無(wú)特定病原體麻鴨種群的建立*

韓凌霞 趙麗麗 于海波 張 偉 張圓圓 陳洪巖

(中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院哈爾濱獸醫(yī)研究所實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與比較醫(yī)學(xué)團(tuán)隊(duì)/國(guó)家禽類(lèi)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物種子中心，哈爾濱 150001)

開(kāi)發(fā)具有重大價(jià)值的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物資源，特別是農(nóng)用實(shí)驗(yàn)動(dòng)物資源，是實(shí)驗(yàn)動(dòng)物科學(xué)研究的重要內(nèi)容。目前我國(guó)雖已基本除雞實(shí)現(xiàn)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物化而得到廣泛應(yīng)用外，尚無(wú)其它禽類(lèi)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)動(dòng)物化，這對(duì)豐富實(shí)驗(yàn)動(dòng)物資源，尤其是動(dòng)物疫病研究，以及診斷試劑、疫苗研發(fā)非常不利。我國(guó)是世界最大的鴨生產(chǎn)國(guó)，鴨肉、鴨蛋和羽絨產(chǎn)量均位居世界第一。全國(guó)肉鴨存欄已達(dá)12億只，肉鴨出欄約38億只，鴨肉、鴨絨初級(jí)產(chǎn)品的年總產(chǎn)值已經(jīng)達(dá)到790億元，鴨蛋總產(chǎn)值約430億元。鴨還是多種禽病和部分人類(lèi)疫病疫苗的生產(chǎn)原材料和檢定材料。本文是目前國(guó)內(nèi)有關(guān)無(wú)特定病原體(SPF)種鴨群的專(zhuān)業(yè)報(bào)道。疫病對(duì)我國(guó)水禽養(yǎng)殖業(yè)危害嚴(yán)重，因此，培育SPF鴨，實(shí)現(xiàn)禽病研究和生物制品材料的標(biāo)準(zhǔn)化，對(duì)于動(dòng)物健康養(yǎng)殖非常必要。

1 引種

紹興麻鴨白殼I號(hào)產(chǎn)蛋性能優(yōu)良，適應(yīng)性強(qiáng)，可在寒冷干燥地區(qū)離地飼養(yǎng)和籠養(yǎng)，適合于實(shí)驗(yàn)動(dòng)物化；金定鴨是我國(guó)著名的蛋鴨地方品種，具有產(chǎn)蛋量高、體型小、飼料利用率高、雜交利用效果明顯、適應(yīng)性強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)[1-2]。國(guó)家禽類(lèi)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物種子中心在2005年引進(jìn)了浙江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所培育的紹興麻鴨高產(chǎn)系白殼I號(hào)祖代鴨種卵，在國(guó)內(nèi)率先開(kāi)始培育SPF鴨群，2015年從國(guó)家水禽種質(zhì)資源基因庫(kù)江蘇省豐達(dá)水禽育種場(chǎng)引進(jìn)祖代金定鴨種卵，豐富SPF鴨群遺傳資源。

種卵在正壓5級(jí)屏障環(huán)境內(nèi)的孵化器和出雛器內(nèi)孵化、出雛，在鴨用正壓隔離器內(nèi)飼養(yǎng)。開(kāi)始SPF鴨群的培育。

2 質(zhì)量控制

2.1 制定飼養(yǎng)管理制度、規(guī)程

結(jié)合鴨的生產(chǎn)特點(diǎn)，制訂了詳細(xì)的環(huán)境設(shè)施、設(shè)備運(yùn)行、養(yǎng)護(hù)、檢測(cè)、驗(yàn)證程序，嚴(yán)格控制環(huán)境設(shè)施指標(biāo)；對(duì)人流、物流、氣流、飼喂、孵化等環(huán)節(jié)制定了嚴(yán)格的日常消毒、管理和生產(chǎn)工藝規(guī)程，規(guī)定了詳細(xì)的三次更衣、換鞋、手消毒、種蛋熏蒸、物料無(wú)菌傳遞、動(dòng)物飲用水與清潔水無(wú)菌處理及檢測(cè)、消毒劑驗(yàn)證等操作流程，阻斷各種可能的水平傳播途徑。

嚴(yán)格控制環(huán)境設(shè)施指標(biāo)，實(shí)時(shí)維護(hù)、實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)、定期檢測(cè)、定期驗(yàn)證、積極評(píng)價(jià)及糾偏。特別注意設(shè)施設(shè)備的氣密性維護(hù)，各種出入口的控制，進(jìn)入設(shè)施設(shè)備人員、物品、鴨卵、飼料、清潔水、動(dòng)物應(yīng)用水的去菌、消毒。注意降溫、降塵。注意動(dòng)物及物品傳遞。阻斷外界環(huán)境污染和再感染途徑，保證孵化環(huán)境達(dá)到正壓7級(jí)，飼養(yǎng)環(huán)境達(dá)到正壓5級(jí)。

2.2 選育培育

以母系為單位組成家系，采用循環(huán)雄鴨的雜交方式培育封閉群。對(duì)各世代種鴨進(jìn)行體增重、受精率、孵化率、產(chǎn)蛋率、等性能指標(biāo)測(cè)定，選出性能好的家系組成種鴨基礎(chǔ)群(不少于800羽，連續(xù)3代以上)。

2.3 微生物質(zhì)量控制

按照世界獸醫(yī)組織(OIE)的公布，有26種病原可感染鴨，新西蘭出口鴨種卵規(guī)定檢測(cè)9種病原，澳大利亞檢測(cè)8種病原。我國(guó)報(bào)道的主要疫病有鴨瘟、鴨病毒性肝炎、番鴨細(xì)小病毒病、鴨禽流感、番鴨“花肝病”、鴨大腸桿菌病、鴨副傷寒、鴨出敗、鴨疫里默氏桿菌病等。參照國(guó)外進(jìn)出口鴨及鴨卵檢驗(yàn)檢疫技術(shù)，結(jié)合我國(guó)國(guó)情制定了SPF鴨微生物學(xué)監(jiān)測(cè)技術(shù)規(guī)范，建立了番鴨細(xì)小病毒[3]、I型鴨肝炎病毒[4]、多殺性巴氏桿菌[5]、鴨疫里氏桿菌[6]、產(chǎn)腸毒素大腸桿菌[7]等多種疫病的檢測(cè)技術(shù)，確定了SPF鴨微生物學(xué)監(jiān)測(cè)的病原微生物項(xiàng)目、檢測(cè)方法和檢測(cè)程序，制定了中國(guó)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物學(xué)會(huì)團(tuán)體標(biāo)準(zhǔn)《實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 SPF鴨微生物學(xué)監(jiān)測(cè)總則》T/CALAS 18—2017。

針對(duì)嚴(yán)重影響實(shí)驗(yàn)鴨的多種病原微生物，利用病原微生物分離，血清學(xué)抗原、抗體檢測(cè)，以及分子生物學(xué)等手段，對(duì)紹興麻鴨(定名為HBK鴨)、金定鴨(定名為JD鴨)定期全群監(jiān)測(cè)。要求在鴨群的一生中至少每周要做一次臨床觀察，以確保鴨沒(méi)有任何感染的癥狀，首次監(jiān)測(cè)從8周～10周齡開(kāi)始。常規(guī)監(jiān)測(cè)，每隔4周，抽樣檢測(cè)規(guī)定的所有項(xiàng)目。未開(kāi)產(chǎn)鴨，對(duì)所有飼養(yǎng)單元進(jìn)行全部檢測(cè);在整個(gè)產(chǎn)蛋期對(duì)全部因子進(jìn)行抗原或抗體檢測(cè);在產(chǎn)蛋后期，監(jiān)測(cè)是否存在垂直傳播疾病。

2.3.1疫苗免疫:對(duì)種鴨免疫鴨病毒性肝炎I型滅活苗，對(duì)F1代雛鴨免疫2次禽流感H5/H9二聯(lián)滅活苗，對(duì)F2代雛鴨免疫鴨疫里默氏桿菌/大腸桿菌二聯(lián)滅活苗。

2.3.2臨床監(jiān)測(cè)和隔離淘汰:制訂臨床癥狀觀察項(xiàng)目表，用于飼養(yǎng)人員隨時(shí)記錄鴨群的異常臨床癥狀。采用“看”、“聽(tīng)”和“聞”等感官觀察，要求飼養(yǎng)人員隨時(shí)對(duì)鴨群和個(gè)體的精神狀態(tài)、采食量、糞便顏色等12項(xiàng)指標(biāo)進(jìn)行監(jiān)測(cè)，及時(shí)取出可疑動(dòng)物并送交檢測(cè)室剖檢。

2.3.3凈化:鴨病毒性腸炎和鴨病毒性肝炎是鴨最常見(jiàn)、危害較大的兩種病毒性疾病。紹興麻鴨種蛋引進(jìn)之前，曾對(duì)種母鴨免疫了鴨病毒性肝炎I型滅活苗和鴨瘟凍干苗。種蛋孵出后，先連續(xù)對(duì)F1代和F2代進(jìn)行血清學(xué)監(jiān)測(cè)，結(jié)合疫苗免疫情況和微生物學(xué)監(jiān)測(cè)情況，對(duì)抗體陽(yáng)性個(gè)體小于占被檢總數(shù)10%的個(gè)體，淘汰陽(yáng)性個(gè)體；對(duì)陽(yáng)性個(gè)體數(shù)占被檢總數(shù)的10%以上群體，進(jìn)行全群病原學(xué)監(jiān)測(cè)，將病原學(xué)陰性和陽(yáng)性的鴨分別在不同隔離器內(nèi)飼養(yǎng)，直至血清學(xué)監(jiān)測(cè)結(jié)果全部為陰性，凈化了HBK鴨群中的鴨病毒性腸炎、鴨病毒性肝炎。為防止病原菌感染，對(duì)F2代鴨群連續(xù)服用廣譜抗生素新霉素和強(qiáng)力霉素，在F3代鴨分別對(duì)咽拭子、肛拭子、糞便、隔離器和飼養(yǎng)室墻壁等采樣，分離細(xì)菌，經(jīng)DHL鑒別培養(yǎng)、生化試驗(yàn)、針對(duì)沙門(mén)氏菌毒力侵襲基因和內(nèi)毒素基因的PCR檢測(cè)，結(jié)果表明無(wú)白痢沙門(mén)氏菌感染。

2.3.4建立疫病監(jiān)測(cè)標(biāo)準(zhǔn):微生物的監(jiān)測(cè)方法主要有血清中和試驗(yàn)、瓊脂擴(kuò)散試驗(yàn)、細(xì)菌分離、聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)、平板凝集試驗(yàn)、乳膠凝集試驗(yàn)等病原學(xué)技術(shù)，以及血清凝集抑制試驗(yàn)和酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)等血清學(xué)方法，不斷增加排除的疫病，對(duì)鴨瘟等10種病原進(jìn)行全群血清學(xué)和病原學(xué)監(jiān)測(cè)，淘汰陽(yáng)性個(gè)體。HBK鴨目前已凈化了包括白痢、鴨疫里式桿菌、禽網(wǎng)狀內(nèi)皮組織增生癥、禽腺病毒(III群)病、鴨病毒性肝炎I型、鴨病毒性腸炎、禽流感和新城疫等在內(nèi)的10種疫病，建立了核心群。JD鴨已經(jīng)排除了禽流感、雞新城疫、禽腺病毒(Ⅲ群)病、番鴨細(xì)小病毒病、雞白血病、鵝細(xì)小病毒病、鴨病毒性腸炎、鴨病毒性肝炎I型、鴨圓環(huán)病毒病和鴨坦布蘇病等10種疫病，建立了無(wú)特定病原體核心群。

2.4 遺傳質(zhì)量控制

由于鴨的遺傳學(xué)特征與其疫病敏感性、免疫學(xué)應(yīng)答能力和繁殖性能有密切相關(guān)性，而且受飼養(yǎng)設(shè)施設(shè)備的限制，種鴨群的規(guī)模無(wú)法與常規(guī)養(yǎng)殖業(yè)相提并論，因此制定SPF鴨種群的遺傳學(xué)質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)尤為重要，利用微衛(wèi)星標(biāo)記和免疫遺傳基因提出了團(tuán)體標(biāo)準(zhǔn)《SPF鴨遺傳學(xué)監(jiān)測(cè)》，分別針對(duì)封閉群和免疫遺傳基因單倍體型進(jìn)行了規(guī)定。

2.4.1HBK-SPF鴨群的遺傳學(xué)監(jiān)測(cè):利用酯酶1(Es1)、轉(zhuǎn)鐵蛋白(Trf)、碳酸酐酶-2(Car2)、葡萄糖磷酸異構(gòu)酶-1(Gpi1)、酯酶10(Es10)和磷酸葡萄糖轉(zhuǎn)位酶-1(Pgm1)等6種同工酶在HBK鴨不同代次、不同品系和不同組織中的表達(dá)進(jìn)行了研究，結(jié)果表明血清中的Es1和Trf、溶血素中的Car2和Gpi1、腎臟中的Pgm1、肝臟中的Es10等6種同工酶在相應(yīng)的組織中能夠出現(xiàn)穩(wěn)定的帶型，重復(fù)性較好。檢測(cè)F2代和F3代，染色結(jié)果基本一致，除Car2位點(diǎn)F3代鴨比F2代多一條帶，Es10位點(diǎn)F3代比F2代少一條帶外，F(xiàn)2代和F3代存在一定程度的多態(tài)性，而且相互之間有一定差異，符合封閉群實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的遺傳學(xué)要求[8]。

根據(jù)蛋殼顏色選育出B和Q兩個(gè)品系。利用聯(lián)合國(guó)糧農(nóng)組織推薦的18對(duì)鴨微衛(wèi)星DNA標(biāo)記位點(diǎn)，建立了HBK鴨群的分子遺傳學(xué)檢測(cè)方法。在F2和F3世代的4個(gè)群體中，共檢測(cè)到80個(gè)等位基因。每個(gè)位點(diǎn)上的等位基因數(shù)最多的為7個(gè)，最少的為3個(gè)。F2代HBK-B和HBK-Q群體中分別有8個(gè)和11個(gè)位點(diǎn)屬于高度多態(tài)位點(diǎn)，平均雜合度分別為0.519±0.160和0.549±0.237；在F3代HBK-B和HBK-Q分別有11和10個(gè)位點(diǎn)呈現(xiàn)出高度多態(tài)，雜合度分別為0.552±0.192和0.512±0.192，其他位點(diǎn)均呈現(xiàn)中度多態(tài)。利用16對(duì)微衛(wèi)星標(biāo)記對(duì)F5代和F6代行遺傳多樣性分析，共檢測(cè)到71個(gè)等位基因，每個(gè)位點(diǎn)的平均等位基因數(shù)為4.14，與F2代和F3代相比有所下降；F5代和F6代鴨群偏離哈-代平衡的位點(diǎn)有所減少，分別僅有2個(gè)和4個(gè)位點(diǎn)顯著偏離平衡狀態(tài)；多態(tài)信息含量(PIC)大于 0.5的位點(diǎn)數(shù)量減少，F(xiàn)5代2個(gè)群體的平均PIC分別為0.511和0.512，F(xiàn)6代2個(gè)群體的平均PIC分別為0.48和0.505；F5代2個(gè)群體的期望雜合度(He)分別為0.575和0.574，F(xiàn)6代的He分別為0.546和0.566。表明經(jīng)過(guò)6個(gè)世代的繁育，偏離平衡的位點(diǎn)減少，以等位基因數(shù)目為標(biāo)志的群體遺傳多樣性下降，近交程度呈上升趨勢(shì)，但群體的雜合度則維持相對(duì)穩(wěn)定；Q品系從F2～F6代的遺傳背景呈規(guī)律性變化，B品系遺傳背景存在一定的交替上升或下降，但總體趨于持續(xù)的上升或下降[9]。

2.4.2JD-SPF鴨的群體遺傳結(jié)構(gòu)分析:采用17個(gè)微衛(wèi)星標(biāo)記，結(jié)合PCR和毛細(xì)管電泳技術(shù)，在JD-SPF鴨群71個(gè)位點(diǎn)共檢測(cè)到119個(gè)等位基因，每個(gè)位點(diǎn)上等位基因數(shù)為3～13個(gè)，大部分位點(diǎn)上檢測(cè)到的等位基因數(shù)都接近于文獻(xiàn)報(bào)道鴨群有13個(gè)位點(diǎn)呈現(xiàn)出高度多態(tài)(PIC>0.5)，平均雜合度為0.5816 ± 0.0142，其它位點(diǎn)均呈現(xiàn)出中度多態(tài)，有5個(gè)位點(diǎn)處于哈-代平衡，其余12個(gè)位點(diǎn)顯著偏離，達(dá)到極顯著水平(P<0.01)[10]。

2.5 飼料營(yíng)養(yǎng)與飲水

目前尚無(wú)SPF鴨的飼料營(yíng)養(yǎng)標(biāo)準(zhǔn)，主要參考商業(yè)標(biāo)準(zhǔn)。SPF鴨飼養(yǎng)階段依據(jù)不同生理需要和生產(chǎn)需要分為育雛期、育成期、產(chǎn)蛋前期和產(chǎn)蛋高峰期四個(gè)階段。在參考旱式平養(yǎng)蛋鴨營(yíng)養(yǎng)需要量的同時(shí)，根據(jù)隔離飼養(yǎng)和屏障飼養(yǎng)的變化，以及飼料滅菌過(guò)程產(chǎn)生的營(yíng)養(yǎng)損失，制定了《實(shí)驗(yàn)動(dòng)物SPF鴨配合飼料》T/CALAS 17—2017團(tuán)體標(biāo)準(zhǔn)草案。SPF鴨配合飼料的衛(wèi)生指標(biāo)采用“豬雞鴨用飼料產(chǎn)品安全質(zhì)量的要求(DB35/562)”，飼料滅菌標(biāo)準(zhǔn)參照“飼料輻照滅菌工藝本標(biāo)準(zhǔn)(DB32/T572)”，輻照強(qiáng)度及滅菌效果參照“飼料輻照殺菌技術(shù)規(guī)范(NY/T1448)”。

采用自動(dòng)飲水裝置自由飲水，飲用無(wú)菌純化水。定期進(jìn)行微生物含量的監(jiān)測(cè)，消毒與滅菌效果的評(píng)價(jià)參照“消毒與滅菌效果的評(píng)價(jià)方法與標(biāo)準(zhǔn)(GB15981)”。

2.6 生物學(xué)特性數(shù)據(jù)的采集與社會(huì)化共享

根據(jù)實(shí)驗(yàn)禽生物學(xué)特性數(shù)據(jù)及其采集規(guī)范，采集HBK-B-SPF鴨和HBK-Q-SPF鴨的生物學(xué)特性數(shù)據(jù)，包括19項(xiàng)血液生理參數(shù)、15項(xiàng)生殖生理參數(shù)、1項(xiàng)生長(zhǎng)發(fā)育生理參數(shù)、2項(xiàng)種呼吸生理參數(shù)、3項(xiàng)心血管生理參數(shù)、19項(xiàng)血液生化參數(shù)、11項(xiàng)解剖學(xué)參數(shù)和7項(xiàng)遺傳學(xué)數(shù)據(jù)，并進(jìn)行了差異顯著性比較，發(fā)現(xiàn)部分?jǐn)?shù)據(jù)存在顯著性差異，為新品系的建立提供了基礎(chǔ)。所有數(shù)據(jù)都提交國(guó)家實(shí)驗(yàn)動(dòng)物數(shù)據(jù)資源中心(E-平臺(tái))，實(shí)現(xiàn)了數(shù)據(jù)資源的社會(huì)共享[11-14]。

2.7 疫病敏感性研究

針對(duì)HBK鴨進(jìn)行了網(wǎng)狀內(nèi)皮組織增生癥(REV)[15]、禽流感重組鴨瘟疫苗[16]的敏感性分析。利用HBK雛鴨接種鴨疫里氏桿菌24 h后，實(shí)驗(yàn)組動(dòng)物有縮頸、嗜眠、共濟(jì)失調(diào)等癥狀，36 h后出現(xiàn)死亡。剖檢可見(jiàn)心包炎、肝臟表面覆蓋一層薄膜狀的纖維素性滲出物等RA病典型臨床特征[17]；鴨病毒性肝炎I型強(qiáng)毒株感染HBK雛鴨，接種后4 h即可在雛鴨心、肝、腦、肺、胰腺、回腸、盲腸、直腸、法氏囊和脾臟組織中檢測(cè)到病毒RNA，隨著病程發(fā)展，RNA拷貝數(shù)持續(xù)升高，接種24 h后，肝臟中的病毒含量最高，說(shuō)明強(qiáng)毒在HBK雛鴨的早期感染雛鴨的實(shí)質(zhì)器官、免疫器官和消化系統(tǒng)等均具有廣泛的嗜性[18-19]；利用SPF鴨評(píng)估了當(dāng)前在中國(guó)鴨群中流行的新城疫病毒基因型，表明比SPF雞更適合用于評(píng)估鴨源新城疫病毒的毒力[20]；利用SPF鴨胚首次發(fā)現(xiàn)鴨腸炎病毒感染能引起自噬，為鴨病毒性腸炎的致病機(jī)理研究提供了新思路[21]。除了基礎(chǔ)研究，在鴨病生物制品研制中也發(fā)揮了重要作用[22]。

利用鴨基因組抗原轉(zhuǎn)關(guān)相關(guān)蛋白TAP的單位點(diǎn)等位基因型，從HBK鴨群選育出4個(gè)免疫遺傳相關(guān)的家系，用鴨疫里氏桿菌感染上述B1、B2、B3 3個(gè)純系和B2/B4雜合鴨，結(jié)果死亡率無(wú)顯著性差異；接種鴨病毒性肝炎I型，結(jié)果B2鴨死亡率(36%)明顯低于其他型(73%～93%)[23]。接種表達(dá)H5亞型禽流感HA基因重組鴨瘟活載體疫苗，結(jié)果9周內(nèi)B3群鴨血凝抑制抗體效價(jià)始終顯著高于B1、B2和B4群[16]。表明HBK鴨的TAP等位基因型與鴨病的致病性和免疫應(yīng)答能力有關(guān)。

3 結(jié)語(yǔ)

鴨是絕大多數(shù)禽病的天然病原儲(chǔ)存庫(kù)和混合器，離開(kāi)SPF鴨研究禽病獲得的成果是不完整的。從比較醫(yī)學(xué)的角度講，至今鴨肝炎仍是人乙型肝炎研究最適合的動(dòng)物模型。事實(shí)上，鴨在人和禽用生物制品的研究、生產(chǎn)和檢定方面同樣不可或缺。

當(dāng)前，我們已初步完成HBK和JD兩個(gè)品系的選育，實(shí)驗(yàn)鴨的年產(chǎn)量從2013年的8 520羽發(fā)展到2015年的19 276羽[24]，為全國(guó)禽病科研單位和企業(yè)提供了良好的條件支撐。進(jìn)一步結(jié)合疫病敏感型和高生產(chǎn)力，篩選相應(yīng)的分子標(biāo)記，選育遺傳學(xué)更純合、質(zhì)量更優(yōu)良的SPF鴨，將是我們下一步的工作。