皮膚切創(chuàng)愈合過程中FoxO1表達與損傷時間關系

陳 揚 ，季心怡 ，范琰琰 ，喻林升

（1.溫州醫(yī)科大學法醫(yī)學系，浙江 溫州 325035；2.溫州醫(yī)科大學司法鑒定中心，浙江 溫州 325035；3.溫州醫(yī)科大學司法鑒定科學技術研究所，浙江 溫州 325035）

損傷時間準確推斷能為判斷案情提供線索和依據(jù)，一直是法醫(yī)學界研究的重要課題。傳統(tǒng)的損傷時間推斷方法主要是肉眼觀察和組織學檢查。近年來，為了更精確地推斷損傷時間，尋找與損傷經(jīng)歷時間具有良好相關性的指標成為法醫(yī)學研究的熱點，方法主要有運用免疫組織化學或Western印跡法檢測創(chuàng)口中蛋白質的表達水平、采用逆轉錄聚合酶鏈反應或原位雜交技術對創(chuàng)口中基因水平進行研究等。

皮膚創(chuàng)口愈合是一個多細胞、多分子參與的復雜過程，可分為炎癥、增殖和再塑三個階段。在炎癥階段，中性粒細胞和單核細胞浸潤至創(chuàng)口，產(chǎn)生活性氧及氧化應激[1-2]，并釋放促炎細胞因子。此后，成纖維細胞開始大量增殖并分化為肌成纖維細胞，產(chǎn)生膠原纖維沉積于創(chuàng)口內(nèi)，與新生的毛細血管構成肉芽組織，最終經(jīng)過改建和再塑轉變?yōu)轳：劢M織。同時，表皮細胞增生覆蓋創(chuàng)口，使創(chuàng)口愈合。在皮膚創(chuàng)口愈合期間，大量細胞因子和轉錄因子參與其中。

叉頭框（forkhead box，F(xiàn)ox）蛋白家族[3-4]是一類DNA結合區(qū)具有翼狀螺旋結構的轉錄因子，來源于果蠅的“叉頭”突變，于1990年首次發(fā)現(xiàn)，至今已發(fā)現(xiàn)了90多種Fox基因，2000年被統(tǒng)一命名為轉錄因子家族，廣泛存在于從酵母到哺乳類的真核生物中。Fox含17個亞家族，其中FoxO家族研究最為深入，F(xiàn)oxO1是FoxO亞家族中的主要成員之一。研究[5-9]證實，F(xiàn)oxO1在炎癥、氧化應激、血管發(fā)生及成纖維細胞分化等過程中發(fā)揮重要作用，可能與皮膚創(chuàng)口愈合的進程密切相關。本研究應用免疫組織化學染色技術和Western印跡法，檢測皮膚切創(chuàng)后不同時間段FoxO1的表達及其時間規(guī)律性，旨在探討FoxO1在皮膚損傷時間推斷中的應用價值。

1 材料與方法

1.1 動物模型制作及分組

成年C57BL/KsJ雄性小鼠45只（溫州醫(yī)科大學實驗動物中心提供），體質量25～30 g，隨機分為對照組和創(chuàng)傷形成后 6 h、12 h、1 d、3 d、5 d、7 d、10 d、14 d組，每組5只。創(chuàng)傷組小鼠在腹腔注射戊巴比妥鈉麻醉后，背部皮膚剪毛處理，于背部中央做一長1cm的皮膚全層縱向切口后進行分籠飼養(yǎng)。分別于創(chuàng)口形成后 6h、12 h、1 d、3 d、5 d、7d、10d、14 d，將創(chuàng)傷組小鼠吸入乙醚麻醉后，脫頸椎處死，并以創(chuàng)口為中心，取創(chuàng)口及周邊處1.5cm×2.0cm大小的皮膚。對照組小鼠脫頸椎處死后，在與創(chuàng)傷組小鼠取材的相同部位取同等大小的皮膚樣本。

1.2 HE染色

每組樣本皮膚的1/2放入4%多聚甲醛溶液中固定12h，梯度乙醇脫水，透明，石蠟包埋，制成5μm厚的連續(xù)石蠟切片，將切片常規(guī)脫蠟及水化后采用蘇木素伊紅染液染色制成病理切片。光學顯微鏡下觀察。

1.3 免疫組織化學染色

石蠟切片常規(guī)脫蠟及水化：（1）石蠟切片放置在60℃恒溫箱中烘烤 120min。（2）依次按二甲苯（20min）、二甲苯（20min）、無水乙醇（10min）、95%乙醇（10min）、90%乙醇（10 min）、80%乙醇（10 min）脫蠟和水化，微波熱修復法修復抗原。兔抗小鼠FoxO1單抗1∶100（2880，美國Cell Signaling Technology公司）作為一抗，按照ZLI-9018免疫組織化學染色試劑盒（北京中杉金橋生物技術有限）說明書進行操作。在正置顯微鏡（日本Nikon公司）下觀察，每張切片在創(chuàng)口周邊區(qū)隨機選擇10個視野，采用ImageJ2x軟件（美國National Institute of Health）計數(shù)細胞總數(shù)及FoxO1陽性細胞數(shù)，并計算陽性細胞率。

1.4 Western印跡法檢測

冰浴上將各時間段剩余的1/2皮膚樣本剪碎，加蛋白裂解液（78833，美國Thermo Fisher Scientific公司）300 μL及苯甲基磺酰氟（上海碧云天生物技術有限公司）勻漿，超聲破碎，4℃下，以離心半徑10cm，12000r/min，離心 30min，吸取上清液，用 Lowry法測量蛋白濃度，將樣品置于-80℃保存，備用。變性5 min，進行10%十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE）分離蛋白后，將蛋白轉印到聚偏二氟乙烯膜（polyvinylidene fluoride，PVDF；德國Merck公司）上，轉膜條件為5V 40min。含有聚山梨酯的三羥甲基氨基甲烷緩沖鹽-吐溫20（tris buffered saline with tween-20，TBST）洗滌 3次，用 5%脫脂牛奶封閉 2 h，用兔抗小鼠 FoxO1單抗（1∶1 000）孵育，4℃過夜。TBST洗滌3次，羊抗兔IgG二抗（1∶2000）（中國北京中杉金橋生物技術有限公司）室溫孵育2 h，TBST洗滌3次后，增強型化學發(fā)光（enhanced chemiluminescent，ECL）法顯色。 用 ImageJ2x 軟件分析各時間段條帶的光密度值，以甘油醛-3-磷酸脫氫 酶 （glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH）作為內(nèi)參，計算各組FoxO1蛋白表達的相對水平。

1.5 統(tǒng)計分析

2 結 果

2.1 HE染色

中性粒細胞于傷后6h出現(xiàn)在創(chuàng)口周圍，傷后12h顯著增多；傷后1 d，單核細胞聚集于創(chuàng)口的邊緣，其數(shù)量于傷后3d增多，同時成纖維細胞也開始出現(xiàn)在創(chuàng)口底部，傷后5 d增多，傷后7 d其數(shù)量達到高峰；傷后5～10d，肉芽組織形成，其內(nèi)可見大量的新生血管和成纖維細胞；傷后10d，表皮完全覆蓋創(chuàng)口；傷后14 d，損傷區(qū)新生血管和成纖維細胞數(shù)量顯著減少，間質增多，肉芽組織向瘢痕組織轉變（圖1）。

圖1 切創(chuàng)后皮膚組織HE染色結果（×400）

2.2 免疫組織化學染色

對照組皮膚，F(xiàn)oxO1弱表達于表皮、毛囊、皮脂腺、血管內(nèi)皮及真皮中少數(shù)的成纖維細胞。創(chuàng)傷組皮膚，傷后6 h可見浸潤的中性粒細胞表達FoxO1，傷后12 h表達FoxO1的中性粒細胞顯著增多，此后表達FoxO1的中性粒細胞顯著減少。傷后6～12h亦可見少量浸潤的單核細胞表達FoxO1，傷后1～3 d表達FoxO1的單核細胞顯著增多，從傷后5d起表達FoxO1的單核細胞逐漸減少，傷后14 d的創(chuàng)口中僅可見少量FoxO1陽性的單核細胞。傷后3d可見創(chuàng)口邊緣及底部有少量的成纖維細胞表達FoxO1，傷后5 d表達FoxO1的成纖維細胞顯著增多，于傷后7d達到峰值，傷后10～14d表達FoxO1的成纖維細胞顯著減少。傷后5～10d亦可見新生血管內(nèi)皮表達FoxO1，于傷后7d達到峰值（圖2）。

2.3 免疫組織化學染色陽性細胞率分析

FoxO1免疫組織化學染色在對照組和創(chuàng)傷組中的陽性細胞率見表1。FoxO1的陽性細胞率（包括中性粒細胞、單核細胞及成纖維細胞）于傷后7 d達到峰值。

2.4 Western印跡法檢測分析

以GAPDH（相對分子質量約為34 000）為內(nèi)參，對照組及各創(chuàng)傷組均有FoxO1陽性條帶，位于80000處。創(chuàng)傷后各時間段FoxO1表達強度有一定規(guī)律，傷后6 h表達開始增強，傷后12 h出現(xiàn)第一個表達高峰，傷后1～5d稍有下降，傷后7d FoxO1表達再次達到峰值，隨后表達逐漸降低，至傷后14d略高于對照組。各組FoxO1蛋白表達的相對水平見表2和圖3。

圖2 切創(chuàng)后皮膚組織免疫組織化學染色結果

表1 小鼠皮膚切創(chuàng)后對照組和創(chuàng)傷組的細胞總數(shù)及FoxO1陽性細胞率 （n=5，±s）

表1 小鼠皮膚切創(chuàng)后對照組和創(chuàng)傷組的細胞總數(shù)及FoxO1陽性細胞率 （n=5，±s）

注：1）與相鄰上組比較，P＜0.05

組別 細胞總數(shù) FoxO1陽性細胞率/% 出現(xiàn)的主要炎癥細胞對照 39.20±3.50 6.14±1.50 中性粒細胞6h 120.40±4.501） 21.55±1.211） 中性粒細胞12h 172.00±9.601） 30.34±2.561） 單核細胞1d 141.00±7.301） 34.66±3.381） 單核細胞3d 115.40±2.101） 37.87±3.131） 單核細胞、成纖維細胞5d 123.60±4.301） 41.20±5.171） 單核細胞、成纖維細胞7d 189.60±3.901） 52.56±6.361） 成纖維細胞10d 211.00±4.601） 21.36±3.201） 成纖維細胞14d 182.80±6.701） 7.40±3.341） 成纖維細胞

表2 FoxO1蛋白在對照組和創(chuàng)傷組中的相對表達量（n=5，±s）

表2 FoxO1蛋白在對照組和創(chuàng)傷組中的相對表達量（n=5，±s）

注：1）與相鄰上組比較，P＜0.05

組別 相對表達量對照 0.44±0.03 6h 2.26±0.091）12h 2.46±0.101）1d 1.05±0.041）3d 1.28±0.101）5d 1.59±0.091）7d 5.27±0.121）10d 1.53±0.061）14d 0.53±0.041）

圖3 對照組和創(chuàng)傷組皮膚組織FoxO1蛋白的表達

3 討 論

皮膚創(chuàng)口形成時間推斷在法醫(yī)學研究中一直是重點與難點。皮膚損傷愈合是一個復雜的組織修復過程，包括氧化應激、炎癥、血管發(fā)生、成纖維細胞增殖與分化、肉芽組織形成和纖維組織重建等，在該過程中有大量細胞因子和轉錄因子參與[10-11]。

FoxO蛋白家族是一類在動物的生長發(fā)育、細胞分化、代謝等方面起著重要作用的轉錄調節(jié)因子[4]。其中FoxO1是FoxO家族中最早發(fā)現(xiàn)的成員，F(xiàn)oxO1蛋白包含4個結構域，依次為N端的forkhead區(qū)域（此區(qū)域同時也是DNA結合域）、核定位信號肽、核輸出序列和C端富含脯氨酸和絲（蘇）氨酸的轉錄激活域[12]。研究[5-9]證實，F(xiàn)oxO1在氧化應激、炎癥、血管發(fā)生及成纖維細胞分化等過程中發(fā)揮重要作用。

HE染色顯示皮膚創(chuàng)口正常愈合。免疫組織化學染色結果顯示，和對照組小鼠相比，傷后6～12h創(chuàng)口周邊區(qū)表皮及皮膚附件FoxO1表達增強，此外可見浸潤的中性粒細胞表達FoxO1，提示FoxO1可能參與皮膚損傷后氧化應激反應的調控。研究[13-14]表明，在創(chuàng)口愈合過程中，浸潤的中性粒細胞可產(chǎn)生活性氧，與氧化應激反應密切相關?？寡趸割惖谋磉_也在創(chuàng)傷后有所增加，在創(chuàng)口的多個部位尤其是創(chuàng)緣表皮及毛囊周圍，超氧化物歧化酶、谷胱甘肽過氧化物酶mRNA水平明顯升高[15-16]。PONUGOTI等[7]研究發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)oxO1可以調節(jié)谷胱甘肽過氧化物酶-2的表達，保護角質細胞免受氧化應激損傷，這說明FoxO1的表達增強可起到抗氧化應激的作用。因此，傷后6～12h創(chuàng)口周邊區(qū)表皮及皮膚附件FoxO1表達增強可能與抗氧化應激反應密切相關。此外，在傷后1～3d的創(chuàng)口FoxO1以單核細胞陽性表達為主，提示FoxO1可能參與炎癥反應的調控。研究[5]顯示，F(xiàn)oxO1在巨噬細胞中的過表達可抑制其促炎介質的釋放，表明FoxO1的表達可對炎癥反應起到負向調節(jié)作用。本研究發(fā)現(xiàn)，傷后5～10d FoxO1在新生血管內(nèi)皮及成纖維細胞呈現(xiàn)廣泛的表達，提示FoxO1可能參與皮膚創(chuàng)口愈合中的血管發(fā)生及成纖維細胞分化事件。ROUDIER等[8]研究表明，F(xiàn)oxO1可以調節(jié)內(nèi)皮細胞凝血酶敏感蛋白-1的表達抑制血管發(fā)生。VIVAR等[9]研究發(fā)現(xiàn)，轉化生長因子-β1可以刺激成纖維細胞表達FoxO1，誘導成纖維細胞分化為肌成纖維細胞。最新研究[17]顯示，F(xiàn)oxO1介導了角質細胞對皮膚創(chuàng)口愈合的調節(jié)作用，敲除FoxO1后創(chuàng)口愈合能力受損，抑制了創(chuàng)口愈合期間的成纖維細胞增殖、肌成纖維細胞形成及膠原產(chǎn)生，這表明FoxO1可以通過調節(jié)成纖維細胞的增殖與分化促進皮膚創(chuàng)口的愈合。

為了明確FoxO1蛋白表達的時序性變化，本實驗通過Western印跡法檢測了在皮膚切創(chuàng)后各時間段的FoxO1蛋白相對水平。結果顯示，對照組及各創(chuàng)傷組均有FoxO1陽性條帶，損傷后FoxO1表達有其時間規(guī)律性，傷后6h表達開始增強，傷后12 h出現(xiàn)第一個表達高峰，傷后1～5d稍有下降，傷后7d FoxO1表達再次達到峰值，隨后表達逐漸降低，至傷后14d略高于對照組。免疫組織化學結果表明，在對照組皮膚，F(xiàn)oxO1弱表達于表皮、毛囊、皮脂腺、血管內(nèi)皮及真皮中少數(shù)的成纖維細胞。傷后12h創(chuàng)口有較多中性粒細胞表達FoxO1，此外創(chuàng)口周邊區(qū)表皮及皮膚附件FoxO1表達顯著增強。因此，中性粒細胞、表皮及皮膚附件表達FoxO1形成了傷后12h的表達峰值。傷后1～5 d，雖然創(chuàng)口中有較多單核細胞表達FoxO1，但FoxO1在表皮及皮膚附件中的表達強度減弱，因此FoxO1表達的整體水平有所下降。傷后7d是成纖維細胞增殖、分化及血管發(fā)生的高峰階段，創(chuàng)口中有大量的成纖維細胞及新生血管內(nèi)皮表達FoxO1，此外亦可見較多單核細胞表達FoxO1，因此傷后7 d FoxO1表達再次達到峰值。傷后14d表達FoxO1的成纖維細胞和新生血管內(nèi)皮細胞顯著減少，故FoxO1表達回落到略高于正常對照組的水平。

在以往推斷皮膚創(chuàng)口形成時間的研究[18]中，創(chuàng)口愈合相關性蛋白的表達峰值多在損傷1d后，且多呈單峰式變化趨勢。本研究Western印跡法結果顯示，F(xiàn)oxO1蛋白在創(chuàng)口愈合期間出現(xiàn)兩個表達峰值，于傷后6h表達開始增強，傷后12h出現(xiàn)第一個表達高峰，傷后7d再次達到峰值，提示FoxO1表達可同時為早晚期損傷時間的推斷提供參考。尤其在傷后6h，創(chuàng)口中浸潤的炎癥細胞較少，用傳統(tǒng)的組織學檢查難以準確地推斷損傷時間，F(xiàn)oxO1的表達情況可用于參考。Western印跡法檢測僅較精確地反映出表達的整體水平，但FoxO1在兩個表達峰值前后的一些時間點的整體水平差異較小，故FoxO1用于創(chuàng)口形成時間推斷時需同時結合Western印跡法、免疫組織化學檢測及組織學特征進行綜合評判，以縮小推斷的誤差。此外，對創(chuàng)口中FoxO1的表達是否受到死后變化的影響，將是我們進一步研究的目標。

本研究證實，F(xiàn)oxO1在皮膚創(chuàng)口中不同類型細胞呈現(xiàn)廣泛的表達，提示其密切參與了皮膚損傷愈合的進程。皮膚損傷后FoxO1蛋白水平的時序性變化可望作為一種檢測指標用于皮膚損傷時間的推斷。

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