黏膜相關恒定T細胞在感染性疾病中的研究進展

毛玉林(綜述) 黃俊峰 諸杜明(審校)

(復旦大學附屬中山醫(yī)院重癥醫(yī)學科 上海 200032)

黏膜相關恒定T細胞(mucosal-associated invariant T cells,MAIT細胞)是Porcelli等[1]在1993年研究DN(CD4-CD8-)T細胞時發(fā)現(xiàn)的一群進化保守的T淋巴細胞,此類細胞選擇性分布在腸道黏膜固有層[2]。2012年Kjer-Nielsen等[3]首次報道了MAIT細胞的活化配體,極大地推動了MAIT細胞在感染性疾病中的研究。與傳統(tǒng)淋巴細胞識別肽類抗原不同,MAIT細胞識別的抗原來源于微生物所特有的核黃素合成通路的代謝產(chǎn)物。在感染過程中,抗原提呈細胞(antigen presenting cell,APC)吞噬并處理病原菌,抗原與主要組織相容性復合物相關蛋白1 (major histocompatibility complex class I-like molecule,MR1)結合,呈遞給MAIT細胞,MAIT細胞迅速釋放干擾素γ(interferon γ,IFN-γ)、腫瘤壞死因子α(tumor necrosis factor α,TNF-α)和細胞毒性分子,發(fā)揮抗感染的生物學效應[4]。本文就MAIT細胞在感染性疾病中的作用及其機制進行綜述。

MAIT細胞的性質及特點MAIT細胞表型為TCRVɑ7.2+CD3+CD4-CD161++,其主要起源于一群Th17型、具有組織傾向性的CD161++CD8+T細胞,而且大部分MAIT細胞都是CD8ɑɑ細胞[5]。MAIT細胞作為一類固有樣淋巴細胞,具有固有免疫和適應性免疫的雙重特征,當微生物入侵機體時,它可以迅速釋放炎癥介質,在固有免疫和適應性免疫之間架起一座橋梁[6],而研究MAIT細胞在感染中的作用及其機制,對于理解機體與微生物之間的關系大有裨益。

MAIT細胞具有2個進化保守的特征:有一條相對固定的T細胞受體(T cell antigen receptor,TCR)ɑ鏈和被MR1所限制[7]。其產(chǎn)生于胸腺,并在胸腺重排其相對固定的TCR ɑ鏈序列,MAIT細胞可以被CD4+CD8+胸腺細胞陽性選擇,但是這種選擇需要胸腺細胞表達MR1。在人類胎兒期胸腺MAIT細胞未成熟且稀少,成熟發(fā)生在其離開胸腺、暴露于黏膜層細菌的情況下,與B細胞和共生菌發(fā)生相互作用,擴增并且轉變?yōu)橛洃浶蚆AIT細胞[6]。MAIT細胞擴增依賴于細菌和B細胞,無菌小鼠檢測不到MAIT細胞。所以,MAIT細胞在黏膜層中聚集較多,尤其是腸道黏膜固有層,可占到腸道黏膜組織T細胞的4%～10%。人類外周血和肝臟組織中的MAIT細胞含量也特別豐富,可占血液中所有T細胞的1%～10%,可占肝臟中所有T細胞的20%～50%[8-9]。

動物實驗表明[7],缺乏MR1小鼠的T細胞亞群是缺乏MAIT細胞的。MR1是一種在哺乳動物之間進化保守、單一形態(tài)的類MHCⅠ分子,其配體結合域在人和小鼠之間有90%的同源序列,并且在功能上有高度的交叉反應,人和小鼠的MAIT細胞可以被來自其他種系的MR1激活。表達于抗原提呈細胞的MR1主要功能是提呈抗原給MAIT細胞,進而激活MAIT細胞?？梢哉f,MR1是MAIT細胞發(fā)揮正常功能所需的最重要的提呈分子。MR1也是高度依賴與配體的結合才能表達在細胞膜上。正常情況下,細胞表面僅表達少量MR1,與配體共培養(yǎng)可以穩(wěn)定增加MR1的表面表達[3],而清除配體可以減少MR1表達。McWilliam等[10]認為,不同解剖部位的細胞表達MR1的水平直接與局部的抗原水平呈正比。

激活MAIT細胞的配體研究發(fā)現(xiàn)的第1個MR1配體是6-甲酰蝶呤(6-formyl pterin,6-FP)[3],6-FP是葉酸(維生素B9)的天然光降解產(chǎn)物,普遍存在于細胞培養(yǎng)基等一系列物質中;接著發(fā)現(xiàn)另一種6-FP相關的復合物:2-乙?；?6-甲酰基蝶呤(acetyl-6-formylpterin,Ac-6-FP)。當兩者結合MR1時,可以增加MR1的穩(wěn)定性并促進MR1在細胞表面表達。但是,這些復合物不激活MAIT細胞,卻可以與活化性配體競爭性結合MR1。所以,葉酸衍生物可以作為MAIT細胞的抑制劑。而來源于核黃素(維生素B2)合成通路的衍生物卻可以特異性地有效激活MAIT細胞。首先發(fā)現(xiàn)的一類核黃素家族配體是核糖胞嘧啶(ribityllumazines),它們與甲酰蝶呤一樣,有1個相似的二環(huán)結構;但是,它們有1個可以和MAIT細胞TCR發(fā)生相互作用的核糖醇基尾端結構,所以被MR1呈遞后可以激活MAIT細胞。新近補充的核黃素家族的MR1配體是2種尿嘧啶,它們是已知的最有效的MAIT細胞激活劑。激活MAIT細胞的核黃素合成途徑中間物是細菌和真菌所特有的一種物質,因此其可作為微生物感染的分子標記物[11]。這些以維生素為基礎的代謝物是可分泌和可擴散的,表明MAIT細胞可能感知跨黏膜微生物的活動,從而調節(jié)局部免疫和黏膜屏障功能。

除了TCR-MR1-核黃素代謝物這條經(jīng)典激活途徑,MAIT細胞還可以在不觸發(fā)TCR的情況下,與IL-12和IL-18共培養(yǎng)產(chǎn)生IFN-γ[12]。所以,在創(chuàng)傷、病毒感染或其他不產(chǎn)生MR1配體的微生物感染的情況下,MAIT細胞可能會發(fā)生旁路激活。Wilgenburg等[13]證實了登革熱病毒、丙肝病毒、流感病毒均可以通過IL-18/IL-12途徑激活MAIT細胞。

MAIT細胞在感染中的作用MAIT細胞在感染性疾病中的研究,主要集中在細菌或病毒感染引起的結核病、肺炎、AIDS、肝炎等疾病,但人體中MAIT細胞在寄生蟲感染中的作用尚無報道[14]。

MAIT細胞在細菌感染中的作用 目前在人類疾病的研究中,關于MAIT細胞抗菌作用的研究主要集中于結核菌感染所導致的的肺結核。Le Bourhis等[15]發(fā)現(xiàn),包括肺結核在內(nèi)的肺部細菌感染性疾病患者血液中的MAIT細胞比例和絕對數(shù)量明顯少于健康志愿者和癌癥患者,MAIT細胞頻數(shù)是真實的數(shù)量減少,而不是被細菌反應性的主流T細胞所稀釋。作者給出的解釋是,感染之后MAIT細胞浸潤到受感染的組織,導致其在血液中的數(shù)量減少;而研究者驗證此假設的實驗僅僅是在結核分支桿菌感染的肺組織中發(fā)現(xiàn)了MAIT細胞。MAIT細胞水平與結核病的進展相關[16]?；顒有越Y核病(tuberculosis,TB)組患者外周血MAIT細胞頻數(shù)較健康對照組明顯降低。亞組分析發(fā)現(xiàn),結核性胸腔積液患者胸水中MAIT細胞頻數(shù)明顯減少,但結核性腹膜炎患者腹水中MAIT細胞卻沒有明顯下降。用豆蔻酰佛波醇乙酯(phorbolmyristate acetate,PMA)/離子霉素(ionomycin)刺激TB組和健康對照組MAIT細胞,兩組患者MAIT細胞的IFN-γ和TNF-α表達量相似;但用1%多聚甲醛固定的大腸埃希菌做刺激物,TB組MAIT細胞的表達量明顯低于對照組,表明來源于TB組患者的MAIT細胞可能具有針對結核桿菌的特異性表型,所以才會對其他細菌抗原的反應性下降。另外,活動性TB組MAIT細胞程序性死亡受體1(programmed death 1,PD1)表達升高,阻斷PD1通路可以明顯增強IFN-γ的表達,這些現(xiàn)象說明隨著細胞活性的增高,MAIT細胞也更易于發(fā)生凋亡。在無抗原刺激的情況下,TB組和健康對照組患者表達活化分子CD69差異不明顯;用結核菌裂解產(chǎn)物和IL-15刺激兩組MAIT細胞,發(fā)現(xiàn)TB患者CD69、顆粒酶B(granzyme B,GrB)、IL-17F和IFN-γ表達量較對照組明顯降低[17]。

Grimaldi等[18]通過分析重癥感染(包括嚴重膿毒癥和感染性休克)患者入住ICU第1、4、7天的外周血固有樣淋巴細胞,發(fā)現(xiàn)患者外周血MAIT細胞計數(shù)在感染早期就出現(xiàn)明顯降低。多變量分析表明,細菌感染是患者第1天MAIT細胞比例(MAIT細胞數(shù)占CD3+TCRγδ-細胞數(shù)百分比)下降的獨立決定因素;但是,在嚴重膿毒癥和感染性休克患者中,MAIT細胞比例并沒有隨著感染的嚴重程度變化而出現(xiàn)差異。與嚴重非感染性疾病組患者(大部分為心源性休克和失血性休克患者)第1天MAIT細胞比例相比,非鏈球菌感染組的數(shù)值下降有統(tǒng)計學意義,而鏈球菌感染組的下降卻不明顯。另外,在入住ICU第4天MAIT細胞計數(shù)沒有增加(持續(xù)低水平或者降低)的患者中,獲得性感染的累積發(fā)生率增高;而沒有發(fā)生ICU獲得性感染的患者前7天的MAIT細胞數(shù)是逐漸增加的。作者推斷,持續(xù)MAIT細胞消耗與ICU獲得性感染的進展相關。MAIT細胞計數(shù)并不與總淋巴細胞數(shù)相關,暗示其在嚴重感染中獨立于主流淋巴細胞的作用。

MAIT細胞可以對多種細菌發(fā)生反應,參與機體的抗菌防御[15]。革蘭陰性的銅綠假單胞菌、肺炎克雷伯氏菌,革蘭陽性的嗜酸乳桿菌、金黃色葡萄球菌、表皮葡萄球菌都可以刺激MAIT細胞產(chǎn)生強烈的反應。然而,與葡萄球菌屬相近的腸球菌和A組鏈球菌卻不能激活MAIT細胞,這與Grimaldi等[18]的研究結果相似。因為鏈球菌屬和葡萄球菌屬細菌共享許多細菌相關分子模式,有些細菌可以提供激活MAIT細胞的配體,而有些卻不能,如腸球菌就缺乏MR1依賴性的MAIT細胞活化所必備的復合物。還有研究證明,MAIT細胞可以MR1依賴的方式殺傷志賀痢疾桿菌感染的上皮細胞,而對沙門氏菌卻不能發(fā)生作用[19]。除了細菌,酵母菌、光滑念珠菌、白色念珠菌等真菌也可以MR1依賴的方式誘導MAIT細胞發(fā)生強烈的反應。但是,腦心肌炎病毒、仙臺病毒、新城病毒、單純皰疹病毒、3型副流感病毒卻不能激活MAIT細胞。因此,作者認為MAIT細胞選擇性對細菌和真菌發(fā)生反應,對病毒不發(fā)生反應[15]。

MAIT細胞在病毒感染中的作用 研究證明,常見的登革熱病毒、丙肝病毒、流感病毒都可以激活MAIT細胞[13]。未經(jīng)治療的HIV感染患者無論在疾病早期還是晚期,外周血MAIT細胞數(shù)量均明顯減少[20];即使在2年的抗逆轉錄病毒治療期間,MAIT細胞數(shù)量也并未恢復?？乖せ顚е碌募毎劳隹赡苁荕AIT細胞缺乏的原因。在未治療的慢性HIV感染患者中,MAIT細胞不僅數(shù)量嚴重減少,而且其減少與疾病確診時間和MAIT細胞活化水平相關。用大腸埃希菌刺激血液中殘存的MAIT細胞,發(fā)現(xiàn)MAIT細胞表達IFN-γ和TNF的水平明顯降低,幾乎不產(chǎn)生IL-17;在有效的抗逆轉錄治療之后,其產(chǎn)生細胞因子的能力部分恢復,但外周血中MAIT細胞數(shù)量卻沒有恢復。HIV感染患者外周血中殘存的MAIT細胞在遭遇細菌抗原時,GrB表達受損,不能產(chǎn)生有效的溶細胞能力。除此之外,AIDS患者血液中IL-17含量和MAIT細胞數(shù)量正相關,且IL-17可以增強MAIT細胞對低劑量細菌抗原的敏感性和殺細胞能力。外周血MAIT細胞數(shù)量和功能障礙不僅會影響?zhàn)つっ庖?也會使HIV患者獲得機會感染的風險增加。但也有報道稱[21],雖然HIV感染患者的MAIT細胞數(shù)量減少,但直接使用核黃素代謝物或PMA/ionomycin刺激MAIT細胞,其分泌細胞因子的能力基本正常,說明MAIT細胞功能異?？赡苁怯捎谄溆|發(fā)信號或信號傳導通路出現(xiàn)缺陷。在AIDS患者中MAIT細胞數(shù)量及功能發(fā)生變化,究竟是HIV的直接作用,還是HIV導致的腸道黏膜破壞、細菌移位而產(chǎn)生的間接影響,目前尚不明確[22]。

除了HIV病毒,MAIT細胞在病毒性肝炎中也呈現(xiàn)出一些獨特的性質。在慢性丙肝患者中,血液中MAIT細胞數(shù)量明顯減少,而且是外周血中受影響最嚴重的免疫細胞[23];應用核苷酸聚合酶抑制劑索非布韋(sofosbuvir)和利巴韋林(ribavirin)等非干擾素療法清除丙肝病毒后,盡管在治療的8周內(nèi)HCV就已經(jīng)被迅速清除,但是在整個72周的治療周期內(nèi),MAIT細胞數(shù)量都未達到健康對照組的水平。殘余MAIT細胞高表達GrB、HLA-DR、PD-1和CD69,但對依賴MR1的抗原刺激的反應性降低。Spaan等[24]用干擾素α為基礎的療法成功治療慢性丙肝后,外周血MAIT細胞數(shù)量并未恢復。

MAIT細胞抗感染的主要作用機制

分泌促炎因子 在感染因素刺激下,MAIT細胞可以迅速產(chǎn)生大量的促炎性細胞因子,調節(jié)固有免疫細胞和適應性免疫細胞的效應功能[6]。MAIT細胞被感染大腸埃希菌的單核細胞激活后,可以分泌IFN-γ,細菌感染復數(shù)(multiplicity of infection,MOI)越大,分泌IFN-γ的量越大;但是MAIT細胞激活后,沒有分泌大量的IL-2、IL-4、IL-5、IL-13、IL-17。Le Bourhis等[15]將MAIT細胞抗菌的功能歸因于其所產(chǎn)生的IFN-γ,推測MAIT細胞具有抗菌功能的原因可能是其可以在感染部位立即發(fā)生反應。MAIT細胞的系統(tǒng)發(fā)生學及其對多種細菌(包括腸道共生菌)的反應,提示其具有雙重作用:抗感染和黏膜穩(wěn)態(tài)機制。

MAIT細胞是一群分泌IL-17、表達高水平的多種藥物轉運蛋白受體ATP結合盒B亞家族成員1轉運蛋白(ATP-binding cassette subfamily B member 1,ABCB1)的非循環(huán)性、組織定向性細胞,大部分MAIT細胞都是分泌IL-17且高表達CD161的CD8+T細胞[8]。MAIT細胞高表達與遷移到外周組織(尤其是腸道和肝臟)有關的趨化因子受體CCR6、CXCR6、CCR9,但不表達CCR7(一種與遷移到淋巴結有關的趨化因子受體)。這些結果表明,與其他常規(guī)T細胞不同,MAIT細胞是一群具有組織傾向性的循環(huán)淋巴細胞。在生理條件下,MAIT細胞存在于腸道,但更多的MAIT細胞聚集在肝臟。研究者從外周血中提純MAIT細胞,發(fā)現(xiàn)缺乏刺激的MAIT細胞不產(chǎn)生細胞因子。而經(jīng)過PMA和抗CD3、抗CD28抗體刺激之后,MAIT細胞不產(chǎn)生Th2(IL-4、5、13)或Ⅰ型調節(jié)性T細胞(type 1 regulatory T cell,Tr1)相關的細胞因子,不產(chǎn)生IL-10,也不產(chǎn)生轉化生長因子β,但分泌高水平的GrB和TNF-α,數(shù)量與記憶型CD8+T細胞相當。血液MAIT細胞在體外刺激之后,進入混合分泌Th1/Th17細胞因子的模式。本質上,分泌IFN-γ和IL-17是相互矛盾的;但小部分的MAIT細胞卻可以同時分泌這兩種細胞因子,暗示MAIT細胞存在功能不同的亞型。MAIT細胞分泌IL-17的特性與其抗菌活動相符;而MAIT細胞表面高表達的CD161不能調節(jié)自身的溶細胞特性,卻可以調節(jié)MAIT細胞細胞因子的表達[19];表達高水平的ABCB1使得MAIT細胞能抵抗來源于腸道固有層或肝臟的侵襲性細菌所分泌的外源性異物。

在感染早期,MAIT細胞產(chǎn)生促炎因子,并及時招募分泌IFN-γ的活化CD4+和CD8+T細胞到肺組織。MAIT細胞不僅在早期啟動免疫反應,其積極作用可以一直持續(xù)到感染后期。在感染后期,MAIT細胞繼續(xù)集聚于肺組織,產(chǎn)生IFN-γ等重要的細胞因子,在適應性免疫中持續(xù)地發(fā)揮作用。但是,MAIT細胞的組織傾向性可能會限制其在全身感染中的能力[25]。

溶細胞作用 顆粒酶是研究人員在探索細胞毒性淋巴細胞功能時發(fā)現(xiàn)的一組絲氨酸蛋白酶,具有誘導細胞凋亡的功能[26]。在顆粒酶家族中,GrB促進細胞凋亡的作用最強,GrB在穿孔素存在的情況下,可以有效地定位并集聚在細胞核內(nèi),破壞DNA的基質,誘導DNA裂解。極低濃度GrB就可以殺傷細胞;其他顆粒酶包括GrA和GrK,在生理情況下不具有誘導細胞凋亡的作用,但有促進炎癥反應的作用[27-28]。

MAIT細胞可以識別受感染的APC,并對其進行殺傷。Kurioka等[29]首次研究了MAIT細胞的細胞毒作用和殺傷APC的能力,發(fā)現(xiàn)了人靜息血源性MAIT細胞有獨特的溶細胞性質。人類外周血MAIT細胞高表達GrA和GrK,但幾乎都不表達GrB;臍帶血MAIT細胞也高表達GrA和GrK,表明分泌GrA和GrK是MAIT細胞的固有特征。與抗原相互作用之后,MAIT細胞可以立即分泌GrA、GrK和穿孔素。用大腸埃希菌感染的APCs刺激MAIT細胞,可以導致MAIT細胞廣泛脫顆粒,表達GrA和GrK的MAIT細胞數(shù)量明顯減少,而表達GrB的MAIT細胞比例明顯增加;隨著大腸埃希菌濃度的增加,MAIT細胞的GrB表達量也逐漸上升。加入抗MR1抗體或抗IL-12抗體可以明顯減少GrB的表達;加入抗MR1、抗IL-12、抗IL-18抗體可以完全抑制GrB上調。受大腸埃希菌刺激的MAIT細胞中穿孔素的表達也明顯增加,但加入MR1阻斷抗體并不能抑制穿孔素的上調。作者推斷,MAIT細胞的GrB表達受到更加嚴格的調控。靜息MAIT細胞最多可以殺死30%的APCs,而活化的MAIT細胞則可以殺滅70%的APCs;研究者通過新的以流式細胞術為基礎的殺傷實驗證明,活化的MAIT細胞是以MR1依賴的脫顆粒方式,有效殺滅被大腸埃希菌感染的B細胞系。在靜息狀態(tài)下,MAIT細胞的細胞毒作用是受抑制的,受到抗原有效刺激之后,MAIT細胞快速獲取細胞毒能力來殺滅靶細胞。MAIT細胞的殺細胞能力受到嚴格調控,這在機體控制細胞內(nèi)感染與內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)方面發(fā)揮重要作用。

結語MAIT細胞可以與機體普遍存在的MR1分子發(fā)生相互作用,使得MAIT細胞作為免疫治療或疫苗的靶標[14];Keller等[30]發(fā)現(xiàn)MR1可以結合不同類型的有機物(如雙氯芬酸代謝物),呈遞給MAIT細胞,調節(jié)MAIT細胞的功能。MAIT細胞在人類外周血、黏膜組織、肝臟中的含量豐富,高表達ABCB1并能分泌IL-17,這些特征使得MAIT細胞成為機體抵御嚴酷的腸道環(huán)境、與病原菌斗爭的理想哨兵[8]。消化道含有大量的人體共生菌,除了黏膜上皮屏障之外,還有大量的MAIT細胞等固有免疫細胞在此處進行監(jiān)視和防御;而MAIT作為一類與細菌相伴相生的固有樣淋巴細胞,在消化系統(tǒng)的感染、免疫調節(jié)等方面具有廣泛的研究前景。

大量研究證明,MAIT細胞可在感染過程中發(fā)揮重要的保護作用。MAIT細胞在病原菌入侵、清除等過程中的具體作用尚不清楚。作為MAIT細胞的配體,微生物來源的維生素B2代謝物的發(fā)現(xiàn)為推動MAIT細胞的機制研究帶來了曙光。MAIT細胞作為固有樣免疫細胞,可以在機體固有免疫和適應性免疫中發(fā)揮重要作用,但其具體機制尚不清楚。病原菌和共生菌都可以產(chǎn)生激活MAIT細胞的配體,機體對這兩類細菌的防御和監(jiān)視應該與MAIT細胞功能密切相關。目前對于MAIT細胞的功能研究大多都是基于體外的細胞實驗,缺乏體內(nèi)研究的直接證據(jù)。另外,小鼠MAIT細胞含量較少也給研究工作帶來了挑戰(zhàn)。近年來發(fā)展起來的MR1與抗原的四聚體復合物[31-32]及MAIThi小鼠[33]的出現(xiàn),無疑會給MAIT細胞的研究帶來極大的益處。