CMIP與MDM2在肝細(xì)胞性肝癌中的表達(dá)及其臨床意義

王 樾，吳文涌，吳正升，周 鄭，余昌俊，孟翔凌

肝細(xì)胞性肝癌(hepatocellular carcinoma，HCC)是原發(fā)性肝癌的主要類型，在我國(guó)HCC是位居第二的癌癥“殺手”[1]。至今HCC的治療尚無(wú)突破性進(jìn)展，因此研究其發(fā)生、發(fā)展機(jī)制，對(duì)HCC的治療有著重要意義。腫瘤細(xì)胞的無(wú)限生長(zhǎng)是腫瘤細(xì)胞凋亡受抑制的結(jié)果，凋亡障礙同腫瘤的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)[2]。c-maf誘導(dǎo)蛋白(c-maf inducing protein，CMIP)基因作為近年來(lái)新發(fā)現(xiàn)的一種重要的多功能細(xì)胞因子，通過(guò)多種途徑促進(jìn)細(xì)胞凋亡，CMIP是否參與了人體惡性腫瘤的發(fā)生、發(fā)展，尤其是在HCC中CMIP的表達(dá)研究，國(guó)內(nèi)外尚未見(jiàn)文獻(xiàn)報(bào)道。小鼠雙微體基因(murine double minute 2，MDM2)是一種原癌基因，可抑制野生型p53對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)的抑制作用及誘導(dǎo)凋亡的能力[3]，在腫瘤的發(fā)生過(guò)程中起重要作用。研究[4-5]表明CMIP和MDM2均參與細(xì)胞凋亡過(guò)程，但是這兩種基因在HCC發(fā)生、發(fā)展過(guò)程中是否通過(guò)凋亡相關(guān)通路發(fā)揮相互作用未見(jiàn)報(bào)道，因此該研究應(yīng)用免疫組化法從蛋白水平探討兩種基因在HCC發(fā)生、發(fā)展中的作用，并討論兩蛋白之間相關(guān)性，為研究HCC的發(fā)生、發(fā)展機(jī)制提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1病例資料收集安徽醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院2011年11月～2013年12月手術(shù)切除經(jīng)病理證實(shí)的、臨床病理資料完整的HCC組織存檔蠟塊115例及其相應(yīng)癌旁正常肝組織(距癌組織邊緣2 cm以上)98例。其中男98例，女17例，年齡27～80(54.02±10.42)歲；腫瘤直徑≤5 cm 61例，>5 cm 54例；乙肝表面抗原(hepatitis B surface antigen，HBsAg)陰性19例，陽(yáng)性96例；有脈管浸潤(rùn)32例，無(wú)脈管浸潤(rùn)83例；甲胎蛋白(alpha-fetoprotein，AFP)≤400 ng/ml 43例，>400 ng/ml 72例；有肝臟被膜侵犯13例，無(wú)肝臟被膜侵犯102例。按照國(guó)際抗癌聯(lián)盟(UICC，2010年)原發(fā)性HCC TNM分期標(biāo)準(zhǔn)[6]進(jìn)行分期：Ⅰ期53例，Ⅱ期24例，Ⅲ期35例，Ⅳ期3例。病理分級(jí)采用Edmondson分級(jí)法：Ⅰ～Ⅱ級(jí)75例，Ⅲ～Ⅳ級(jí)40例。所有患者術(shù)前未接受過(guò)化療、放療或生物治療等干預(yù)措施。所有標(biāo)本均經(jīng)10%福爾馬林液固定，石蠟包埋，4 μm厚連續(xù)切片，分別做HE染色和免疫組化染色。染色結(jié)果由2名經(jīng)驗(yàn)豐富的病理科醫(yī)師采用雙盲原則評(píng)定。

1.2主要試劑和儀器兔抗人CMIP(12851-1-AP)多克隆抗體(即用型)購(gòu)自美國(guó)Proteintech Group公司，工作滴度1 ∶200；鼠抗人MDM2(SMP-14)多克隆抗體(即用型)購(gòu)自美國(guó)Santa Cruz公司，工作滴度1 ∶100；即用型快速免疫組化MaxVisionTM檢測(cè)試劑盒(KIT-5020)購(gòu)自福州邁新公司；DAB(ZLI-9018)顯色劑購(gòu)自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司；Olympus CX22生物顯微鏡購(gòu)自日本Olympus公司。

1.3實(shí)驗(yàn)方法免疫組化染色前常規(guī)HE染色，用于病理診斷、分型、分級(jí)。免疫組化染色采用EnVision法。主要步驟如下：4 μm厚的石蠟切片65 ℃烤片，常規(guī)脫蠟水化后，經(jīng)檸檬酸鈉緩沖液高壓加熱抗原修復(fù)，用3% H2O2作用10 min以除去內(nèi)源性過(guò)氧化物酶。一抗工作液4 ℃過(guò)夜孵育，滴加生物素標(biāo)記的二抗工作液，37 ℃干燥箱孵育30 min，DAB顯色劑顯色，蘇木精復(fù)染，常規(guī)脫水，透明，封片。光鏡下觀察染色情況，用已知的陽(yáng)性標(biāo)本作為陽(yáng)性對(duì)照，PBS代替一抗作陰性對(duì)照。

1.4結(jié)果判斷CMIP和MDM2蛋白免疫組化均以細(xì)胞質(zhì)內(nèi)出現(xiàn)明顯的棕黃色顆粒為陽(yáng)性，進(jìn)行陽(yáng)性細(xì)胞計(jì)數(shù)，每張切片隨機(jī)選擇5個(gè)不重疊高倍視野(×400)，每個(gè)視野計(jì)數(shù)100個(gè)以上細(xì)胞，將染色強(qiáng)度和陽(yáng)性細(xì)胞百分比結(jié)合判斷CMIP和MDM2蛋白免疫組化結(jié)果。結(jié)果判斷采用半定量積分法：首先將著色強(qiáng)度打分：0分，細(xì)胞無(wú)著色；1分，細(xì)胞著色為淺黃色；2分，細(xì)胞著色為棕黃色；3分，細(xì)胞著色為棕褐色；染色強(qiáng)度需與背景著色相對(duì)比。再按陽(yáng)性細(xì)胞所占百分比打分：0分，陰性；1分，陽(yáng)性細(xì)胞≤10%；2分，陽(yáng)性細(xì)胞11%～50%；3分，陽(yáng)性細(xì)胞51%～ 75%；4分，陽(yáng)性細(xì)胞>75%。據(jù)著色強(qiáng)度分值與陽(yáng)性細(xì)胞百分比分值乘積結(jié)果分為4個(gè)等級(jí)：“-”：0～2分；“+”：3～4分；“”：6～8分；“”：9～12分，≥6分為免疫反應(yīng)陽(yáng)性。

1.5統(tǒng)計(jì)學(xué)處理實(shí)驗(yàn)結(jié)果使用SPSS 16.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。計(jì)數(shù)資料采用χ2檢驗(yàn)，指標(biāo)間的相關(guān)性分析采用Pearson相關(guān)分析。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1CMIP和MDM2蛋白在HCC及癌旁組織中的表達(dá)CMIP蛋白顆粒定位于細(xì)胞質(zhì)，呈棕黃色顆粒狀，陽(yáng)性細(xì)胞呈片狀分布，見(jiàn)圖1。98例癌旁組織中CMIP蛋白全部陽(yáng)性表達(dá)，其中62例癌旁組織染色結(jié)果為()；115例HCC組織中CMIP蛋白的陽(yáng)性表達(dá)率為57.39%(66/115)，其中()53例，()13例。MDM2蛋白陽(yáng)性染色表現(xiàn)為細(xì)胞質(zhì)呈現(xiàn)棕黃色顆粒，片狀分布，MDM2蛋白在HCC和癌旁組織中陽(yáng)性率分別為57.39%(66/115)和12.24%(12/98)。CMIP和MDM2蛋白在HCC和癌旁組織中的表達(dá)均存在顯著性差異(P<0.001)，見(jiàn)表1。

2.2CMIP和MDM2蛋白在HCC中的表達(dá)與相關(guān)臨床病理參數(shù)的關(guān)系CMIP蛋白表達(dá)與HCC腫瘤大小顯著相關(guān)(P<0.01)，與性別、年齡、HBsAg狀況、有無(wú)脈管浸潤(rùn)、AFP水平、有無(wú)肝臟被膜侵犯、組織學(xué)分級(jí)、TNM分期均無(wú)關(guān)；HCC中MDM2蛋白的表達(dá)與患者的性別、年齡、腫瘤大小、HBsAg狀況、有無(wú)脈管浸潤(rùn)、AFP水平、有無(wú)肝臟被膜侵犯、組織學(xué)分級(jí)、TNM分期均無(wú)相關(guān)性，見(jiàn)表2。

2.3HCC組織中CMIP和MDM2表達(dá)的相關(guān)性分析在CMIP陽(yáng)性表達(dá)的66例HCC標(biāo)本中MDM2的陰性表達(dá)為30例；而在CMIP陰性表達(dá)的49例標(biāo)本中MDM2的陽(yáng)性表達(dá)為30例，Pearson相關(guān)分析顯示HCC中CMIP與MDM2蛋白表達(dá)無(wú)明顯相關(guān)性(r=-0.067，P=0.478)。

圖1 HCC及癌旁組織中CMIP和MDM2蛋白的表達(dá)

A：CMIP在HCC中陰性表達(dá)；B：CMIP在癌旁組織中的陽(yáng)性表達(dá)；C：MDM2在HCC中陽(yáng)性表達(dá)；D：MDM2在癌旁組織中陰性表達(dá)；1：×100；2：×200

表1 HCC和癌旁正常肝組織中CMIP、MDM2蛋白的表達(dá)情況

表2 HCC組織中CMIP、MDM2蛋白表達(dá)與臨床病理參數(shù)的關(guān)系

3 討論

腫瘤的發(fā)生是一個(gè)多基因參與的、多階段的、漸進(jìn)的過(guò)程，這一過(guò)程涉及許多基本的細(xì)胞機(jī)制如增殖、凋亡、代謝等的改變。細(xì)胞凋亡是一種由基因調(diào)控的細(xì)胞主動(dòng)的、程序化的死亡過(guò)程，在機(jī)體生長(zhǎng)發(fā)育、細(xì)胞分化和病理狀態(tài)中發(fā)揮重要作用。細(xì)胞凋亡的過(guò)程通常是凋亡抑制因子、凋亡促進(jìn)因子和相應(yīng)的調(diào)節(jié)因子等共同作用的結(jié)果；細(xì)胞凋亡在控制細(xì)胞的增殖、腫瘤的發(fā)生和發(fā)展方面起著重要作用，逃避凋亡是腫瘤細(xì)胞的一個(gè)重要特征[7]。

Sahali et al[8]在研究特發(fā)性腎病綜合征的免疫發(fā)病機(jī)制過(guò)程中分離出一個(gè)新的基因，命名為c-mip。c-mip基因位于人類染色體16q24上，編碼蛋白質(zhì)分子量為86 ku[9-10]。CMIP的生物學(xué)功能參與調(diào)節(jié)人體腎臟組織中的足細(xì)胞相關(guān)行為，在人體腎臟疾病中發(fā)揮著重要作用。研究[4]表明在腎小球足細(xì)胞中c-mip通過(guò)下調(diào)RelA表達(dá)抑制了NF-κB活性從而促進(jìn)細(xì)胞凋亡，此外，c-mip增加Bax的表達(dá)水平并增強(qiáng)caspase-3的活性，同時(shí)降低了Bcl-2表達(dá)的水平，同樣發(fā)揮促凋亡作用。Gerami et al[11]使用qRT-PCR方法檢測(cè)黑色素瘤組織和色素痣組織中CMIP的mRNA水平，結(jié)果表明相對(duì)于非黑色素瘤病變，CMIP mRNA在黑色素瘤中表達(dá)下調(diào)。本研究應(yīng)用免疫組化技術(shù)檢測(cè)了115例HCC及98例癌旁組織中CMIP蛋白的表達(dá)，結(jié)果顯示癌旁組織中CMIP蛋白全部陽(yáng)性表達(dá)，而HCC組織中的表達(dá)率為57.39%?？梢?jiàn)CMIP在正常肝組織中普遍表達(dá)，HCC組織中存在高比率的CMIP蛋白缺失表達(dá)。提示在HCC的發(fā)生過(guò)程中，CMIP基因的失活或低表達(dá)起著重要作用。此外，本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示CMIP蛋白在HCC組織中的陽(yáng)性表達(dá)與腫瘤大小顯著相關(guān)，直徑≤5 cm的陽(yáng)性率達(dá)72.13%，明顯高于直徑>5 cm的陽(yáng)性率40.74%。提示CMIP不僅參與了HCC的發(fā)生，而且與腫瘤細(xì)胞的增長(zhǎng)和增殖密切相關(guān)。

MDM2基因最初是從含有雙微體的小鼠成纖維母細(xì)胞中克隆出的一個(gè)高度擴(kuò)增的原癌基因，位于人類12號(hào)染色體12q13-14上[12]。MDM2是p53的轉(zhuǎn)錄靶基因，通過(guò)負(fù)反饋環(huán)路相互調(diào)節(jié)，MDM2可以降低p53蛋白的水平并抑制其介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡活性[5]。MDM2可以促進(jìn)細(xì)胞增殖，抑制細(xì)胞凋亡，其生物學(xué)作用是增強(qiáng)細(xì)胞的生存活力，使細(xì)胞生存期延長(zhǎng)，促進(jìn)細(xì)胞增生及腫瘤的生長(zhǎng)[13]。Song et al[14]采用組織芯片平臺(tái)，應(yīng)用免疫組化法檢測(cè)了56例美國(guó)和51例亞洲HCC患者中MDM2蛋白表達(dá)情況，發(fā)現(xiàn)MDM2陽(yáng)性表達(dá)與HCC患者性別、有無(wú)血管侵犯、是否HBsAg陽(yáng)性密切相關(guān)，與腫瘤大小、分化程度、有無(wú)淋巴結(jié)及遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移無(wú)明顯相關(guān)性。本研究應(yīng)用免疫組化法顯示MDM2在HCC中的表達(dá)水平顯著高于癌旁組織；在分析MDM2表達(dá)與HCC臨床病理參數(shù)關(guān)系時(shí)顯示MDM2蛋白陽(yáng)性表達(dá)與本研究中的臨床病理參數(shù)均無(wú)關(guān)，與Zhang et al[15]研究結(jié)果一致。這表明MDM2作為癌基因在HCC的發(fā)生過(guò)程中起重要作用，但MDM2與HCC腫瘤生物學(xué)行為關(guān)系的研究結(jié)論各異，可能與本實(shí)驗(yàn)樣本量較小、單一中心取樣有關(guān)。因此MDM2可作為HCC治療的潛在靶點(diǎn)，MDM2蛋白與HCC臨床病理參數(shù)的相關(guān)性有待于進(jìn)一步研究。

綜上所述，本研究結(jié)果顯示，HCC中CMIP蛋白失表達(dá)與MDM2蛋白過(guò)表達(dá)無(wú)明顯相關(guān)性，說(shuō)明雖然二者均參與細(xì)胞凋亡，但CMIP和MDM2對(duì)HCC的發(fā)生、發(fā)展可能各自發(fā)揮獨(dú)立的作用。目前的研究?jī)H限于現(xiàn)象研究，對(duì)于CMIP表達(dá)缺失導(dǎo)致HCC的發(fā)生機(jī)制及分子調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，仍然不完全清楚，尚待進(jìn)一步研究。

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