氦氖激光對退變顳下頜關(guān)節(jié)髁突軟骨基質(zhì)與基質(zhì)調(diào)節(jié)因子表達的影響

毛凱平　鄒璟　李解　姜夢雅　高桃珍　黃國付

顳下頜關(guān)節(jié)骨關(guān)節(jié)病(temporomandibular joint osteoarthrosis, TMJOA)是顳下頜關(guān)節(jié)組織發(fā)生磨損與變形，在關(guān)節(jié)表面形成新骨的非炎癥性骨關(guān)節(jié)病。顳下頜關(guān)節(jié)結(jié)構(gòu)與功能復(fù)雜，加之人的一生中型不斷發(fā)生改變，顳下頜關(guān)節(jié)經(jīng)歷了復(fù)雜的改建過程，以致其發(fā)病率高達30%，嚴(yán)重影響患者的生活質(zhì)量[1]。

研究證實，細胞外基質(zhì)(extracellular matrix，ECM)成分改變是關(guān)節(jié)軟骨退行性改變的重要原因，顳下頜骨關(guān)節(jié)病的發(fā)生即為髁突軟骨細胞所控制的ECM合成、分解代謝失衡所致[2]。氦氖激光是臨床治療TMJOA的常用手段之一，但其作用機制尚不完全清楚，本文通過研究氦氖激光對退變顳下頜關(guān)節(jié)細胞外基質(zhì)膠原2(Col-2)、蛋白多糖4(PRG4)和基質(zhì)調(diào)節(jié)因子基質(zhì)金屬蛋白酶-13(matrix metalloproteinase-13, MMP-13)、基質(zhì)金屬蛋白酶-1組織抑制因子(tissue-inhibitor of matrix metalloproteinase-1, TIMP-1)、骨形態(tài)發(fā)生蛋白-2(bone morphogenetic protein-2, BMP-2)表達的影響，以期明確氦氖激光對顳下頜關(guān)節(jié)退變的保護作用與機制。

1　資料與方法

1.1　動物與分組

健康成年雄性新西蘭大白兔40 只，月齡5～6 月，體重2～2.5 kg，無牙頜畸形，由武漢大學(xué)實驗動物中心提供(合格證號： 42000500002225)，在標(biāo)準(zhǔn)條件下(武漢市第一醫(yī)院中心實驗室)適應(yīng)性飼養(yǎng)3 周后開始實驗，實驗過程中的程序經(jīng)過了武漢市第一醫(yī)院實驗動物倫理委員會審批。所有動物進行編號，查隨機數(shù)字表分為4 小組。每組10 只，分為2 個時間點，即造模后1、 11 d，每個時間點各5 只。

①正常組(control,n=10)：自然飼養(yǎng)，不作任何治療; ②模型組(TMJOA，n=10)：模型，不作任何治療; ③假模型組(sham,n=10)：同模型組，但不切除關(guān)節(jié)盤，不作任何治療; ④治療組(HNL,n=10)：于造模后第1 天開始氦氖激光治療，連續(xù)治療10 d。

1.2　造模方法

參照常嘉等[3]的造模方法，建立單側(cè)顳下頜關(guān)節(jié)骨關(guān)節(jié)病動物模型。于耳緣靜脈注射1 mg/kg的2.5 g/L的戊巴比妥鈉。無菌條件下自右側(cè)眼外眥外側(cè)5 mm處至外耳道方向行2 cm長的皮膚切口，分離皮下組織，暴露關(guān)節(jié)囊。水平切開關(guān)節(jié)囊，切開關(guān)節(jié)盤的外側(cè)附著，將下頜升支推向外側(cè)以充分暴露髁突關(guān)節(jié)面與關(guān)節(jié)盤。將關(guān)節(jié)盤前外1/2部分切除。無菌生理鹽水充分沖洗后將剩余關(guān)節(jié)盤復(fù)位，分層縫合關(guān)節(jié)囊、皮下組織和皮膚。假模型組僅作關(guān)節(jié)囊切開后即縫合組織。術(shù)后不限制動物的下頜運動，飼養(yǎng)顆粒性常規(guī)兔飼料，單籠飼養(yǎng)。連續(xù)肌肉注射青霉素3 d，4 萬單位/d。于術(shù)后1 個月行顳下頜關(guān)節(jié)CT檢查，出現(xiàn)典型的TMJOA改變即進行后續(xù)實驗，未出現(xiàn)TMJOA改變的動物予以剔除。

1.3　治療方法

上海產(chǎn)MDC-500半導(dǎo)體激光治療儀(MDC-500)，劑量參照Suri 等[4]運用激光治療顳下頜關(guān)節(jié)紊亂病的參數(shù)，輸出氦氖激光波長632.8 nm，功率10 mW，激光光針光斑直徑2 mm。按照《實驗針灸學(xué)》[5]及《動物針灸學(xué)》[6]教材進行動物穴位定位，取患側(cè)頰車、上關(guān)、下關(guān)、聽宮、翳風(fēng)，光針緊貼皮膚并與之垂直，每穴照射5 min，共治療10 d。

1.4　取材及Western Blot檢測

在造模后第1 天，將各組10 只新西蘭兔予以麻醉后行CT檢查模型是否成功，出現(xiàn)OA改變的動物予以納入模型組和治療組，每組5 只，待蘇醒后繼續(xù)氦氖激光治療10 d，模型未成功予以剔除后補充。在第1、11 天各取5 只，將實驗動物以過量注射麻醉藥方法處死，取各組髁突軟骨，一部分放入4%多聚甲醛供HE染色，一部分直接凍存于-80 ℃冰箱待檢測。

取出軟骨后，迅速稱重，然后將組織放入裝有液氮的研缽中，利用研磨法將軟骨磨成粉末狀，收集到 1.5 ml的 EP 管中，在冰上裂解組織 30 min，離心 15 min，取上清，測定蛋白濃度。Western Blot方法進行檢測Col-2、PRG-4、MMP-13、TIMP-1、BMP-2蛋白表達量：按蛋白分子量配制10%的PAGE膠電泳，根據(jù)預(yù)染marker顯示，充分分離目的蛋白，取出凝膠用蒸餾水沖洗，剪與PAGE凝膠相同大小的PVDF膜和濾紙，PVDF膜用甲醇浸泡數(shù)秒后和濾紙一同浸泡于電轉(zhuǎn)緩沖液中。然后用含5% 脫脂奶粉的TBST(封閉液)浸泡PVDF膜，室溫搖床封閉2 h。再加入一抗孵育，TBST充分洗滌PVDF膜5～6 次，用封閉液稀釋相應(yīng)的HRP標(biāo)記二抗(1∶40 000)，使PVDF膜浸泡于二抗孵育液中，顯色曝光。BandScan凝膠圖像分析軟件分析膠片灰度值。

1.5　統(tǒng)計學(xué)分析

2　結(jié)　果

2.1　模型兔顳下頜關(guān)節(jié)CT表現(xiàn)

本研究采用了成年新西蘭大白兔作為實驗對象，手術(shù)切除部分關(guān)節(jié)盤制造TMJOA模型。模型兔于術(shù)后1 月行三維CT檢查，患側(cè)下頜關(guān)節(jié)盤出現(xiàn)缺損，形態(tài)改變，骨質(zhì)表面粗糙, CT平掃可見骨贅及關(guān)節(jié)結(jié)節(jié)形成，骨質(zhì)增生明顯(圖 1)。

2.2　髁突軟骨HE染色

正常髁突軟骨分為纖維層、增殖層、過渡層及軟骨層，HE染色發(fā)現(xiàn)假模型組與正常組基本無變化，退變髁突軟骨纖維層可見纖維降解，紅染減弱，細胞數(shù)量較正常減少，纖維層與軟骨層之間距離變小，細胞核出現(xiàn)皺縮，核濃染，另外一些細胞甚至核仁的完全消失，軟骨陷窩增大，留下白色細胞影態(tài)。經(jīng)過氦氖激光治療10 d后的軟骨髁突較模型組相比，纖維層輕度松解，部分纖維合成，紅染增強(圖 2)。

2.3　氦氖激光治療對細胞外基質(zhì)和基質(zhì)調(diào)節(jié)因子表達的影響

Western blot檢測顯示，正常組及假模型組不同時間點之間Col-2、PRG-4、MMP-13、TIMP-1、BMP-2蛋白表達差異無統(tǒng)計學(xué)意義；造模成功后第1 天時間點，模型組與治療組MMP-13表達均明顯升高，Col-2、PRG-4、TIMP-1、BMP-2表達均明顯降低，與正常組和假模型組比較，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義；模型組第11 天各基質(zhì)調(diào)節(jié)因子與第1 天表達無統(tǒng)計學(xué)差異；治療組第11 天與第1 天比較，MMP-13表達均明顯降低，Col-2、PRG-4、TIMP-1、BMP-2表達均明顯升高，且與模型組相比，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(圖 3～4)。

A: 模型組健側(cè)(左側(cè)); B: 模型組TMJOA患側(cè)(右側(cè))； C： CT平掃，黃色箭頭為健側(cè)(左側(cè))，藍色箭頭為患側(cè)(右側(cè))

圖 1TMJ 3D-CT圖示

A： Left side as the contral; B: Right side with TMJOA; C: Plain scan CT image, yellow arrow: The contral(left), blue arrow: Right side with TMJOA

Fig 13D-CT manifestations of the TMJ

圖 2兔髁突軟骨(HE，×200)

Fig 2Histomorphology of the TMJ cartilage(HE, ×200)

圖 3各組COL-2、PRG-4蛋白表達量(*: 與正常組及假模型組相比,P<0.05, 與模型組第11 天相比, #P<0.05)

Fig 3COL-2 and PRG-4 protein expression in the groups(*: Compared with the normal group and the sham model group,P<0.05; #: Compared with the 11 d time point in the model group,P<0.05)

圖 4各組MMP-13、TIMP-1、BMP-2蛋白表達量(*: 與正常組及假模型組相比,P<0.05; #: 與正常組、假模型組及模型組第11 天相比,P<0.05)

Fig 4MMP-13， TIMP-1， BMP-2 protein expression in the groups(*: Compared with the normal group and the sham model group,P<0.05; #: Compared with the 11 d time point in the normal group， the sham model group and the model group,P<0.05)

3　討　論

盡管顳下頜骨關(guān)節(jié)病的機制尚未完全闡明，但髁突軟骨細胞對基質(zhì)合成與分解代謝調(diào)控的失衡被認為是其主要病理環(huán)節(jié)。文獻證實，髁突軟骨細胞是關(guān)節(jié)軟骨基質(zhì)成分的惟一來源，顳下頜骨關(guān)節(jié)病的發(fā)生即為髁突軟骨細胞所控制的合成、分解代謝失衡所致，其主要特征為關(guān)節(jié)軟骨細胞外基質(zhì)成分的進行性降解，同時伴隨著繼發(fā)性炎癥因子的釋放及其相關(guān)效應(yīng)[2]。

臨床觀察表明，氦氖激光對顳下頜骨關(guān)節(jié)病具有良好的治療作用[7]，已有研究顯示，氦氖激光光針釋放出的激光光子能量被病態(tài)的生物分子吸收后，可改變病態(tài)生物分子內(nèi)能，這種改變相當(dāng)于一種刺激源，可直接或間接興奮神經(jīng)、肌肉和腺體，同時， 可使鉀離子致解反應(yīng)時間顯著延長，使五羥色胺物質(zhì)明顯降低，激活內(nèi)源性嗎啡樣鎮(zhèn)痛物質(zhì)，延長感覺神經(jīng)潛伏時間，整合中樞神經(jīng)的痛覺信號，從而達到鎮(zhèn)痛效果，并通過促進新生血管的形成改善顳下頜關(guān)節(jié)患者局部血液循環(huán)，通過抑制固有炎癥介質(zhì)PGE的合成及直接抗炎作用，降低炎癥反應(yīng)[8]。

正常的髁突軟骨中含有大量含水的細胞外基質(zhì)，這些細胞外基質(zhì)的主要成分是Col-2以及少部分其他類型的膠原。Col-2是髁突軟骨的主要結(jié)構(gòu)成分，是形成細胞外軟骨生物機械的重要支架，是膠原分子相互作用的關(guān)鍵，為軟骨分化的主要特異性蛋白[9]。PRG-4是一種蛋白多糖，是關(guān)節(jié)液的重要組成部分，可介導(dǎo)邊界潤滑[10-12]，緩沖過大的關(guān)節(jié)負荷，降低盤突間的摩擦力，保護和修復(fù)軟骨。關(guān)節(jié)軟骨沒有神經(jīng)和血管，主要依靠關(guān)節(jié)液內(nèi)PRG-4等蛋白的分泌維持自身的組織液動態(tài)平衡和自身營養(yǎng)，所以任何影響關(guān)節(jié)液分泌的因素都可能直接影響關(guān)節(jié)軟骨的代謝。

MMP-13廣泛存在于骨關(guān)節(jié)炎患者的關(guān)節(jié)軟骨和滑膜中，被認為是細胞外基質(zhì)分解代謝酶，是裂解Ⅱ型膠原作用最強的酶，主要降解Ⅱ型膠原為3/4和1/4片斷[13-14]。TIMP是MMPs的特異性生理抑制劑，同時也是抗分解代謝酶，能夠特異性抑制MMPs的活性，避免軟骨基質(zhì)裂解。TIMP-1與MMP-13之間動態(tài)的相互作用，在基質(zhì)穩(wěn)定的維持中發(fā)揮重要作用[15]。BMP-2作為細胞外基質(zhì)合成代謝酶，不僅可促進軟骨細胞的增殖與分化以及細胞外基質(zhì)的合成[16-17]，還促進退變軟骨中細胞的再生和合成代謝活動[18]；不僅參與正常顳下頜關(guān)節(jié)髁突的生長發(fā)育，而且對髁突適應(yīng)性改建甚至損傷發(fā)揮重要作用[19]，這使其在骨關(guān)節(jié)病的臨床治療中具有極大的潛在應(yīng)用價值[20-21]。

本研究發(fā)現(xiàn)，退變的顳下頜關(guān)節(jié)組織中，細胞外基質(zhì)Col-2、PRG-4和基質(zhì)調(diào)節(jié)因子TIMP-1、BMP-2蛋白表達較正常顳下頜關(guān)節(jié)明顯降低，而基質(zhì)調(diào)節(jié)因子MMP-13明顯升高，證實了細胞外基質(zhì)Col-2、PRG-4和基質(zhì)調(diào)節(jié)因子TIMP-1、BMP-2蛋白表達的下降以及MMP-13蛋白表達升高是顳下頜關(guān)節(jié)骨關(guān)節(jié)病的重要機制之一。正常組與假模型組之間二者的表達無顯著性差異，說明未切除關(guān)節(jié)盤的顳下頜關(guān)節(jié)模型無明顯的退變。在治療組中選用氦氖激光照射患側(cè)頰車、上關(guān)、下關(guān)、聽宮、翳風(fēng)穴10 d后，顳下頜關(guān)節(jié)組織中Col-2、PRG-4和基質(zhì)調(diào)節(jié)因子TIMP-1、BMP-2蛋白表達明顯增加，基質(zhì)調(diào)節(jié)因子MMP-13蛋白表達下降，表明氦氖激光治療可上調(diào)退變顳下頜關(guān)節(jié)細胞外基質(zhì)Col-2、PRG-4和基質(zhì)調(diào)節(jié)因子TIMP-1、BMP-2蛋白表達，下調(diào)基質(zhì)調(diào)節(jié)因子MMP-13表達，從而減少細胞外基質(zhì)降解，增加其合成，糾正細胞外基質(zhì)降解和合成之間的失衡，進而防治顳下頜關(guān)節(jié)骨關(guān)節(jié)病。本研究為臨床運用氦氖激光治療TMJOA提供了一定的理論依據(jù)，但氦氖激光影響相關(guān)蛋白表達的具體機制仍需進一步研究。

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