bFGF在兔口腔潰瘍模型中的表達

陳琪　羅程　陳紅　蘇松　付文廣　謝鑫　鄭思琳

口腔潰瘍(oral ulcer)在黏膜疾病中占據(jù)首位，不論性別、年齡、人種均可發(fā)生，是術(shù)后、腫瘤等患者的常見并發(fā)癥。疼痛具有反復(fù)性、灼痛感等特征，阻礙進食、睡眠，從而導(dǎo)致營養(yǎng)不良、抵抗力下降，嚴重影響患者的生存質(zhì)量[1-2]。目前的治療方法有針灸、冷敷、光子照射等，治療藥物多種，但目前沒有療效明確的治療方法與藥物[3]。而基因治療是目前尚未廣泛應(yīng)用又極具前景的治療方式。所以，我們嘗試從相關(guān)基因入手，堿性成纖維細胞生長因子(basic fibroblast growth factor, bFGF)一種促進細胞生長的多肽生長因子，具有修復(fù)完善骨組織、血管、神經(jīng)的作用，能夠刺激內(nèi)皮細胞增殖和新生血管的生成。那么它在潰瘍組織中是如何表達呢?目前尚無明確的研究，因此，本項目擬研究在口腔潰瘍兔口腔頰黏膜組織中bFGF的表達情況，嘗試為口腔潰瘍治療提供新的思路。

1　材料與方法

1.1　動物

新西蘭兔72 只， SPF級， 體重3 000～3 500 g，雌雄各半，購于瀘州醫(yī)學(xué)院實驗動物中心，許可證號：SYXK(川)2013-065。

1.2　藥品

口腔潰瘍散(北京同仁堂股份有限公司同仁堂制藥廠生產(chǎn))， 3 g/瓶(國藥準字Z11020184, 產(chǎn)品批號： 15100065)。涂于潰瘍處, 2 次/d, 療程7 d。

1.3　試劑與儀器

Rabbit anti-bFGF、 羊抗兔二抗(CST公司， 美國)； SP kit、DAB kit、First Strand cDNA Synthesis Kit(Roche公司， 瑞士)； 病理切片機、紫外凝膠系統(tǒng)、紫外分光光度計(Bio-rad公司， 美國)。

1.4　方法

1.4.1兔口腔潰瘍動物模型制備新西蘭大白兔隨機分為3 組，每組24 只：正常黏膜組(對照組)，不做任何處理；口腔潰瘍模型黏膜組(模型組)，用直徑為8 mm的玻棒蘸取濃度為40%的冰醋酸置于兔左右兩側(cè)距口角2 mm頰膜處燒灼60 s，生理鹽水沖洗1 min，使局部成灰白色，直徑8 mm的白色損害， 24 h后經(jīng)病理檢查證實兔口腔潰瘍動物模型建立成功[3]?？谇粷兡Ｐ椭委熃M(治療組)，造模成功后，每天給予口腔潰瘍散涂抹， 2 次/d, 療程7 d。觀察動物的精神狀態(tài)、飲食狀況及皮毛的變化等一般情況。在第3、 5、 7 天取各組口腔頰黏膜組織，每組各取6 只。

1.4.2實驗步驟 取各組口腔頰黏膜組織： ①HE染色切片檢測組織的炎癥細胞、血管數(shù)目，上皮增生情況； ②RT-PCR檢測口腔頰部黏膜組織中bFGF基因mRNA表達情況，Quantity One軟件計算比較RT-PCR產(chǎn)物條帶與β-actin條帶的吸光度的相對比值，通過分析，最終得出相對表達量； ③石蠟切片后，用免疫組織化學(xué)法檢測口腔頰黏膜bFGF的平均積吸光度值。采用計算機圖像分析技術(shù)對免疫組化結(jié)果進行半定量分析。通過ImaGe-pro-plus圖像系統(tǒng)半定量測定bFGF的表達，蛋白表達在胞漿，呈棕黃色顆粒。每張切片隨機取10 個互不重疊的視野(×400)測定積分吸光度值(integral optical density, IOD)和面積累加值(Area)，IOD/Area得到平均吸光度值，結(jié)果以平均吸光度值表示。

1.4.3觀察指標bFGF在兔口腔潰瘍頰黏膜組織中的表達情況。

1.5　統(tǒng)計學(xué)處理

2　結(jié)　果

2.1　兔一般情況

造模組大鼠冰醋酸燒灼后，逐漸出現(xiàn)進食量下降，部分體質(zhì)量與正常對照組相比明顯偏低。對照組大鼠生長較好，未出現(xiàn)死亡病例。24 h后經(jīng)病理檢查證實已建立兔口腔潰瘍模型(圖 1)。造模成功當天，黏膜上皮破損或糜爛，大量炎細胞浸潤。治療組用藥3 d后,炎細胞浸潤開始減輕,壞死組織減少,邊緣纖維細胞增生;用藥5 d后炎癥細胞明顯減少,無壞死組織,大量成纖維細胞增生;用藥7 d后形成癒痕組織。模型組僅在7 d后有愈合的趨向。

圖 1口腔黏膜HE染色圖片(×400)

Fig 1HE staining of oral mucos(×400)

2.2　RT-PCR檢測結(jié)果

造模成功當天， bFGF mRNA在正常黏膜組中少量表達(0.34±0.03)，與模型組(0.60±0.06)、治療組(0.60±0.06)比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，模型組與治療組比較，差異沒有統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。在用藥的第3、 5、 7 天， 模型組、治療組中bFGF mRNA的表達水平逐漸升高，治療組高于模型組，且差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)(圖 2， 表 1)。

圖 2口腔黏膜bFGF mRNA表達

Fig 2The expression of bFGF mRNA in oral mucosa

注： ①P<0.05vs對照組; ②P<0.05vs模型組， ③ 采用兩因素方差分析對各組和各時間點進行分析，差異有統(tǒng)計學(xué)意義后，再通過Duncan檢驗進行兩兩比較

2.3　IHC結(jié)果

光學(xué)高倍(×400)物鏡下: bFGF在正?？谇粷凁つさ纳掀雍驼嫫映嗜醣磉_或不表達，陽性表達在胞質(zhì)。

bFGF在正常黏膜組中少量表達0.01±0.00，模型組第1 天的表達為0.02±0.01， 2 組比較，其差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。模型組與治療組比較，差異沒有統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。在用藥的第3、 5、 7天， 模型組、 治療組中bFGF的表達水平逐漸升高，模型組bFGF的蛋白表達量低于治療組(P<0.01)，且差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)(圖 3， 表 2)。

圖 3各組bFGF蛋白表達(免疫組化， ×400)

Fig 3The expression of bFGF protein in the groups(Immunohistochemistry×400)

注： ①P<0.05vs對照組; ②P<0.05vs模型組; ③ 采用兩因素方差分析對各組和各時間點進行分析，差異有統(tǒng)計學(xué)意義后，再通過Duncan檢驗進行兩兩比較

3　討　論

口腔潰瘍(oral ulcer，OU)俗稱“口瘡”，是一種常見的發(fā)生于口腔黏膜的潰瘍性損傷病癥，多見于唇內(nèi)側(cè)、舌頭、舌腹、頰黏膜、前庭溝、軟腭等部位，這些部位的黏膜缺乏角質(zhì)化層或角化較差。可分為輕型復(fù)發(fā)性阿弗他潰瘍和慢性口腔潰瘍。不論性別、年齡、人種均可發(fā)生，發(fā)病時疼痛劇烈，很難根治[4]。目前口腔潰瘍的病因及發(fā)病機制尚不完全清楚，經(jīng)研究認為其發(fā)病原因有多種，如環(huán)境因素、遺傳因素、心理因素、病毒感染、機體免疫等[5-6]，多合并多種因素。由于口腔潰瘍產(chǎn)生的因素較多，目前的治療存在各種困難[7]。

就目前而言，基因治療是一種尚未廣泛應(yīng)用又極具前景的治療方案，可能對口腔潰瘍的治療產(chǎn)生革命性的變化，而bFGF是調(diào)控細胞生長、分化、凋亡和機體多種組織和器官形成的重要因子。在皮膚損傷、創(chuàng)面愈合中起著重要作用[8]。那么bFGF是否能促進口腔潰瘍創(chuàng)面的愈合呢？因此，bFGF進入了我們的思考范圍并引導(dǎo)設(shè)計了上述的對比試驗，以期能發(fā)現(xiàn)一些與口腔潰瘍相關(guān)的變化。

在創(chuàng)傷愈合過程中，血管再生是一個重要的環(huán)節(jié)，細胞生長因子對這一過程的發(fā)生和發(fā)展具有重要的調(diào)節(jié)作用。bFGF是一種促進細胞生長較強的多肽生長因子，不僅能夠刺激內(nèi)皮細胞增殖和新生血管的生成，還能促進膠原蛋白的合成，肉芽組織的生成，改變免疫應(yīng)答[9]。Mullane 等[10]發(fā)現(xiàn)bFGF通過增加牙髓中的微血管密度，從而促進牙髓損傷的修復(fù)。Takamiya 等[11]研究銳器對皮膚損傷后，皮膚組織中出現(xiàn)bFGF蛋白表達，bFGF表達開始于損傷后0.5～1 h。 bFGF分布于體內(nèi)多種細胞，以自分泌和旁分泌方式促進細胞自身與周圍細胞的增殖、分化、蛋白質(zhì)合成等[9]，是最有效的促血管生長因子之一[12]； 如果bFGF的數(shù)量異常、功能紊亂，則可能會出現(xiàn)組織、血管、神經(jīng)的修復(fù)、再生障礙，創(chuàng)面愈合受到抑制，而bFGF的存在，可能是口腔潰瘍愈合的原因之一，所以bFGF的表達是我們關(guān)注的重點。

在本試驗中觀察發(fā)現(xiàn)，通過40%的冰醋酸燒灼兔口腔頰部成功建立兔口腔潰瘍模型，并且在實驗中通過使用RT-PCR、免疫組織化學(xué)等方法進行檢測，從而證實口腔潰瘍兔的潰瘍組織中bFGF出現(xiàn)了明顯的變化，治療組較模型組有明顯的增多，隨著創(chuàng)面的不斷愈合，表達在不斷升高，說明bFGF參與了口腔潰瘍創(chuàng)面的愈合過程。由此初步考慮如果bFGF的表達增加，從而促進組織、血管、神經(jīng)等的修復(fù)和再生，而潰瘍形成當天，bFGF的表達最低，機體處于損傷狀態(tài)； 如果bFGF的表達持續(xù)低下，潰瘍創(chuàng)面則得不到恢復(fù)。目前所用治療口腔潰瘍的藥物存在種類繁多、治療效果不佳、副作用大等缺點，尚無通過基因治療口腔潰瘍的藥物。因此，bFGF基因表達變化的發(fā)現(xiàn)，可能為基礎(chǔ)研究和臨床治療口腔潰瘍提供新的藥物治療靶點[13]，找到一種新的治療手段和方向。

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