手足口病患兒心肌酶等血清指標的分析

王　喆，張　倩，黎曼儂，黎　麗，李季梅，張　鳳

(1.昆明市婦幼保健院檢驗科；2.兒科，云南 昆明 650031)

手足口病(hand-foot-and-mouth disease，HFMD)是臨床上發(fā)病率較高的傳染性疾病，近年來雖然相關衛(wèi)生條件有所改善，但HFMD的發(fā)病率仍然可達0.6%以上[1]，近3年來呈現(xiàn)出了明顯上升的趨勢，且在部分地區(qū)容易呈現(xiàn)暴發(fā)流行，嚴重影響了小兒的生命健康。長期的HFMD疾病的進展可導致心肌炎、心內膜炎、肺水腫以及腦膜炎的發(fā)生，預后不佳[2-3]。

心臟以及腦部神經(jīng)組織是HFMD較為常見的累及器官或者組織，對于心腦等重要器官的損傷是增加HFMD患兒后遺癥發(fā)生的主要因素。在HFMD發(fā)病的早期通過檢測血清學分子標志物或者其他輔助檢查方法，可以為早期糖皮質激素、神經(jīng)營養(yǎng)性藥物的及時臨床干預提供參考，從而降低遠期神經(jīng)系統(tǒng)等并發(fā)癥的發(fā)生，改善預后。α-羥基丁酸脫氫酶(α-hydroxybutyrate dehydrogenase，α-HBDH)、乳酸脫氫酶(lactic dehydrogenase，LDH)、肌酸激酶(creatine kinase，CK)、肌酸激酶同工酶(creatine kinase mulscle brain，CK-MB)等是評估心肌細胞損傷的重要標志[4]，而為神經(jīng)元特異性烯醇化酶(neuron specific enolase，NSE)、酸性鈣結合蛋白S100(S-100β)是評估神經(jīng)系統(tǒng)損傷和受累的重要標志[5]，本次研究重在探討相關血清學指標在不同程度的HFMD患者中的異常表達，進而為早期診斷HFMD患者的心臟以及腦部神經(jīng)組織的損傷提供重要參考。

1資料與方法

1.1一般資料

選取2016年1月至2016年3月在昆明市婦幼保健院治療的手足口病患兒179例，其中21例為危重型患兒，89例為重型患兒，69例為普通型患兒，同時選取本院門診健康體檢兒童30例(對照組)，納入標準：①手足口病診斷符合衛(wèi)生部2010年版《手足口病診療指南》[6]；②患兒家屬知情同意并簽署同意書。排除標準：①近3個月有上呼吸道感染或手術史；②合并有神經(jīng)系統(tǒng)疾病。

1.2標本采集及檢測方法

患者于入院當時采肘靜脈血，2mL血樣在室溫下靜置30分鐘后，4 000r/min離心10分鐘分離血清，并將血清置于4℃搖床上，避免溶血的發(fā)生，將血清置于Eppendorf管中，-80℃超低溫冰箱保存，避免反復凍融，為減小批間誤差和測量誤差，全部標本采集完成后一次性成批檢測LDH、α-HBDH、CK和CK-MB水平。放射免疫試劑盒購自南京凱基生物科技有限公司，生化檢測儀器Olmypus 640購自上海精密儀器有限公司。

CTnI的檢測采用化學發(fā)光法檢測，采肘靜脈血2mL血樣在室溫下靜置30分鐘后，4 000r/min離心10分鐘分離血清，Beckman counter DXI80 儀器購自上海精密儀器有限公司。

采肘靜脈血2mL血樣在室溫下靜置30分鐘后，4 000r/min離心10分鐘分離血清，4℃保存待測，以標準品稀釋液將標準品復溶，靜置15min后混勻，對比稀釋為7個濃度，取出板條，除了對照孔外每個孔加入不同濃度的標準品，劑量為100μL/孔，采用封板蓋封住，室溫反應120分鐘，使用PBS液體洗滌3次，除了空白對照孔，每孔加入檢測液(100μL)，室溫孵育1小時，PBS洗滌3次，加入底物(50μL/孔)，避光孵育25分鐘，加入終止液5分鐘后測定450nm處吸光度。酶標儀科華KBH ST-300購自上海精密試驗儀器有限公司，NSE、S-100抗體購自南京凱基生物科技有限公司，配套試劑購自羅氏檢測公司，嚴格按照說明書的要求進行操作。

1.3統(tǒng)計學方法

數(shù)據(jù)處理分析應采用SPSS 19.0統(tǒng)計軟件，計量資料采用(χ±S)表示，組間比較使用方差分析，兩兩比較使用LSD檢驗。以P<0.05表示差異具有統(tǒng)計學意義。

2結果

2.1患兒基本情況

各組患兒一般臨床資料比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，見表1。

表1各組患兒一般臨床資料比較[χ±S，n(%)]

Table 1 Comparison of general clinical data of children among groups[χ±S，n(%)]

組別例數(shù)(n)年齡(y)男/女危重型212．32±0．8113(61．90)/8(38．10)重型892．40±0．7551(57．30)/38(42．70)普通型692．37±0．9442(60．87)/27(39．13)對照組302．41±0．8819(63．33)/11(36．67)F/χ22．1810．458P>0．05>0．05

2.2各組血清心肌酶及心肌肌鈣蛋白Ⅰ比較

手足口病患兒血清LDH、α-HBDH、CK和CK-MB明顯高于對照組，而CTnI明顯低于對照組，差異均有統(tǒng)計學意義(均P<0.05)；危重型手足口病患兒血清LDH、α-HBDH、CK和CK-MB分別為(402.13±34.29)IU/L、(312.37±61.92)IU/L、(154.20±17.82)IU/L和(27.83±9.04)IU/L，均明顯高于重型和普通型患兒，而CTnI為(0.11±0.02)IU/L，明顯低于重型和普通型患兒，差異均具有統(tǒng)計學意義(具P<0.05)，見表2。

表2　　各組血清心肌酶及CTnI比較(χ±S)

注：a與對照組比較P<0.05；b與普通型比較P<0.05；c與重型比較P<0.05。

2.3各組血清神經(jīng)元特異性烯醇化酶含量比較

危重型和重型手足口病患兒NSE為(27.10±6.52)ng/mL和(19.43±6.10)ng/mL，均高于普通型患兒和對照組，差異均具有統(tǒng)計學意義(均P<0.05)；危重型患兒NSE水平高于重型患兒，差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；普通型和對照組NSE比較差異無統(tǒng)計學意義(均P>0.05)，見表3。

表3各組血清NSE含量比較(ng/mL，χ±S)

Table 3Comparison of serum NSE levels among groups (ng/mL，χ±S)

組別例數(shù)(n)NSEFP危重型2127．10±6．52abc重型8919．43±6．10ab32．104<0．05普通型6911．20±3．22對照組3010．53±2．81

注：a與對照組比較P<0.05；b與普通型比較P<0.05；c與重型比較P<0.05。

2.4各組血清S-100蛋白水平比較

表4各組血清S-100含量比較(pg/mL，χ±S)

Table 4Comparison of the content of serum S-100β among groups(pg/mL，χ±S)

組別例數(shù)(n)S?100bFP危重型21730．14±42．19abc重型89420．11±32．27ab54．291<0．05普通型69314．20±45．58對照組30302．82±56．73

注：a與對照組比較P<0.05；b與普通型比較P<0.05；c與重型比較P<0.05。

3討論

3.1手足口病患兒心肌損傷及神經(jīng)系統(tǒng)累及的血清標志物研究背景

HFMD主要發(fā)生在5歲以下的兒童，潛伏期多為2～10天，平均3～5天，多數(shù)HFMD急性起病，發(fā)熱、口痛、厭食、口腔黏膜出現(xiàn)散在皰疹或潰瘍，位于舌、頰黏膜及硬額等處為多。嚴重的HFMD患兒在發(fā)病1～5天出現(xiàn)腦膜炎、腦炎(以腦干腦炎最為兇險)、腦脊髓炎、肺水腫、循環(huán)障礙等，少數(shù)病例病情危重，可致患兒死亡。HFMD導致的患兒腦部及心臟的損傷，是HFMD的主要病因。然而迄今為止臨床上對于HFMD發(fā)病早期的心臟及腦組織損傷的診斷缺乏有效依據(jù)，血清學Cox A16、EV 71等抗原檢測耗時較長，費用較高，多在HFMD發(fā)病6～7d以后才逐漸上升[7]，且Cox A16、EV 71等抗原水平檢測并不能提示HFMD腦組織及心肌細胞損傷程度[8-9]。LDH、α-HBDH、CK和CK-MB等是評估心肌細胞損傷的重要標志，在正常人群中由于心肌細胞膜完整而難以進入循環(huán)血中，而HFMD由于腸道病毒對于心肌及腦組織的損傷，進而導致細胞膜的破裂，細胞內的LDH、α-HBDH、CK和CK-MB釋放入血，導致外周血中的相關指標顯著上升。但迄今為止對于相關指標的研究僅僅限于心肌梗死患者，而對于HFMD患兒特別是年齡小于3歲的患者，相關心肌損傷指標的生物學標記作用研究不足；NSE主要存在于中樞神經(jīng)系統(tǒng)組織中，可以通過促進α-磷酸甘油轉化為磷酸烯醇丙酮酸，在神經(jīng)元細胞損傷后，細胞內的NSE透過血腦屏障進行循環(huán)血中，進而導致外周血中的NSE的上升[10-11]；S-100蛋白作為神經(jīng)元標志性酸性蛋白，主要存在于角質細胞和施萬細胞中，對于中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷具有重要的標志作用[12-13]，雖然相關研究探討了S-100及NSE在HFMD中的異常表達，但對于S-100和NSE與不同病情嚴重程度的HFMD的關系的探討不足。本次研究的創(chuàng)新性在于首次綜合性分析了5種肌損傷指標在HFMD中的表達，并通過患兒的皮膚黏膜損傷、心腦損傷等進行分級，進而進一步探討S-100和NSE對于早期評估心腦損傷的價值。

3.2心肌酶譜、肌鈣蛋白I等對于手足口病心臟損傷的評估價值

本次研究發(fā)現(xiàn)，LDH、α-HBDH、CK和CK-MB在HFMD患者體內明顯高于正常對照組，雖然上升的幅度不一，但多數(shù)指標可上升50%以上，其中LDH可上升至402.13±34.29IU/L，而CK-MB可上升至27.83±9.04IU/L，相關心肌細胞損傷指標的上升提示在HFMD發(fā)病早期通過檢測血清中LDH、α-HBDH等可以為早期診斷以及臨床干預提供參考。但有趣的是，雖然CTnI也作為心肌損傷指標，但在重型及危重型HFMD患者血清中顯著下降，其中危重型患兒的血清CTnI僅為0.11±0.02IU/L，明顯低于正常對照人群，這與Tan等[8]研究者報道的CTnI平均上升30%～45%數(shù)據(jù)不符，其主要考慮主要與危重患兒的損傷主要表現(xiàn)為神經(jīng)系統(tǒng)的受累，雖然心肌細胞存在一定的損傷，但鑒于本次研究中ELISA檢測患兒血清相關指標的時間在發(fā)病8h以后，半衰期較短，多數(shù)可能已經(jīng)腎臟的排泄和肝臟的代謝，故表現(xiàn)為CTnI的下降，但仍然需要進一步研究和探討。

3.3神經(jīng)元特異性烯醇化酶和S-100蛋白在評估手足口病患兒神經(jīng)系統(tǒng)損傷中的價值

NSE參與腦神經(jīng)元細胞的磷酸甘油的代謝，并對于神經(jīng)元損傷具有特異性的標志作用，本次研究中HFMD患兒的血清NSE明顯高于正常對照人群，且病情越重，患兒的血清NSE的表達越高，其中危重型和重型手足口病患兒NSE可達20ng/mL左右，表明NSE可以作為早期診斷HFMD的潛在指標，同時通過動態(tài)檢測血清NSE的表達能夠為評估HFMD的腦神經(jīng)元損傷程度提供參考。Isgro等[14]和陳迪等[15]學者通過分析了43例重型HFMD患兒的血清NSE資料，發(fā)現(xiàn)NSE可平均上升45%以上，且NSE大于25ng/mL時，患兒發(fā)生腦膜炎及腦干腦炎的幾率可上升5%以上，預后不佳。S-100蛋白是一種反映中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷的特異性物質，通過對于神經(jīng)元細胞膜上的磷脂羥基末端的修飾作用，進而參與神經(jīng)元細胞的相關生理性代謝，S-100蛋白的上升往往提示神經(jīng)元細胞膜的損傷，本次研究中危重型和重型HFMD患兒血清中的S-100均明顯高于正常對照人群，且危重組患兒的指標上升更為明顯，提示S-100蛋白是評估HFMD患兒腦組織損傷的重要指標，可以在一定程度上反映患兒的腦損傷程度。

3.4總結與展望

綜上所述，血清心肌酶及心肌肌鈣蛋白的檢測能盡早發(fā)現(xiàn)手足口病患兒心肌損害，從而有利于早期臨床干預進而改善預后，NSE和S-100蛋白在危重型和重型手足口病患兒中明顯增高，與病情的嚴重程度有關，臨床上通過檢測血清中的NSE或者S-100蛋白水平的表達，能夠為評估腦組織損傷提供參考。但需要注意的是本次研究中的CTnI表達下調與相關研究不符，希望后續(xù)研究可以在HFMD患兒發(fā)病后的不同時期進行檢測，進而進一步探討CTnI的診斷或者預后隨訪價值。

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