免疫球蛋白降低對(duì)復(fù)發(fā)性流產(chǎn)患者NK細(xì)胞的療效評(píng)價(jià)

劉曉麗，鄧飛越，周　楊，黃鍵寧，郭彩霞

(廣州市增城區(qū)人民醫(yī)院婦產(chǎn)科，廣東 廣州 511300)

目前我國(guó)處于社會(huì)和經(jīng)濟(jì)轉(zhuǎn)型期，女性的生育年齡逐漸推后，復(fù)發(fā)性流產(chǎn)(recurrent spontaneous abortion，RSA)問(wèn)題日益嚴(yán)峻[1]。越來(lái)越多的證據(jù)表明免疫因素在RSA的發(fā)病機(jī)制中起著重要的作用[2]，包括體液因素(如抗磷脂抗體、抗甲狀腺抗體、抗細(xì)胞核抗體、免疫球蛋白M升高)和細(xì)胞因素(如自然殺傷細(xì)胞上升和抑制性T淋巴細(xì)胞下降)等，免疫作用對(duì)滋養(yǎng)層、胎盤和胚胎產(chǎn)生一定的毒性反應(yīng)導(dǎo)致流產(chǎn)[3]，其中外周血自然殺傷細(xì)胞(natural killer，NK) 細(xì)胞數(shù)量和活性與不明原因復(fù)發(fā)性自然流產(chǎn)明顯相關(guān)。自上世紀(jì)80年代以來(lái)，注射用免疫球蛋白(intravenous immunoglobulin，IVIG)一直被用于治療RSA，通常被認(rèn)為是通過(guò)降低NK毒性，使Th1/Th2平衡向Th2發(fā)展而發(fā)揮作用[4]，但對(duì)于NK細(xì)胞正常的RSA女性臨床療效目前尚不明確。為進(jìn)一步明確IVIG對(duì)不同NK細(xì)胞水平RSA女性的治療效果，本研究納入部分患者進(jìn)行對(duì)比分析，現(xiàn)報(bào)告如下。

1資料與方法

1.1一般資料

選擇2011年10月至2015年12月在廣州市增城區(qū)人民醫(yī)院婦產(chǎn)科就診的RSA患者，入選標(biāo)準(zhǔn)：①年齡20 ～40歲；②既往曾連續(xù)發(fā)生≥3次的無(wú)明顯誘因自然流產(chǎn)；③抗磷脂抗體、抗核抗體、抗甲狀腺微粒抗體等各種自身抗體陰性；④血清IgA水平正常；⑤了解研究?jī)?nèi)容并愿意配合檢查，簽署知情同意書。排除標(biāo)準(zhǔn)：①激素水平偏低或夫婦雙方染色體異常；②泌尿生殖系統(tǒng)感染或活動(dòng)性炎癥；③內(nèi)外生殖系統(tǒng)解剖異?；蚱髻|(zhì)性病變；④嚴(yán)重的心肝腎或血液系統(tǒng)疾病，無(wú)法耐受IVIG治療。符合入選標(biāo)準(zhǔn)的患者90例，按NK細(xì)胞是否正常分為NK細(xì)胞升高組(試驗(yàn)組，56例)和NK細(xì)胞正常組(對(duì)照組，34例)，90例患者均順利接受IVIG治療，無(wú)1例失訪、中途退出或死亡，所有數(shù)據(jù)均納入分析。

1.2方法

1.2.1治療方法

試驗(yàn)組和對(duì)照組均給予IVIG(2.5g：50mL/瓶)500mg/kg，靜脈注射，在卵泡期開(kāi)始治療，滴速控制在75mL/h，1次/月[5]，兩組具體給藥方案見(jiàn)表1。

表1兩組IVIG用藥方法

Table 1 Comparison of IVIG between two groups

組別持續(xù)用藥方案成功妊娠者未妊娠者試驗(yàn)組★第二次用藥前復(fù)查NK細(xì)胞，仍高于正常值者繼續(xù)用藥，如果NK細(xì)胞已恢復(fù)則暫停用藥定期復(fù)查NK細(xì)胞，正常者繼續(xù)觀察，仍升高者IVIG用法同前療程不超過(guò)半年對(duì)照組IVIG每月1次IVIG每月1次療程不超過(guò)半年

注：★連續(xù)兩次復(fù)查NK細(xì)胞仍為正常者停止用藥，后續(xù)再出現(xiàn)NK細(xì)胞升高也不給藥。

1.2.2檢測(cè)指標(biāo)

1.2.2.1 NK細(xì)胞NK細(xì)胞CD16和CD56抗原均有表達(dá)，同時(shí)CD3抗原陰性，因此CD3-/CD16+56+的細(xì)胞才是真正的NK細(xì)胞?；颊叱科鹂崭钩槿≈忪o脈血3mL，常規(guī)肝素抗凝后-4℃冷凍保存，使用Ficoll-Hypaque 法離心分離外周血單個(gè)核細(xì)胞(peripheral blood mononuclear cells，PBMCs)，通過(guò)孵育、透化等處理后采用流式細(xì)胞儀(型號(hào)Biosciences AccuriC6，美國(guó)BD公司生產(chǎn))測(cè)定患者NK細(xì)胞的范圍。由于淋巴細(xì)胞亞群存在種族、性別和年齡差異，目前國(guó)內(nèi)尚無(wú)淋巴細(xì)胞亞群正常值范圍供參考，因此本研究采用姚春艷等[6]的研究結(jié)果(0.78%～11.71%)作為正常值標(biāo)準(zhǔn)。

1.2.2.2妊娠結(jié)局 詳細(xì)記錄兩組患者的異位妊娠、孕周、分娩方式、胎兒宮內(nèi)發(fā)育、胎兒體重、Apgar評(píng)分和并發(fā)癥情況。世界衛(wèi)生組織分娩指導(dǎo)對(duì)正常分娩的定義為產(chǎn)婦自產(chǎn)程開(kāi)始到結(jié)束均為低危，胎兒?jiǎn)翁?、頭位，在37孕周和42孕周之間自然的發(fā)動(dòng)宮縮，胎兒經(jīng)陰道自然娩出，產(chǎn)后母親與胎兒情況良好。并強(qiáng)調(diào)在正常分娩中，除非有確切必要的理由，不要干涉正常產(chǎn)程的進(jìn)展[7]。

1.2.2.3不良反應(yīng) 記錄兩組用藥過(guò)程中出現(xiàn)與藥物相關(guān)的不良反應(yīng)(如輸液反應(yīng)、頭痛)的發(fā)生情況。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

以SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)量資料使用“Kolmogorov-Smirnov”作正態(tài)性檢驗(yàn)，符合正態(tài)分布的數(shù)據(jù)以均值±標(biāo)準(zhǔn)差描述，組間比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)；不符合正態(tài)分布的數(shù)據(jù)以中位數(shù)(四分位間距)表示，組間比較采用Wilcoxon秩和檢驗(yàn)；計(jì)數(shù)資料以百分率描述，組間比較采用χ2檢驗(yàn)；均以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2結(jié)果

2.1一般情況

兩組年齡、受孕方法、既往孕產(chǎn)次等資料組間比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，而試驗(yàn)組NK細(xì)胞水平高于對(duì)照組(P<0.05)，見(jiàn)表2。

表2兩組人口學(xué)及病情資料組間比較[χ±S,n(%)]

Table 2 Comparison of demographic and disease data between two groups[χ±S,n(%)]

比較項(xiàng)目試驗(yàn)組(n=56)對(duì)照組(n=34)t/χ2/ZP年齡(歲)32．37±5．5330．28±3．323．350．05受孕方式　自然受孕52(92．86)33(97．06)0．710．40　人工受孕4(7．14)1(2．94)既往孕次5(3，7)4(3，6)1．440．48既往產(chǎn)次　未產(chǎn)48(85．71)32(94．12)1．510．22　≥1次8(14．29)2(5．88)NK細(xì)胞比例(%)15．53(12．40，17．11)3．38(2．25，6．33)9．33<0．01

2.2妊娠情況

試驗(yàn)組和對(duì)照組各有早產(chǎn)兒3例和1例，剖宮產(chǎn)2例和1例，組間比較差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；兩組均無(wú)異位妊娠、胎兒宮內(nèi)生長(zhǎng)遲緩和畸形病例，未出現(xiàn)產(chǎn)后出血、羊水栓塞等并發(fā)癥；試驗(yàn)組妊娠率、正常分娩率均高于對(duì)照組，組間比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，而流產(chǎn)率低于對(duì)照組(P>0.05)，見(jiàn)表3。

2.3不良反應(yīng)

兩組分別有部分患者出現(xiàn)輸液反應(yīng)、頭痛和過(guò)敏等不良反應(yīng)，無(wú)肝腎功能損害病例，兩組不良反應(yīng)發(fā)生率分別為10.71%和17.65%，組間比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=0.88，P=0.35)，見(jiàn)表4。

表3兩組妊娠情況比較[n(%)]

Table 3Comparison of pregnancy between two groups[n(%)]

比較項(xiàng)目試驗(yàn)組(n=56)對(duì)照組(n=34)χ2P妊娠率49(87．50)11(32．35)28．95<0．01正常分娩率40(71．43)4(11．76)30．14<0．01流產(chǎn)率4(7．14)5(14．71)1．340．25早產(chǎn)3(5．36)1(2．94)0．290．59剖腹產(chǎn)2(3．57)1(2．94)0．030．87

表4兩組不良反應(yīng)發(fā)生率比較[n(%)]

Table 4 Comparison of incidence of adverse reactions between groups[n(%)]

類別試驗(yàn)組(n=56)對(duì)照組(n=34)輸液反應(yīng)2(3．57)3(8．82)頭痛3(5．36)1(2．94)過(guò)敏反應(yīng)1(1．79)2(5．88)肝腎功能損害00合計(jì)6(10．71)6(17．65)

3討論

3.1復(fù)發(fā)性流產(chǎn)發(fā)病機(jī)制及治療方法進(jìn)展

RSA的病因包括夫妻染色體異常、母親生殖器器質(zhì)性或功能性病變、激素水平改變、環(huán)境生活因素、免疫功能和心理因素異常等[8]，其中免疫因素引起的流產(chǎn)被稱為免疫性流產(chǎn)，尤其是對(duì)年齡>30歲的女性[7]。年齡是RSA病因劃分的重要因素，年輕RSA女性(<30歲)通常是由于甲狀腺功能異常、基因變異、子宮畸形、血糖異常和吸煙等，而高齡RSA女性(≥30歲)異倍體和免疫功能異常則是關(guān)鍵病因，其免疫異常主要表現(xiàn)為Th2細(xì)胞比例下降而Th1細(xì)胞上升，使機(jī)體免疫應(yīng)答系統(tǒng)從生育模式轉(zhuǎn)變?yōu)椴≡烙Ｊ絒9]。

RSA的治療一直處于爭(zhēng)議狀態(tài)，由于狼瘡抗凝綜合征和抗磷脂抗體促進(jìn)血栓的形成，使用肝素和阿司匹林的抗凝策略曾一度盛行，該療法有效率接近80%，但也導(dǎo)致16%的女性發(fā)生出血，甚至出現(xiàn)致死性出血事件[10]。后期研究意識(shí)到免疫因素的重要性，免疫調(diào)節(jié)治療逐漸在臨床普及，但糖皮質(zhì)激素只對(duì)抗細(xì)胞核抗體陽(yáng)性的病例有效率較高，其他類型的RSA無(wú)效，而且不良反應(yīng)相當(dāng)明顯，甚至可導(dǎo)致胎兒早產(chǎn)[11]。同種異體淋巴細(xì)胞免疫治療對(duì)部分RSA孕婦有一定效果，但總體有效率仍然偏低，而且有嚴(yán)重過(guò)敏反應(yīng)和注射部位瘢痕疼痛的病例報(bào)告，目前已經(jīng)被大多數(shù)醫(yī)療機(jī)構(gòu)淘汰，現(xiàn)在主要采用患者配偶或健康人群的淋巴細(xì)胞進(jìn)行主動(dòng)免疫治療和丙種球蛋白被動(dòng)免疫治療兩種方法[12]。

3.2 NK細(xì)胞在復(fù)發(fā)性流產(chǎn)發(fā)病的病理作用

NK細(xì)胞是與T、B細(xì)胞并列的第三類群淋巴細(xì)胞，占外周血淋巴細(xì)胞總數(shù)的10%～15%，有一定的細(xì)胞毒性效應(yīng)，無(wú)需抗原預(yù)先致敏就可自發(fā)殺傷靶細(xì)胞，還可以通過(guò)分泌細(xì)胞因子發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)作用。NK細(xì)胞也可能通過(guò)產(chǎn)生穿孔素并促進(jìn)NK細(xì)胞活化，參與早產(chǎn)的免疫發(fā)病機(jī)制[13]。研究表明外周血NK細(xì)胞數(shù)量上升與RSA相關(guān)，無(wú)RSA病史的女性血清NK細(xì)胞比例為5%～8%，而RSA病史的女性NK細(xì)胞比例可上升至9.5%～17%，有研究表明以血清NK細(xì)胞的比例(界值為>16.4%)作為妊娠結(jié)局的預(yù)測(cè)指標(biāo)，預(yù)示染色體核型正常的妊娠也可能發(fā)生異常妊娠或自然流產(chǎn)[14]。免疫治療可降低RSA患者NK細(xì)胞水平，即使使用了肝素、阿司匹林和潑尼松等抗炎藥物，25%～30%的妊娠病例仍然發(fā)展為流產(chǎn)，而該部分孕婦使用免疫球蛋白(IVIG)后NK細(xì)胞<9%，可使妊娠的成功率上升至82%[6]。

3.3免疫球蛋白對(duì)NK細(xì)胞升高性復(fù)發(fā)性流產(chǎn)的治療意義

雖然IVIG實(shí)際的治療機(jī)制目前尚不明確，調(diào)節(jié)淋巴細(xì)胞活性和細(xì)胞因子水平可能是起效原因，但也有研究認(rèn)為IVIG并無(wú)確切的治療價(jià)值[15]。Cohen等[5]認(rèn)為可能的原因是這類研究故意排除了高齡女性，而且IVIG的用量不合理或過(guò)量，甚至納入了部分免疫功能異常的女性。本研究以NK細(xì)胞作為分組依據(jù)，考慮到IVIG的半衰期為23～30d，4周的療程足以達(dá)到免疫調(diào)節(jié)、完成Th1和Th2細(xì)胞轉(zhuǎn)換的目的；同時(shí)，有1/3的女性在妊娠期出現(xiàn)NK細(xì)胞水平提高，如果沒(méi)有在妊娠期停止IVIG可導(dǎo)致25%的女性發(fā)生妊娠晚期流產(chǎn)[16]，因此筆者謹(jǐn)慎地采用每月1次的治療方法，有效地避免了NK細(xì)胞的再度升高，研究結(jié)果表明IVIG對(duì)NK細(xì)胞升高的RSA女性有確切的治療效果，而NK細(xì)胞水平正常組有效率卻較低，可能是因?yàn)樵摬糠峙粤鳟a(chǎn)的病因與免疫功能關(guān)系較弱，而確切的機(jī)制需要更多的研究證實(shí)。

本研究試驗(yàn)組IVIG治療有效的原因有幾點(diǎn)：①試驗(yàn)組均為NK細(xì)胞升高的女性；②IVIG治療在受孕前開(kāi)始進(jìn)行；③妊娠期間NK細(xì)胞上升的女性，繼續(xù)給予每月一次的IVIG治療;④由于入選的女性均為IgA水平正常的人群，IVIG過(guò)敏反應(yīng)的風(fēng)險(xiǎn)大大降低[6]，因此合適的人群、適當(dāng)?shù)闹委熎鹗紩r(shí)間是IVIG有效的關(guān)鍵。

綜上所述，低劑量IVIG能有效改善NK細(xì)胞上升RSA女性的妊娠及正常分娩率，NK細(xì)胞應(yīng)該成為RSA患者的常規(guī)檢查。

[參考文獻(xiàn)]

[1]鄭艷敏,王燕,趙靜,等.血清雙酚A含量與復(fù)發(fā)性流產(chǎn)的1:2病例對(duì)照研究[J].中華流行病學(xué)雜志,2012,33(8):841-845.

[2]Egerup P,Lindschou J,Gluud C,etal. Theeffects of intravenous immunoglobulins in women with recurrent miscarriages: a systematic review of randomised trials with meta-analyses and trial sequential analyses including individual patient data[J]. PLoS One,2015,10(10):e0141588.

[3]Gao Y,Wang P L.Increased CD56(+) NK cells and enhanced Th1 responses in human unexplained recurrent spontaneous abortion[J].Genet Mol Res,2015,14(4):18103-18109.

[4]李玉華,陳穎,祝麗瓊,等.靜脈用免疫球蛋白對(duì)不明原因復(fù)發(fā)性自然流產(chǎn)患者外周血淋巴細(xì)胞和妊娠結(jié)局的影響[J].生殖與避孕,2014,34(8):672-676.

[5]Cohen B M,Machupalli S.Use ofgammaglobulin to lower elevated natural killer cells in patients with recurrent miscarriage[J].J Reprod Med,2015,60(7-8):294-300.

[6]姚春艷,金齊力,姜麗娜,等.正常人外周血自然殺傷T細(xì)胞(CD3+CD16+CD56+)比例[J].蚌埠醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào),2008,33(4):379-382.

[7]曾曉琴,肖青,龔桂芳.復(fù)發(fā)性流產(chǎn)患者家庭功能及應(yīng)對(duì)方式與心理狀況分析[J].中國(guó)婦幼健康研究,2014,25(3):388-390.

[8]張宏玉,張惠欣.正常分娩定義與產(chǎn)程研究進(jìn)展[J].中國(guó)生育健康雜志,2014,25(2):189-192.

[9] Jung S J,Park S K,Shin A,etal. Body mass index at age 18-20 and later risk of spontaneous abortion in the Health Examinees Study (HEXA)[J].BMC Pregnancy Childbirth,2015,15:228.

[10]Kaandorp S P,van Mens T E,Middeldorp S,etal.Time to conception and time to live birth in women with unexplained recurrent miscarriage[J].Hum Reprod,2014,29(6):1146-1152.

[11]Ticconi C,Rotondi F,Veglia M,etal.Antinuclear autoantibodies in women with recurrent pregnancy loss[J]. Am J Reprod Immunol,2010,64(6):384-392.

[12]Liang X,Qiu T,Qiu L,etal.Female third party lymphocytes are effective for immunotherapy of patients with unexplained primary recurrent spontaneous abortion:a retrospective analysis of outcomes[J].Eur J Contracept Reprod Health Care,2015,20(6):428-437.

[13]洪建芬,陸月平,張翔珍.iNKT細(xì)胞在自發(fā)性早產(chǎn)發(fā)動(dòng)機(jī)制中的作用研究[J].中國(guó)婦幼健康研究,2015,26(5):920-921,924.

[14]Sharma S.Natural killer cells and regulatory T cells in early pregnancy loss[J]. Int J Dev Biol,2014,58(2-4):219-229.

[15] Egerup P,Lindschou J,Gluud C,etal.The effects of immunotherapy with intravenous immunoglobulins versus no intervention, placebo, or usual care in patients with recurrent miscarriages: a protocol for a systematic review with meta-analyses, trial sequential analyses, and individual patient data meta-analyses of randomised clinical trials[J].Syst Rev,2014,3:89.

[16]Karami N,Boroujerdnia M G,Nikbakht R,etal.Enhancement of peripheral blood CD56(dim) cell and NK cell cytotoxicity in women with recurrent spontaneous abortion or in vitro fertilization failure[J].J Reprod Immunol,2012,95(1-2):87-92.