高通量基因測(cè)序技術(shù)在自然流產(chǎn)胎兒絨毛染色體的核型分析

方有燕，吳 歡，賀小進(jìn)，陳大蔚，周一茹，周 平，曹云霞，魏兆蓮

近年，輔助生殖技術(shù)(assisted reproductive technology,ART)在個(gè)體化控制性超促排卵方案的應(yīng)用、實(shí)驗(yàn)室技術(shù)以及儀器設(shè)備方面均取得了長(zhǎng)足的進(jìn)步，ART術(shù)后的臨床妊娠率有了很大的提高，但高流產(chǎn)率仍是一個(gè)亟待解決的問題。常見的流產(chǎn)病因包括遺傳因素、免疫因素、內(nèi)分泌、生殖道感染、生殖道畸形及高凝血狀態(tài)等，其中遺傳因素尤其染色體異常被認(rèn)為是最常見早期流產(chǎn)誘發(fā)因素[1]。絨毛細(xì)胞來源于胚胎外胚層細(xì)胞，具有與胚胎組織相同的遺傳特性，因此可通過檢測(cè)自然流產(chǎn)組織染色體核型，了解胚胎細(xì)胞的遺傳性狀，分析胚胎停育的可能病因。既往關(guān)于胚停絨毛染色體分析多采用傳統(tǒng)的染色體顯帶和熒光原位雜交技術(shù),且關(guān)于不同病因ART流產(chǎn)組織染色體分析鮮有報(bào)道。該研究采用高通量測(cè)序技術(shù)分析364例自然流產(chǎn)絨毛組織染色體異常的發(fā)生率、核型分布及與孕婦年齡、胎兒性別、妊娠方式、不同ART病因之間的關(guān)系，報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1病例資料選擇2014年9月～2016年12月于安徽醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院婦產(chǎn)科生殖中心行胎兒絨毛染色體檢測(cè)的364例患者作為研究對(duì)象，年齡19～44(30.440±4.768)歲，孕5～15周，其中13～15周僅1例。根據(jù)妊娠方式，將其分為自然妊娠組及ART組。364例患者中自然妊娠246例，ART術(shù)后妊娠118例，B超提示胚胎停止發(fā)育(未見胚芽或未見心管搏動(dòng))，在取得患者知情同意的前提下采集胚胎絨毛標(biāo)本并行高通量測(cè)序。

1.2高通量測(cè)序法檢測(cè)絨毛染色體核型① 提取基因組DNA，Wizard試劑盒進(jìn)行產(chǎn)物純化，Qubit法檢測(cè)純化后的產(chǎn)物；② 構(gòu)建基因組DNA小片段文庫：采用Life Tech的ION XPRESS LIBRARY KIT進(jìn)行DNA片段化，并構(gòu)建DNA小片段文庫；③ 按照PGM測(cè)序操作指南(Ion PGM-200 Sequencing Kit V2 only)進(jìn)行高通量測(cè)序及信息分析。

2 結(jié)果

2.1樣本總體檢測(cè)結(jié)果364例絨毛組織中檢出染色體數(shù)目及結(jié)構(gòu)異常178例，異常率為48.90%(178/364)，其中自然妊娠組130例，異常率52.85%(130/246)，顯著高于ART組的40.68%(48/118)(P<0.05)。異常核型以常染色體三體型為主，占異常核型的65.17%；其次為染色體結(jié)構(gòu)微缺失/微重復(fù)，占15.73%；性染色體單體占6.74%；三倍體占5.06%；嵌合體占3.93%。除1、6、11號(hào)染色體外非整倍體的發(fā)生涉及所有染色體，其中16號(hào)染色體發(fā)生率最高，占異常染色體的21.35%；22號(hào)染色體次之，占11.24%；常染色體的非整倍體多為三體型，性染色體的非整倍體則以單體型為多，僅有1例常染色體單體，核型為45，XY,-21。見表1。

表1 早期自然流產(chǎn)絨毛組織染色體異常核型及分布

2.2年齡與染色體異常ART組≥35歲流產(chǎn)絨毛組織染色體異常發(fā)生率雖高于<35歲患者，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；自然妊娠組≥35歲流產(chǎn)絨毛組織染色體異常發(fā)生率顯著高于<35歲患者(P<0.05)。見表2。

表2 年齡與染色體異常

2.3ART助孕病因與胚胎染色體異常ART組流產(chǎn)胎兒絨毛染色體異常率為40.68%(48/118)，以復(fù)發(fā)性流產(chǎn)最常見，占60.00%，其次為男方因素，占48.39%。見表3。經(jīng)χ2檢驗(yàn)，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，尚不能表明ART組不同病因染色體異常率不同。

表3 ART助孕妊娠組不同病因分布

2.4性別與胚胎染色體異常核型分布362例胚停組織中(其中2例因測(cè)試時(shí)要求保密，具體性別不詳，予以排除，其中1例核型異常)，男胚166例，女胚196例，男胚異常核型占總異常核型的53.11%(94/177),顯著高于女胚的46.89%(83/177)(P=0.007)。在177例異常染色體核型中，常染色體三體型占65.64%(116/177)，其中男胚63例，女胚53例。按照染色體非顯帶核型對(duì)三體核型進(jìn)行分組，將其分為A、B、C、D、E、F、G 7組，詳見表4，男、女胚均主要分布于E組(38.10%vs37.74%) 和G組(22.22%vs30.19%)；男胚A組三體核型顯著多于女胚(P<0.05)，其余各組在性別間分布差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見表4。

3 討論

絨毛滋養(yǎng)層細(xì)胞是受精卵有絲分裂的衍生物，因其與胎兒組織具有相同的遺傳性狀，故可以作為檢測(cè)早期胎兒染色體異常的材料，對(duì)自然流產(chǎn)的遺傳學(xué)病因做出診斷，為胚停夫婦再次妊娠的遺傳咨詢提供信息。

表4 不同性別胚胎染色體非顯帶核型分組分布

自然流產(chǎn)的發(fā)生率約占所有妊娠的15%～20%，是妊娠期常見的并發(fā)癥[2]。自然流產(chǎn)多發(fā)生于妊娠早期，導(dǎo)致流產(chǎn)的病因眾多，其中染色體異常占50%～70%[3]，是導(dǎo)致胚胎早期流產(chǎn)的主要原因，因?yàn)槿旧w數(shù)目異常的胚胎遺傳缺陷更大，導(dǎo)致遺傳物質(zhì)不平衡，致死性更高[3-4]。有研究者認(rèn)為常染色體三體以16號(hào)染色體三體最常見，約占1/3，且具有高致死性[2,5]。本研究結(jié)果顯示，染色體數(shù)目異常發(fā)生率為41.21%(150/364)，其中16號(hào)染色體三體發(fā)生率為32.76%(38/116)，與相關(guān)研究[2,5]報(bào)道一致。45，X0是人類唯一能生存的單體綜合征[6]，本研究中，45，X0核型有12例，占所有異常染色體核型的6.74%，該異常核型的形成除與減數(shù)分裂時(shí)性染色體不分離導(dǎo)致一條染色體缺失有關(guān)外，多由于父系性染色體丟失所致。通過對(duì)116例常染色體三體核型按染色體非顯帶核型圖進(jìn)行分組，顯示男胚、女胚均主要分布在E、G兩組，這可能與常染色體三體主要為16、22號(hào)染色體異常，而16、22號(hào)染色體分別位于E、G兩組有關(guān)。本研究中男胚A組三體核型顯著多于女胚，因樣本量小，尚不足以得出結(jié)論，仍需擴(kuò)大樣本量進(jìn)一步研究證實(shí)。

本研究中自然妊娠組年齡小于ART組，但絨毛染色體異常的發(fā)生率卻高于ART組(52.85%vs40.68%),可能與行ART患者的配子及胚胎經(jīng)體外優(yōu)化、篩選后染色體異常率降低有關(guān)。有研究[5,7]顯示，20～24歲、40～44歲、45歲及以上流產(chǎn)率分別為10%、51%、75%，≥39歲年齡組約占總?cè)藬?shù)的25%，21三體綜合征的發(fā)生率占1.44%，顯著高于35～38歲年齡組的0.65%。這些研究[5,7]表明，隨著年齡增長(zhǎng)，不僅流產(chǎn)率增加，染色體異常率也明顯增高。本研究結(jié)果也證實(shí)，自然妊娠組≥35歲患者染色體異常率高達(dá)73.68%，顯著高于<35歲的48.99%。ART組不同年齡間染色體異常率差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，可能與ART組≥35歲例數(shù)偏少有關(guān)，尚需擴(kuò)大樣本量進(jìn)一步驗(yàn)證。

有研究[8]表明，不明原因性妊娠丟失與精子染色質(zhì)的高頻組裝異常有關(guān)。本研究ART組中男方因素主要包括少、弱、畸形精子癥、單/雙側(cè)輸精管缺如、梗阻性無精子癥等，其染色體異常發(fā)生率高達(dá)48.39%，可能與該組患者DNA碎片指數(shù)較高有關(guān),García-Ferreyra et al[9]研究表明，DNA碎片指數(shù)較高組(37.10±17.61)胚胎染色體非整倍體率顯著高于DNA碎片指數(shù)較低組(21.3±13.48，17.4±10.79)(73.9%vs61.1%vs59.1%)，由于精子核染色質(zhì)的去凝作用以及隨后形成的雄原核對(duì)正常受精和胚胎發(fā)育都至關(guān)重要，精子DNA碎片指數(shù)高表明染色質(zhì)損傷，可降低受精能力和胚胎發(fā)育潛能，最終導(dǎo)致妊娠丟失[8]。因此對(duì)ART后的早期流產(chǎn)應(yīng)充分考慮到男方精子染色體異常因素，術(shù)前應(yīng)常規(guī)檢查男方精子染色體有無異常，以避免或減少早期妊娠丟失。

本研究中多囊卵巢綜合征(polycystic ovar syndrome,PCOS)患者絨毛染色體異常發(fā)生率為30.00%，明顯低于復(fù)發(fā)性流產(chǎn)和男方因素的患者，與Wang et al[10]報(bào)道的結(jié)果一致(胚停組織染色體非整倍體發(fā)生率為28.1%)，結(jié)果表明，雖然PCOS患者早期流產(chǎn)率高達(dá)50%，但染色體非整倍性可能并不是其早期流產(chǎn)的主要原因，而母體內(nèi)分泌因素(如高黃體生成素水平、高雄激素水平、孕酮產(chǎn)物異常、胰島素抵抗)及其導(dǎo)致的子宮內(nèi)膜容受性降低可能是PCOS患者早期流產(chǎn)的主要風(fēng)險(xiǎn)因素。子宮內(nèi)膜異位癥患者染色體異常發(fā)生率與PCOS患者相近(30.77%)，可能與子宮內(nèi)膜異位病灶的炎癥反應(yīng)、細(xì)胞因子的異常改變影響卵子成熟和質(zhì)量以及子宮內(nèi)膜容受性降低有關(guān)[11]。

早期自然流產(chǎn)除表現(xiàn)為染色體異常率增高，還存在性別特異性胚胎淘汰現(xiàn)象[12]。本研究362例絨毛組織中，胚停女胚占比高于男胚(196vs166)，但男胚異常核型占比高于女胚(53.11%vs46.89%)，與其他研究者的報(bào)道[13-14]一致，具體機(jī)制尚不清楚。

此外，本研究發(fā)現(xiàn)染色體結(jié)構(gòu)異常占有較高的比重(7.69%)，占所有異常染色體核型的15.73%，因此應(yīng)重視早期流產(chǎn)染色體的結(jié)果異常。這可能與高通量測(cè)序技術(shù)相比于傳統(tǒng)染色體核型分析和熒光原位雜交技術(shù)具有更高的檢測(cè)深度和準(zhǔn)確度有關(guān)。高通量測(cè)序技術(shù)可檢測(cè)到0.5 Mbp以上的染色體片段缺失，能發(fā)現(xiàn)更多的染色體片段微缺失和微重復(fù)等結(jié)構(gòu)異常。

綜上所述，自然流產(chǎn)胚胎染色體異常核型率高于ART組；年齡與胚胎染色體異常率增高有關(guān)；染色體數(shù)目異常是導(dǎo)致胚胎早期流產(chǎn)的主要原因，16號(hào)染色體三體是最常見的胚胎染色體數(shù)目異常；胚停女胚占比高于男胚，但男胚異常核型占比高于女胚；應(yīng)重視不明原因妊娠丟失的男方精子染色體異常。高通量測(cè)序技術(shù)相較于傳統(tǒng)染色體核型分析和熒光原位雜交技術(shù)具有更高的檢測(cè)深度和準(zhǔn)確度，能發(fā)現(xiàn)更多的染色體結(jié)構(gòu)和數(shù)目異常，對(duì)闡明早期流產(chǎn)的遺傳學(xué)病因及再次妊娠的遺傳咨詢具有重要意義。

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