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    植入前遺傳學(xué)篩查中不同形態(tài)特征的胚胎整倍體率比較

    2018-03-31 06:07:44施文浩張四林王永博師娟子
    中國(guó)婦幼健康研究 2018年1期
    關(guān)鍵詞:整倍體卵裂囊胚

    施文浩,張四林,王永博,師娟子

    (西北婦女兒童醫(yī)院生殖中心,陜西 西安 710003)

    在自然生殖發(fā)育過(guò)程中,細(xì)胞分裂時(shí)期染色體不分離、減數(shù)分裂時(shí)期染色單體提早分離和染色體丟失引起胚胎染色體異常包括數(shù)量和結(jié)構(gòu)異常,數(shù)量異常更為常見(jiàn),主要表現(xiàn)為非整倍體。隨著胚胎體外培養(yǎng)研究的深入,發(fā)現(xiàn)人類(lèi)胚胎染色體非整倍體改變?cè)隗w外受精一胚胎移植中十分常見(jiàn)[1],是導(dǎo)致胚胎發(fā)育異常、著床失敗、自發(fā)流產(chǎn)、死產(chǎn)等妊娠失敗的主要原因[2]。植入前遺傳學(xué)篩查或診斷(preimplantation genetic screening/diagnosis,PGS/PGD),在胚胎植入著床之前,對(duì)早期胚胎進(jìn)行染色體數(shù)目和結(jié)構(gòu)異常的檢測(cè),挑選正常的胚胎植入子宮,以期獲得正常的妊娠,提高患者的臨床妊娠率,降低流產(chǎn)率預(yù)防出生缺陷。但是PGS的主要缺點(diǎn)是有創(chuàng),對(duì)胚胎后續(xù)發(fā)育有一定損傷[3],且遠(yuǎn)期損害仍不明確[4]。其次檢測(cè)費(fèi)用居高不下,對(duì)于植入前遺傳學(xué)篩查的廣泛應(yīng)用造成困難。已有研究發(fā)現(xiàn)染色體的整倍體性與胚胎形態(tài)學(xué)參數(shù)存在一定關(guān)系[5-6],因此有必要對(duì)預(yù)測(cè)整倍體的胚胎參數(shù)進(jìn)行研究,在無(wú)法進(jìn)行PGS時(shí)提供更有效的預(yù)測(cè)整倍體胚胎預(yù)測(cè)方法。本文從西北婦女兒童醫(yī)院生殖中心PGS活檢胚胎染色體結(jié)果分析,比較不同發(fā)育形態(tài)參數(shù)胚胎的整倍體和非整倍體率,研究胚胎發(fā)育形態(tài)學(xué)參數(shù)與整倍體的相關(guān)性。

    1資料與方法

    1.1研究對(duì)象與分組

    收集2015年1月1日至2017年4月30日西北婦女兒童醫(yī)院生殖中心行PGS的常規(guī)體外受精-胚胎移植患者,以其所檢測(cè)胚胎為研究對(duì)象。PGS檢測(cè)在西北婦女兒童醫(yī)院醫(yī)學(xué)遺傳中心完成,采用微陣列比較基因組學(xué)技術(shù)(BlueGnome 24SureV3)檢測(cè)。所有進(jìn)入臨床PGS周期的患者均簽署知情同意書(shū)。

    1.2方法

    1.2.1 體外受精胚胎培養(yǎng)及活檢

    采用常規(guī)的促排卵方案,當(dāng)優(yōu)勢(shì)卵泡中有1個(gè)直徑達(dá)到18mm(或者有1/3個(gè)卵泡達(dá)到18mm)時(shí)注射人絨毛膜促性腺激素(human chorionic gonadotrophin,hCG)10 000IU,36~38h后經(jīng)陰道超聲下取卵。取卵后4~6h常規(guī)卵胞漿內(nèi)單精子注射,然后采用序貫培養(yǎng)(vitrolife G-series)胚胎至第3天或第6天,活檢時(shí)間為受精后第3~6天,卵裂期胚胎在第3天進(jìn)行卵裂球活檢,活檢1枚卵裂球送檢;囊胚在受精后第5天或第6天活檢,活檢部分外胚層細(xì)胞(5~10個(gè))送檢。活檢后卵裂期胚胎或囊胚冷凍保存。

    1.2.2 卵裂期胚胎和囊胚的評(píng)分參數(shù)

    卵裂期評(píng)價(jià)為多個(gè)參數(shù)的綜合評(píng)價(jià),主要參數(shù)為D3天胚胎卵裂球數(shù)目、碎片體積比例和不均卵裂球數(shù)目。囊胚評(píng)價(jià)采用Garnder囊胚分級(jí)法。先根據(jù)囊胚的擴(kuò)張和孵出程度將囊胚分成1~6期,其中3期為完全擴(kuò)張囊胚,囊胚腔占據(jù)整個(gè)囊胚;4期為擴(kuò)張后囊胚,囊胚腔體積較早期囊胚明顯擴(kuò)大,透明帶變?。?期為正在孵化的囊胚,囊胚正在從透明帶破裂口孵出;6期為孵化出的囊胚,囊胚完全從透明帶中脫出。內(nèi)細(xì)胞團(tuán)和外胚層細(xì)胞評(píng)分根據(jù)細(xì)胞數(shù)目和緊湊程度評(píng)價(jià),A級(jí)為細(xì)胞數(shù)目多,結(jié)合緊密;B級(jí)為細(xì)胞數(shù)目較少,結(jié)合較松散;C級(jí)為細(xì)胞數(shù)目極少。

    1.2.3 PGS檢測(cè)

    活檢細(xì)胞采用單細(xì)胞基因組擴(kuò)增,采用SurePlex DNA Amplification System 試劑盒進(jìn)行全基因組擴(kuò)增,然后通過(guò)array-CGH方法(Blue Gnome 24SureV3 package kit)對(duì)擴(kuò)增后的產(chǎn)物進(jìn)行檢測(cè),BlueFuse Multi軟件分析并出具PGS報(bào)告。

    1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

    全部數(shù)據(jù)采用SPSS 6.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理,率的統(tǒng)計(jì)學(xué)檢驗(yàn)采用χ2檢驗(yàn),等級(jí)資料率的檢驗(yàn)采用秩和檢驗(yàn),計(jì)量資料采用t檢驗(yàn)或非參檢驗(yàn),P<0.05為有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

    2結(jié)果

    2.1基本數(shù)據(jù)

    PGS共活檢348枚胚胎,成功檢測(cè)322枚胚胎,其中整倍體胚胎數(shù)目為123(38.20%),非整倍體胚胎數(shù)目為199(61.80%),整倍體與非整倍體胚胎的基本數(shù)據(jù)詳見(jiàn)表1。其中PGS指征和男方正常精子形態(tài)率的整倍體與非整倍體率比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05),見(jiàn)表1。

    表1整倍體與非整倍體胚胎的基本數(shù)據(jù)[χ±S,n(%)]

    Table 1Basic data of aneuploid and aneuploid embryos[χ±S,n(%)]

    項(xiàng)目整倍體(n=123)非整倍體(n=199)t/χ2P母親年齡(歲)31.37±3.8032.23±5.09-0.930.35男方年齡(歲)33.20±4.6634.21±6.03-1.040.30不孕癥類(lèi)型0.640.43 原發(fā)32(26.02)60(30.15) 繼發(fā)91(73.98)139(69.85)女方基礎(chǔ)促卵泡素6.33±2.456.74±2.43-1.430.16PGS指征7.890.02 復(fù)發(fā)性流產(chǎn)及 反復(fù)種植失敗62(50.41)105(52.76) 不良孕產(chǎn)史24(19.51)18(9.05) 其他37(30.08)76(38.19) 基礎(chǔ)竇卵泡數(shù)(個(gè))13.80±5.8812.68±5.531.720.09 正常形態(tài)精子率(%)0.03±0.030.02±0.023.210.01

    注:嵌合體按非整倍體計(jì)算。

    2.2卵裂期胚胎參數(shù)與胚胎整倍體

    卵裂期胚胎評(píng)價(jià)參數(shù)采用D3天胚胎卵裂球數(shù)目、碎片體積比例和不均卵裂球數(shù)目,比較整倍體與非整倍體間胚胎參數(shù)的差異。碎片體積比例在整倍體與非整倍體組中具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05),D3天胚胎卵裂球數(shù)目和不均卵裂球數(shù)目未檢驗(yàn)出統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(均P>0.05),見(jiàn)表2。

    表2卵裂期胚胎整倍體與非整倍體的胚胎參數(shù)比較(χ±S)

    Table 2Comparison of embryo parameters between euploid and aneuploid in cleavage phase (χ±S)

    項(xiàng)目整倍體(n=9)非整倍體(n=52)t/ZPD3卵裂球數(shù)目8.00±0.877.56±1.36-1.130.26碎片體積比例0.03±0.040.08±0.06-2.600.01不均卵裂球數(shù)目0.56±0.530.41±0.540.740.46

    注:D3表示活檢時(shí)間為受精后第3天。

    2.3囊胚參數(shù)與胚胎整倍體

    囊胚評(píng)價(jià)參數(shù)采用活檢時(shí)間(D4~D5,D6)、囊胚擴(kuò)張期別(3期,4期,5~6期)、內(nèi)細(xì)胞團(tuán)形態(tài)(A/B,C)、外胚層形態(tài)(A/B,C),比較不同囊胚參數(shù)之間整倍體與非整倍體發(fā)生率的差異。活檢時(shí)囊胚擴(kuò)張期別在整倍體與非整倍體發(fā)生率具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05), 活檢時(shí)間(D4~D5,D6)、內(nèi)細(xì)胞團(tuán)形態(tài)(A/B,C)和外胚層形態(tài)(A/B,C)未檢驗(yàn)出統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(均P>0.05),見(jiàn)表3。

    表3囊胚參數(shù)的整倍體與非整倍體發(fā)生率比較[n(%)]

    Table 3 Comparison of the incidence of euploidy and aneuploidy in parameters of blastocyst[n(%)]

    項(xiàng)目整倍體(n=114)非整倍體(n=147)χ2P活檢時(shí)間 D4~D590(78.95)116(78.91)00.99 D624(21.05)31(21.09)活檢時(shí)的囊胚評(píng)分 擴(kuò)張期別  3期8(7.02)19(12.93)2.000.01  4期92(80.70)123(83.67)  5~6期14(12.28)5(3.40)內(nèi)細(xì)胞團(tuán)形態(tài) A/B65(57.02)84(57.14)00.98 C49(42.98)63(42.86)外胚層形態(tài) A/B21(18.42)37(25.17)1.690.19 C93(81.58)110(74.83)

    注:D4~6表示活檢時(shí)間為受精后第4~6天;囊胚評(píng)分采用Garden評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)。

    3討論

    3.1胚胎發(fā)育形態(tài)參數(shù)與非整倍體的相關(guān)性

    胚胎染色體的非整倍體與胚胎發(fā)育密切相關(guān),2011年Alfarawati研究顯示卵裂期胚胎中染色體非整倍體現(xiàn)象普遍存在,而形態(tài)評(píng)分較差的胚胎,其染色體非整倍體率高于形態(tài)較好胚胎。囊胚期胚胎形態(tài)也與染色非體整倍體可能相關(guān),2011年關(guān)小紅研究提示形態(tài)學(xué)評(píng)分較差的廢棄胚胎繼續(xù)培養(yǎng),其中大部分囊胚發(fā)育延緩且形態(tài)較差, 活檢PGS后染色體異常發(fā)生率相對(duì)較高。仍有研究提示囊胚內(nèi)細(xì)胞團(tuán)形態(tài)評(píng)分對(duì)整倍體囊胚移植后的持續(xù)臨床妊娠率有較高的預(yù)測(cè)價(jià)值[7]。因此胚胎染色體非整倍體體與胚胎形態(tài)可能存在一定的相關(guān)性。

    3.2卵裂期胚胎碎片和活檢時(shí)囊胚擴(kuò)張形態(tài)與非整倍體

    本研究結(jié)果顯示卵裂期胚胎評(píng)價(jià)參數(shù)中胚胎的碎片體積比例低的胚胎整倍體率較高,檢驗(yàn)出統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05),D 3天胚胎卵裂球數(shù)目和不均卵裂球數(shù)目未檢驗(yàn)出統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)。囊胚形態(tài)參數(shù)中活檢時(shí)的囊胚擴(kuò)張期別越高,整倍體率越高。由此推測(cè),早期胚胎卵裂期胚胎碎片少、囊胚發(fā)育較快的胚胎整倍體率可能較高。

    已有研究提示,卵裂期胚胎碎片比例較高的胚胎,檢測(cè)后發(fā)現(xiàn)染色體異常風(fēng)險(xiǎn)較高,如有研究報(bào)道碎片比例>35%的卵裂期胚胎形成的囊胚中,染色體異常率為70%~90%[8]。2001年Ebner發(fā)現(xiàn)碎片較高的胚胎移植后妊娠結(jié)局較差,胎兒畸形率較高,由此說(shuō)明胚胎的非整倍體和胚胎碎片比例有一定的相關(guān)性,碎片比例較高的胚胎染色體非整倍體風(fēng)險(xiǎn)較高。胚胎染色體異常與胚胎發(fā)育關(guān)系密切,有研究指出染色體異??蓪?dǎo)致不同階段胚胎發(fā)育停滯,延長(zhǎng)培養(yǎng)時(shí)間后染色體異常的胚胎可能出現(xiàn)發(fā)育停滯等,整倍體胚胎可能繼續(xù)發(fā)育,因此囊胚階段發(fā)育較快的囊胚的整倍體概率可能更高[9-10]。

    通過(guò)我院PGS患者的染色體結(jié)果分析得出,卵裂期胚胎評(píng)價(jià)參數(shù)中胚胎的碎片體積比例低的胚胎整倍體率較高,囊胚形態(tài)參數(shù)中活檢時(shí)的囊胚擴(kuò)張期別越高,整倍體率較高。因此早期胚胎卵裂期胚胎碎片少、囊胚發(fā)育較快的胚胎整倍體率較高。

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