混合效應(yīng)模型在玻璃體液推斷死亡時間中的應(yīng)用

楊明真，李輝軍，張?zhí)烊~ ，丁自嬌，吳士凡，邱鑫罡，劉 茜

（1.華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院法醫(yī)學(xué)系，湖北 武漢 430030；2.華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院附屬同濟(jì)醫(yī)院檢驗科，湖北 武漢 430030；3.上海市公安局物證鑒定中心 上海市現(xiàn)場物證重點(diǎn)實(shí)驗室，上海 200083）

死亡時間（postmortem interval，PMI）推斷對刑事死亡案件及自然死亡均具有重要的意義，是法醫(yī)學(xué)者面臨的最具挑戰(zhàn)性的問題之一[1]。在法醫(yī)學(xué)實(shí)踐中，PMI推斷受諸多因素的影響，在所有影響PMI推斷的因素中，以環(huán)境溫度的影響最大[2]。玻璃體液（vitreous humor，VH）用于推斷PMI研究已有50余年，很多學(xué)者應(yīng)用新方法檢測VH中各種物質(zhì)濃度，并建立了PMI的推導(dǎo)方程，使VH推斷PMI的研究不斷深入[2-6]。隨著生化檢測技術(shù)不斷發(fā)展，更多的擬合方法和數(shù)學(xué)模型用于PMI推斷，為解決PMI推斷中的難題提供了新思路。

本課題組早期證實(shí)了VH內(nèi)K+、Mg2+與PMI具有強(qiáng)相關(guān)性[7]，本研究就不同溫度條件影響PMI推斷的問題進(jìn)行觀察，在以VH中K+、Mg2+濃度和PMI為變量基礎(chǔ)上，引入環(huán)境溫度變量，應(yīng)用混合效應(yīng)模型的理論和方法，探討在一定外界環(huán)境溫度（5℃～35℃）內(nèi)，家兔眼VH中K+、Mg2+濃度的死后變化與 PMI的關(guān)系，建立一種可應(yīng)用于不同外界環(huán)境溫度條件下的PMI推斷方法。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗動物及分組

健康成年家兔58只（華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院實(shí)驗動物中心提供），雌雄不限，體質(zhì)量1 600～2 500 g，其中40只按隨機(jī)原則分為5℃、15℃、25℃、35℃四個實(shí)驗組，每組10只。家兔以耳緣靜脈空氣栓塞法處死，分別置于CTHI-100恒溫恒濕箱［施都凱儀器設(shè)備（上海）有限公司］5℃、15℃、25℃、35℃環(huán)境下，溫度波動度±1.0℃，濕度范圍25%～70%。其余18只按隨機(jī)原則分為10℃、20℃、30℃三個驗證組，每組6只，以上述方法處死后分別置于10℃、20℃、30℃的恒溫恒濕箱內(nèi)。

1.2 取樣

采用劉茜等[7]報道的雙眼交替微量取樣方法，對實(shí)驗組各組家兔進(jìn)行雙眼交替微量取樣，左眼于死后 0、24、48、72、96、120 h，右眼于死后 12、36、60、84、108h，分別取 VH 80～100μL。 驗證組于死后 20、40、65h分別取VH 80～100μL。舍棄渾濁或混有血液的樣本，合格樣本于微量離心管中-80℃保存，2周內(nèi)檢測。高溫環(huán)境（25℃、35℃）下，因腐敗速度快，取材僅持續(xù)至死后72h。

1.3 樣本檢測與統(tǒng)計分析

室溫解凍后，取60μL樣本于檢測瓶內(nèi)，按V樣本∶V去離子水=1∶4 對樣本進(jìn)行稀釋，應(yīng)用 Cobas?c701 羅氏生化免疫分析儀［羅氏診斷產(chǎn)品（上海）有限公司］檢測實(shí)驗組VH中K+、Mg2+的濃度。所有數(shù)據(jù)以±s表示，觀察K+、Mg2+濃度的變化趨勢。應(yīng)用SAS 9.3軟件進(jìn)行混合效應(yīng)模型的數(shù)值分析，并以PMI為自變量x，溫度為自變量y，各離子濃度為因變量f（x，y）擬合方程。檢驗水準(zhǔn)α=0.0001。

1.4 驗證組驗證

將各驗證組VH中K+、Mg2+檢測值分別帶入相應(yīng)方程內(nèi)，應(yīng)用Excel 2010計算PMI值。將推測的PMI值與實(shí)際值相減得到殘差，計算同一時間點(diǎn)上的6個殘差絕對值的均值得到各時間點(diǎn)的平均偏離時間。平均偏離時間與對應(yīng)的PMI相比得到各時間點(diǎn)推測的平均偏離率。

2 結(jié) 果

2.1 樣本檢測結(jié)果

各組K+、Mg2+濃度隨PMI延長呈上升趨勢，各組K+濃度檢測值見表1，Mg2+濃度檢測值見表2。由于高溫（25℃和35℃）條件下，玻璃體腐敗加快，至72h后已無法提取VH。

2.2 混合效應(yīng)模型擬合結(jié)果

經(jīng)混合效應(yīng)模型擬合后，K+、Mg2+濃度的固定效應(yīng)參數(shù)估計與比較及三種固定效應(yīng)假設(shè)檢驗的結(jié)果見表3～4。

表1 不同溫度下家兔VH中K+濃度檢測結(jié)果 （±s，mmol/L）

表1 不同溫度下家兔VH中K+濃度檢測結(jié)果 （±s，mmol/L）

注：“-”為缺失值

PMI/h 5℃（n=10） 15℃（n=10） 25℃（n=10） 35℃（n=10）0 9.39±0.44 9.49±0.26 9.55±0.42 9.38±0.18 12 10.91±0.92 10.81±0.65 17.03±1.06 20.77±0.84 24 14.12±0.99 16.14±0.84 27.99±1.41 37.37±2.08 36 17.47±0.93 19.53±0.95 36.34±2.53 44.13±1.92 48 19.33±1.40 26.05±1.29 44.65±1.71 52.41±2.46 60 22.14±0.89 30.07±0.70 46.61±2.68 58.52±2.42 72 24.20±0.92 33.64±0.67 46.33±2.09 60.48±1.36 84 25.98±0.99 34.03±1.24 - -96 27.90±1.34 38.00±1.72 - -108 29.14±1.20 38.15±1.50 - -120 28.34±1.57 40.55±1.79 - -

表2 不同溫度下家兔VH中Mg2+濃度檢測結(jié)果 （±s，mmol/L）

表2 不同溫度下家兔VH中Mg2+濃度檢測結(jié)果 （±s，mmol/L）

注：“-”為缺失值

?

表3 固定效應(yīng)的參數(shù)估計與比較

表4 三種固定效應(yīng)的檢驗結(jié)果

由表3可知，K+、Mg2+濃度的處理效應(yīng) PMI和溫度均具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.0001）。由表4可知，K+不同溫度之間的區(qū)別有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.000 1），PMI、PMI×T及 PMI×PMI的交互作用有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.0001）；Mg2+不同溫度之間的區(qū)別有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.000 1），PMI×T、PMI×PMI的交互效應(yīng)無意義，因此在模型擬合時未進(jìn)行相應(yīng)的交互擬合。經(jīng)模型擬合后得到以PMI為自變量x，溫度為自變量y，各離子濃度為因變量 f（x，y）的方程。 K+濃度的擬合方程為：

Mg2+濃度的擬合方程為：

2.3 驗證組驗證結(jié)果

將驗證組溫度和VH中K+、Mg2+濃度檢測值分別帶入相應(yīng)方程內(nèi)，計算PMI值、平均偏離時間和平均偏率（表5）。 PMI為 0～40h 時，K+、Mg2+濃度推斷 PMI的偏離時間均在 10 h以內(nèi)；PMI為 40～65 h時，K+、Mg2+濃度推斷PMI的偏離時間在21h以內(nèi)。

表5 混合效應(yīng)模型擬合方程推斷PMI的預(yù)測平均偏離率 （n=6）

3 討 論

VH位于眼球后部的玻璃體內(nèi)，玻璃體由于其特殊的解剖位置，與其他組織相對隔離，又受周圍眼眶的保護(hù)，因此不易受到破壞，VH相對血液、腦脊液、心包積液、滑膜液等其他體液具有死后變化緩慢且規(guī)律性較強(qiáng)，在死亡早期以及后期均受污染較少等特點(diǎn)，因此一直是法醫(yī)病理學(xué)用于PMI推斷研究和死后化學(xué)物質(zhì)分析的研究熱點(diǎn)[8]。

VH中物質(zhì)濃度的死后變化受多種內(nèi)因及外因的影響，其中環(huán)境溫度的影響最顯著[9]。SCHONING等[10]研究發(fā)現(xiàn)，狗眼VH內(nèi)K+濃度隨溫度的上升及PMI的延長而增加，鈉、氯、尿素氮在4℃環(huán)境下的48 h內(nèi)保持穩(wěn)定，在20℃、37℃環(huán)境下難以穩(wěn)定。MCLAUGHLIN 等[8]在 4℃、20℃、37℃溫度條件下研究120頭牛和120頭豬血清和眼VH，發(fā)現(xiàn)K+和P的濃度隨PMI延長和溫度的上升而增加。王偉平等[11]檢測家兔死后在不同的環(huán)境溫度下VH膽堿酯酶和谷草轉(zhuǎn)氨酶的失活情況，結(jié)果表明，兩種酶的活性改變在一定時間內(nèi)各出現(xiàn)一個平臺期，平臺期后兩種酶的活性迅速下降，低溫度組在死后54h后幾乎為零，而在高溫度組48h后就已經(jīng)幾乎為零。ZILG等[12]報道，尸體所在的環(huán)境溫度對死后VH內(nèi)K+濃度的影響占5%。ROGNUM等[13]證實(shí)，VH內(nèi)K+、HX濃度推斷PMI的擬合曲線隨溫度的增加其斜率增加。陶濤等[14]認(rèn)為，Mg2+濃度隨PMI的延長而升高。龔志強(qiáng)等[15]認(rèn)為，48 h內(nèi)Mg2+濃度與PMI相關(guān)性強(qiáng)，隨PMI的延長而逐漸升高，可用于48h內(nèi)的PMI推斷。劉茜等[7]應(yīng)用雙眼交替微量取樣法研究家兔VH內(nèi)Mg2+濃度的變化，發(fā)現(xiàn)家兔死后眼VH中Mg2+濃度變化與時間呈強(qiáng)相關(guān)性，并隨時間延長而升高。

以往運(yùn)用VH中離子濃度變化推斷PMI的研究[7，15-18]多考慮VH離子濃度死后變化和PMI兩種變量，并在此基礎(chǔ)上推導(dǎo)出線性回歸方程、二元二次或多次方程，而未考慮外界環(huán)境溫度的影響，因此在實(shí)際應(yīng)用中有很大的局限性?；旌闲?yīng)模型，即所擬合的模型中既包含固定效應(yīng)又包含隨機(jī)效應(yīng)，固定效應(yīng)類似于標(biāo)準(zhǔn)回歸系數(shù)，可直接估計得到，隨機(jī)效應(yīng)不是直接估計，而是來自方差和協(xié)方差估計。此模型可用于重復(fù)測量數(shù)據(jù)，即對同一個觀察對象在不同時間點(diǎn)上進(jìn)行的多次測量。由于重復(fù)測量數(shù)據(jù)是對同一對象的重復(fù)觀測，同一受試者的觀察數(shù)據(jù)間可能存在相關(guān)性，一些傳統(tǒng)的統(tǒng)計學(xué)方法難以充分揭示這一內(nèi)在特點(diǎn)。混合效應(yīng)模型既考慮了觀察對象在不同觀察時間點(diǎn)的內(nèi)在聯(lián)系，又考慮了觀察值間的內(nèi)部相關(guān)性，其擬合方程更為可靠。本研究即對某一觀察指標(biāo)進(jìn)行重復(fù)觀察，以VH物質(zhì)濃度為因變量，溫度及PMI為固定效應(yīng)進(jìn)行模型擬合，所得結(jié)果證實(shí)，外界環(huán)境溫度對物質(zhì)的死后變化具有較大的影響作用，各溫度組K+、Mg2+濃度隨PMI延長均呈上升趨勢，與以上各研究[7，15-18]保持一致性，但各個溫度下的變化趨勢明顯不同，低溫組變化平緩，而高溫組變化劇烈，說明僅以物質(zhì)的死后變化與PMI的關(guān)系，而不考慮外界環(huán)境溫度的影響進(jìn)行PMI推斷，結(jié)果會存在相當(dāng)大的誤差。

本研究驗證結(jié)果顯示，K+、Mg2+濃度推斷PMI的效果均較好，混合效應(yīng)模型可應(yīng)用于PMI的推斷。在PMI為 0～40 h 時，K+、Mg2+濃度推斷 PMI的偏離時間均在 10h 以內(nèi)；當(dāng) PMI為 40～65h 時，K+、Mg2+濃度推斷PMI的偏離時間在21h以內(nèi)。由于本研究中高溫度（25℃、35℃）腐敗較快，取材僅持續(xù)到72h，雖最終不影響數(shù)據(jù)擬合的完成，但擬合精度會有所下降，對后期驗證有一定的局限性，因此在聯(lián)合溫度進(jìn)行分析時，應(yīng)合理選取研究時限，同時縮短取樣時間間隔，增加溫度分組，獲得更多數(shù)據(jù)，以提高擬合方程的精度。

[1]PASSOS M L，SANTOS A M，PEREIRA A I， et al.Estimation of postmortem interval by hypoxanthine and potassium evaluation in vitreous humor with a sequential injection system[J].Talanta，2009，79（4）：1094-1099.

[2]HENSSGE C，MADEA B.Estimation of the time since death in the early post-mortem period[J].Forensic Sci Int，2004，144（2-3）：167-175.

[3]STURNER W Q，GANTNER G J.The postmortem interval.A study of potassium in the vitreous humor[J].Am J Clin Pathol，1964，42：137-144.

[4]ZILG B，BERNARD S，ALKASS K，et al.A new model for the estimation of time of death from vitreous potassium levels corrected for age and temperature[J].Forensic Sci Int，2015，254：158-166.

[5]ROGNUM T O， HOLMEN S， MUSSE M A， et al.Estimation of time since death by vitreous humor hypoxanthine，potassium，and ambient temperature[J].Forensic Sci Int，2016，262：160-165.

[6]韓順琪，秦志強(qiáng)，鄧愷飛，等.尸體化學(xué)的研究進(jìn)展[J].法醫(yī)學(xué)雜志，2015，31（4）：287-292.

[7]劉茜，武盛國，汪嵐，等.雙眼交替微量取樣檢測兔玻璃體液鉀鎂離子濃度推測死亡時間[J].中國法醫(yī)學(xué)雜志，2007，22（1）：32-34，38.

[8]MCLAUGHLIN P S，MCLAUGHLIN B G.Chemical analysis of bovine and porcine vitreous humors：correlation of normal values with serum chemical values and changes with time and temperature[J].Am J Vet Res，1987，48（3）：467-473.

[9]HEN?GE C，MADEA B.Estimation of the time since death in the early post-mortem period[J].Forensic Sci Int，2004，144（2）：167-175.

[10]SCHONING P，STRAFUSS A C.Postmortem biochemical changes in canine vitreous humor[J].J Forensic Sci，1980，25（1）：53-59.

[11]王偉平，龍仁，劉承良，等.家兔玻璃體液CHE、AST活性變化與PMI的相關(guān)性研究[J].美國中華臨床醫(yī)學(xué)雜志，2004，6（1）：61-63.

[12]ZILG B，BERNARD S，ALKASS K，et al.A new model for the estimation of time of death from vitreous potassium levels corrected for age and temperature[J].Forensic Sci Int，2015，254：158-166.

[13]ROGNUM T O， HOLMEN S， MUSSE M A， et al.Estimation of time since death by vitreous humor hypoxanthine，potassium，and ambient temperature[J].Forensic Sci Int，2016，262：160-165.

[14]陶濤，胥勁，羅通行，等.人體死后不同時間玻璃體液化學(xué)成分的變化趨勢[J].四川大學(xué)學(xué)報（醫(yī)學(xué)版），2006，37（6）：898-900，927.

[15]龔志強(qiáng)，曾憲斌，孫躍剛，等.家兔眼玻璃體液21種元素含量與 PMI關(guān)系的研究[J].法醫(yī)學(xué)雜志，2002，18（2）：67-69.

[16]CHAUDHARY B， MEEL V，TIRPUDE B.Potassium concentration in vitreous humor in relation to time since death[J].Journal of Forensic Medicine and Toxicology，2007，24（1）：26-30.

[17]MADEA B， KREUSER C， BANASCHAK S.Postmortem biochemical examination of synovial fluid--a preliminary study[J].Forensic Sci Int，2001，118（1）：29-35.

[18]JASHNANI K D，KALE S A，RUPANI A B.Vitreous humor：biochemical constituents in estimation of postmortem interval[J].J Forensic Sci，2010，55（6）：1523-1527.