干旱脅迫0～10 d，與對照組相比，4種石竹屬植物葉片的脯氨酸含量均呈持續(xù)上升趨勢，但是增加幅度不同。在干旱脅迫10 d時，須苞石竹(D4)脯氨酸含量增加最多，為對照組的12.73倍，其次是中國石竹(D3)，為11.21倍，瞿麥(D1)為8.02倍，常夏石竹(D2)增加最少，僅為4.75倍；干旱脅迫10～12 d，常夏石竹(D2)和瞿麥(D1)的脯氨酸含量繼續(xù)增加而中國石竹(D3)和須苞石竹(D4)則開始下降。

2.3 4種不同石竹屬植物的抗旱性綜合分析

本試驗以石竹屬4種不同植物的葉片相對含水量、SOD活性、Chl含量、MDA含量、脯氨酸含量和可溶性蛋白含量6個生理指標(biāo)，并結(jié)合隸屬函數(shù)法進(jìn)行耐旱性綜合評價。從表3可知，4種植物的抗旱性從強到弱依次為：常夏石竹(D2)>瞿麥(D1)>須苞石竹(D4)>中國石竹(D3)。

圖2 干旱脅迫對葉片生理指標(biāo)的影響Fig.2 The effect of drought stress on the physiological indexes

材料編號Materialnumber葉片相對含水量Leaf relativewater contentChl.含量Chl. contentMDA含量MDA content可溶性蛋白含量Soluble proteincontentSOD活性SOD activityPro含量Proteincontent隸屬函數(shù)總值 Total subordinatefunction隸屬函數(shù)均值Mean subordinatefunction排名RankD10.74440.76670.78810.7590.7220.61154.39170.62742D20.93140.8810.90120.95270.83460.70735.20820.7441D30.04510.15240.13330.07880.24230.12780.77970.11144D40.14140.35720.23530.25450.12410.40361.51610.21663

2.4 4種不同石竹屬植物的抗氧化酶基因表達(dá)分析

2.4.1DtPOD基因在4種不同石竹屬植物中的表達(dá)分析 在干旱脅迫2、4、6、8、10 d，分別采集4種不同石竹屬植物葉片提取RNA，檢測DtPOD基因的表達(dá)情況。從圖3(A)可知：在整個干旱脅迫期間，DtPOD基因在4種不同石竹屬植物葉片中的表達(dá)水平呈先升后降的趨勢；干旱脅迫第6 d時，常夏石竹(D2)和瞿麥(D1)的DtPOD基因表達(dá)量達(dá)到了最大值，常夏石竹(D2)的變化倍數(shù)為對照組的24.18倍，瞿麥(D1)為對照組的15.01倍；干旱脅迫10 d時，與對照組相比，常夏石竹(D2)DtPOD基因相對表達(dá)量仍高達(dá)12.82倍，其次是瞿麥(D1)為3.75倍，須苞石竹(D4)為0.34倍，中國石竹(D3)最低，僅為初始表達(dá)量的0.15倍。

2.4.2DtSOD基因在石竹屬4種植物中的表達(dá)分析 干旱脅迫下，DtSOD基因在4種不同石竹屬植物中的表達(dá)情況如圖3(B)所示。從圖中可知，在干旱脅迫前期(0～4 d)，DtSOD基因在瞿麥(D1)和常夏石竹(D2)的表達(dá)量呈略微下降趨勢，而須苞石竹(D4)和中國石竹(D3)的表達(dá)量顯著增加且在處理4 d時表達(dá)量達(dá)到最高值；干旱脅迫第10 d時，與對照相比，DtSOD基因在4種不同石竹屬植物的表達(dá)量差異較大，從高到低依次為：常夏石竹(2.46倍)>瞿麥(2.17倍)>須苞石竹(0.40倍)>中國石竹(0.23倍)。

圖3 干旱脅迫下4種不同石竹屬植物的基因表達(dá)分析Fig.3 Analysis of gene expression in four Dianthusplants under drought stress

3 討 論

3.1 抗旱性生理指標(biāo)分析

植物的光合速率大小與植物體內(nèi)的水分狀況直接相關(guān)，而植物體內(nèi)的水分大部分是由根系從土壤中獲取，光合速率大小間接地與土壤水分狀況密切相關(guān)[12]。在土壤缺水的情況下，植物光合速率受到抑制[5]。在相同的干旱脅迫條件下，抗旱性強的植物葉片含水量下降慢且降幅小，能保持較好的水分平衡；反之，相對含水量下降的快且幅度大，水分平衡能力差，植物的抗旱能力弱[13]。本試驗中瞿麥(D1)和常夏石竹(D2)的葉片相對含水量下降幅度較須苞石竹(D4)和中國石竹(D3)小，說明瞿麥(D1)和常夏石竹(D2)的抗旱性相對較強。

葉綠素是參與植物光合作用的重要物質(zhì)，葉綠素含量變化可以反映植物受干旱脅迫的程度[11]。本試驗干旱脅迫前期，4個供試材料Chl含量均呈上升趨勢。干旱脅迫下，Chl含量變化的這種差異可能與植物自身的生物學(xué)特性和干旱脅迫發(fā)生的強度、時期或持續(xù)時間有關(guān)[14]。

干旱脅迫對植物的傷害首先表現(xiàn)為膜脂過氧化[15]，MDA含量的高低反映了膜脂過氧化以及膜結(jié)構(gòu)受傷害的程度[16]。本試驗中，隨干旱脅迫時間的延長，MDA含量增加。在干旱脅迫的前6 d，MDA含量上升相對緩慢，但在干旱脅迫10 d后，發(fā)現(xiàn)中國石竹(D3)和須苞石竹(D4)MDA含量降低，可能是由于干旱脅迫程度嚴(yán)重，植物產(chǎn)生的活性氧含量降低，導(dǎo)致MDA含量降低，說明中國石竹(D3)和須苞石竹(D4)的抗旱性弱于瞿麥(D1)和常夏石竹(D2)。植物在抵御不良環(huán)境時，其自身會形成一些防御機制，如啟動抗氧化系統(tǒng)、進(jìn)行滲透調(diào)節(jié)等[17]。超氧化物歧化酶(SOD)、過氧化物酶(POD)等抗氧化酶是植物活性氧清除系統(tǒng)中重要的酶，在一定脅迫范圍內(nèi)可以維持活性，在干旱脅迫2 d后其活性大幅度提高，6 d后開始下降；而Pro含量在干旱前期增加緩慢，4 d后開始迅速積累，表明在干旱前期，抵御干旱的滲透性物質(zhì)主要為可溶性蛋白質(zhì)，而在干旱后期，即干旱脅迫程度較大時，主要發(fā)揮作用的滲透性物質(zhì)是脯氨酸[18-21]。干旱脅迫使SOD活性升高，但每個材料SOD活性增加趨勢有差異。根據(jù)馬宗仁等[22]的時間差理論，植物存在一個耐受脅迫的極限。中國石竹(D3)和須苞石竹(D4)在干旱脅迫8d后，SOD活性達(dá)到了耐旱脅迫，隨后SOD活性開始急劇下降；瞿麥(D1)和常夏石竹(D2)則在干旱脅迫前期SOD活性下降，隨后SOD活性平穩(wěn)上升，表現(xiàn)出對干旱脅迫有較強的適應(yīng)性。

3.2 抗氧化酶基因表達(dá)量分析

本試驗中，兩個基因在4種石竹屬植物不同干旱脅迫時期的相對表達(dá)量變化趨勢不一致。在干旱脅迫前期，DtPOD基因的表達(dá)量在瞿麥(D1)和常夏石竹(D2)較中國石竹(D3)和須苞石竹(D4)增幅大，其抗旱性強弱與表達(dá)量呈正相關(guān)，表達(dá)量越高，其抗旱性越強。對于DtSOD基因，干旱脅迫前期，抗旱性強的植物SOD酶活較低；在干旱脅迫中后期，酶活性逐漸升高，抗旱性越強，該基因表達(dá)量越高，可能是由于基因調(diào)控表達(dá)在時間和空間上的差異導(dǎo)致，因此需要深入探究。

綜上所述，在不同的干旱脅迫處理下，4個不同石竹屬植物在形態(tài)、生理以及抗氧化酶基因表達(dá)方面表現(xiàn)出不同的反應(yīng)。結(jié)合隸屬函數(shù)法對干旱脅迫下的不同指標(biāo)進(jìn)行綜合評價，得出4個不同石竹屬植物的耐旱性由強到弱依次為：常夏石竹(D2)>瞿麥(D1)>須苞石竹(D4)>中國石竹(D3)。