AML對(duì)柔紅霉素的耐藥性與TET2基因突變的相關(guān)性

楊 柳，葛 健，夏瑞祥

急性髓系白血病(acute myeloid leukemia, AML) 是一類(lèi)造血干細(xì)胞的惡性克隆性疾病，具有高度異質(zhì)性，以骨髓原始細(xì)胞的異常增殖和分化為特征，化療是其最主要的治療手段之一，但因原發(fā)或繼發(fā)耐藥的原因而導(dǎo)致治療失敗率居高不下。目前有研究[1]表明，表觀遺傳學(xué)異常，如DNA甲基化可影響白血病細(xì)胞對(duì)化療藥物的敏感性。研究[2-3]顯示TET2基因突變與造血系統(tǒng)惡性腫瘤密切相關(guān)，并在診斷、治療和預(yù)后評(píng)估中具有潛在價(jià)值。Viguié et al[4]在4例AML患者中發(fā)現(xiàn)4q24上的基因重排，通過(guò)BAC克隆和熒光原位雜交顯示4q24斷裂處0.5Mb的缺失區(qū)域。Delhommeau et al[5]首次報(bào)道了在骨髓增殖性疾病患者中染色體4q24的雜合缺失，TET2基因突變最早發(fā)現(xiàn)于JAK2V617F陽(yáng)性的骨髓增殖性疾病中，后來(lái)在系統(tǒng)性肥大細(xì)胞癥，骨髓增生異常綜合癥及AML中也有發(fā)現(xiàn)。該研究利用高通量二代測(cè)序及體外藥敏試驗(yàn)等技術(shù)手段，將54種白血病相關(guān)基因與AML對(duì)于化療藥物耐藥性之間的相關(guān)性進(jìn)行探討，同時(shí)將其與臨床資料結(jié)合，以期找出具有預(yù)測(cè)發(fā)生耐藥的特定指標(biāo)。

1 材料與方法

1.1病例資料選取2016年1月～12月安徽醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院血液科初診AML患者74例，其中男40例，女34例，年齡16～83歲，中位年齡46歲。根據(jù)2008年WHO診斷標(biāo)準(zhǔn)將患者分為：AML微分化型(M0)1例，AML未分化型(M1)2例，AML部分分化型(M2)41例，急性粒單細(xì)胞白血病(M4)11例，急性單核細(xì)胞白血病(M5)16例，急性紅白血病(M6)3例。 基因檢測(cè)時(shí)間：初診治療前。高通量體外藥敏檢測(cè)試驗(yàn)抽樣時(shí)間：患者接受治療前抽取外周靜脈血4～8 ml。

1.2單個(gè)核細(xì)胞分離純化患者所取樣本采用Ficoll密度梯度離心法分離，同時(shí)淋巴細(xì)胞分離液和細(xì)胞培養(yǎng)液RPMI 1640預(yù)熱至室溫。在15 ml離心管中加入適量的淋巴細(xì)胞分離液，取肝素抗凝靜脈血與2倍量的Hank’s液或RPMI 1640充分混勻，離心。離心后取中間白色云霧層狹窄帶單個(gè)核細(xì)胞層，加入含有20%胎牛血清的RPMI 1640，重懸細(xì)胞。

1.3高通量二代測(cè)序?qū)嶒?yàn)方法分離提純的單個(gè)核細(xì)胞進(jìn)行DNA抽提，NanoDrop鑒定純度。DNA與探針混合后先加溫到95 ℃ 1 min，然后將熱模塊設(shè)到40 ℃讓樣本探針緩慢降溫到40 ℃(大概需要約80 min)。然后，除未雜交上的探針，延伸并連接雜交上的探針進(jìn)行PCR擴(kuò)增。利用AMPure XP 純化PCR完成后的產(chǎn)物并進(jìn)行質(zhì)控，上機(jī)檢測(cè)。高通量二代測(cè)序?qū)嶒?yàn)主要檢測(cè)54個(gè)白血病相關(guān)基因，見(jiàn)表1。

1.4體外藥物敏感性檢測(cè)分離、提取的單個(gè)核細(xì)胞計(jì)數(shù)后按照1×105～1×106個(gè)細(xì)胞/1ml在細(xì)胞加樣槽中充分混勻后，采用Corning 384孔不透明白色細(xì)胞培養(yǎng)板進(jìn)行培養(yǎng)，每孔體積50 μl，細(xì)胞數(shù)目為5×103～5×104。采用JANUS@ automated workstation (美國(guó)Perkin Elmer Inc公司) 進(jìn)行加藥，藥物名稱(chēng)見(jiàn)表2, 每孔0.1 μl，給藥后37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中孵育72 h后，加入10 μl CellTiter-Glo 細(xì)胞增殖熒光檢測(cè)試劑，靜置10 min，Envision Plate-Reader讀數(shù)。

表1 基因檢測(cè)列表

表2 藥物篩查列表 (81種)

1.5統(tǒng)計(jì)學(xué)處理采用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，計(jì)數(shù)資料采用χ2檢驗(yàn)，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1二代測(cè)序?qū)嶒?yàn)結(jié)果74例AML患者中11例發(fā)生TET2基因突變，見(jiàn)表3,11例TET2突變患者中有5例患者同時(shí)發(fā)生ASXL1基因突變,其余63例患者基因檢測(cè)結(jié)果顯示均未發(fā)現(xiàn)TET2基因突變。

2.2高通量體外藥敏實(shí)驗(yàn)結(jié)果對(duì)于81種藥物進(jìn)行檢測(cè)分析, 表明柔紅霉素耐藥性最高, 結(jié)果顯示11例TET2基因突變陽(yáng)性患者中9例(81.82%)對(duì)柔紅霉素不敏感，63例TET2基因突變陰性患者中僅4例(6.35%)對(duì)柔紅霉素不敏感，兩組結(jié)果差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=31.805，P<0.05)。在TET2基因突變陽(yáng)性的11例患者中，10例采用柔紅霉素+阿糖胞苷(DA)方案化療，具體為柔紅霉素45 mg/m2第1～3天,阿糖胞苷100 mg/m2第1～7天,1例放棄治療，3例完全緩解，7例未緩解，耐藥率為70%，見(jiàn)表4。體外藥敏試驗(yàn)中耐藥率與患者未緩解率差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 討論

TET2定位于染色體4q24的斷裂點(diǎn)[6]，在體內(nèi)廣泛表達(dá)，編碼TET2蛋白，阻止細(xì)胞的不可控生長(zhǎng)，進(jìn)而阻止腫瘤形成。TET2突變能使TET2蛋白功能丟失，從而導(dǎo)致造血干細(xì)胞異常的增殖和分化。近幾年在多種血液惡性疾病中發(fā)現(xiàn)TET2基因突變。TET2常見(jiàn)的突變類(lèi)型有錯(cuò)義突變，無(wú)義突變，移碼突變及短小插入缺失等[6]。TET2突變最常發(fā)生于外顯子3和11，突變位置與TET酶的功能結(jié)構(gòu)域緊密相關(guān)，在催化結(jié)構(gòu)CD和DSBH的突變會(huì)引起蛋白質(zhì)的錯(cuò)誤折疊和氨基酸的替換，產(chǎn)生無(wú)功能蛋白，從而導(dǎo)致腫瘤形成[7]。目前研究[8]推測(cè)TET2突變主要分為兩類(lèi)：一類(lèi)為在骨髓增殖性腫瘤、骨髓增生異常綜合征和繼發(fā)性急性髓系白血病中的突變，預(yù)后意義尚不明確；另一類(lèi)為在慢性粒-單核細(xì)胞白血病和原發(fā)性急性髓系白血病中的突變，此類(lèi)突變具有強(qiáng)致病性和侵襲性，可直接影響患者預(yù)后。在一項(xiàng)對(duì)原發(fā)性AML的大規(guī)模研究中，Metzeler et al[9]發(fā)現(xiàn)TET2的突變率為23%，隨年齡增長(zhǎng)，TET2突變率增加。更重要的是研究發(fā)現(xiàn)核型正常的AML患者，若伴有TET2突變則預(yù)后不良。Abdel-Wahab et al[10]檢測(cè)了91例AML患者，其中11例發(fā)生TET2突變，突變率為12%，而且發(fā)現(xiàn)TET2突變患者5年生存率顯著低于無(wú)突變患者。Cher et al[11]發(fā)現(xiàn)72例AML患者中有8例發(fā)生TET2突變，突變率11%，且無(wú)病生存率減低。Nibourel et al[12]發(fā)現(xiàn)111例完全緩解的AML患者中有19例檢測(cè)到TET2突變，36例沒(méi)有完全緩解的AML患者中有19例檢測(cè)到TET2突變。這些研究結(jié)果也表明TET2突變可以作為臨床AML危險(xiǎn)分層的新的生物學(xué)標(biāo)志。魏計(jì)鋒 等[13]在96例患者中檢測(cè)到13例TET2突變，突變率為13.54%。本研究對(duì)74例AML患者中54種白血病相關(guān)基因進(jìn)行高通量測(cè)序，TET2基因突變率相對(duì)較高，11例患者存在該突變，突變率為14.86%，與國(guó)內(nèi)外研究[10-13]結(jié)果相似。另外，這11例患者中有5例伴有ASXL1突變。ASXL1基因定位于染色體20q11,編碼一個(gè)長(zhǎng)為1 541個(gè)氨基酸的核蛋白，參與組蛋白甲基化調(diào)控。在AML中，ASXL1突變易發(fā)生在老年男性患者，并與8號(hào)染色體三倍體、RUNX1突變及HLA-DR和CD34的表達(dá)相關(guān)，該基因與耐藥性的產(chǎn)生是否具有相關(guān)性，仍需進(jìn)一步研究明確。

表3 11例TET2患者基本信息

表4 11例TET2患者基因突變及用藥信息

為了明確TET2基因突變與白血病患者耐藥性產(chǎn)生之間的相關(guān)性，本研究隨后使用74例AML患者外周血進(jìn)行體外藥敏試驗(yàn)，檢測(cè)其對(duì)于常見(jiàn)化療藥物的敏感性，結(jié)果顯示對(duì)柔紅霉素耐藥的比例最高。柔紅霉素是蒽環(huán)類(lèi)化療藥物，是周期非特異性化療藥物，具有較強(qiáng)的抗腫瘤性，并在AML中有較高的完全緩解率和較低的復(fù)發(fā)率，且與其他蒽環(huán)類(lèi)藥物無(wú)交叉耐藥現(xiàn)象，半衰期長(zhǎng)。柔紅霉素聯(lián)合阿糖胞苷聯(lián)合化療方案目前臨床誘導(dǎo)治療AML的主要方案之一，其中柔紅霉素起著重要作用。目前幾乎所有的一線(xiàn)標(biāo)準(zhǔn)方案中都含有柔紅霉素[14]，其作用機(jī)制在于影響細(xì)胞的核酸合成，與DNA結(jié)合，阻礙DNA合成和依賴(lài)DNA的RNA的合成反應(yīng)。DNA拓?fù)洚悩?gòu)酶Ⅱ是其重要靶點(diǎn)。DNR干擾拓?fù)洚悩?gòu)酶Ⅱ?qū)NA斷端重新接合，造成DNA損傷，導(dǎo)致細(xì)胞凋亡[15]。目前報(bào)道[16]顯示，臨床正在使用柔紅霉素時(shí)，也有部分患者出現(xiàn)柔紅霉素耐藥。其耐藥機(jī)制尚不明確，可能與NF-κB異常活化、IκB降低，致使細(xì)胞內(nèi)耐藥基因P-gp/mdrl等的表達(dá)增多有關(guān)。多項(xiàng)研究[17]結(jié)果顯示，柔紅霉素療效存在一定的個(gè)體差異。目前認(rèn)為表觀遺傳學(xué)可能影響柔紅霉素的療效，如DNA甲基化，組蛋白修飾，microRNA 的表達(dá)等都影響了機(jī)體對(duì)柔紅霉素的反應(yīng)，成為研究熱點(diǎn)，而且在臨床治療中也確實(shí)存在使用柔紅霉素方案療效欠佳。在本研究中，11例TET2基因突變陽(yáng)性患者中，有9例對(duì)柔紅霉素不敏感，而63例TET2基因突變陰性患者中僅有4例對(duì)柔紅霉素不敏感，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，這表明有TET2基因的突變可能有助于患者對(duì)柔紅霉素產(chǎn)生耐藥性。由于體內(nèi)腫瘤微環(huán)境等因素的影響，可能體外試驗(yàn)并不一定與藥物的實(shí)際臨床療效完全等同，因此，本研究又同時(shí)將11例TET2基因突變陽(yáng)性患者對(duì)于DA方案的實(shí)際療效與體外藥敏試驗(yàn)進(jìn)行對(duì)比，由于1例患者未行化療，因而無(wú)法對(duì)其判斷療效，僅將另外10例患者的體外藥敏試驗(yàn)與實(shí)際臨床療效進(jìn)行對(duì)比，結(jié)果顯示差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

根據(jù)本研究結(jié)果，推測(cè)TET2基因突變可能確實(shí)增加了AML對(duì)柔紅霉素產(chǎn)生耐藥性的風(fēng)險(xiǎn)。然而，由于本研究中TET2基因突變陽(yáng)性的患者數(shù)較少，導(dǎo)致本研究的結(jié)果具有一定的局限性，將會(huì)在今后的研究中進(jìn)一步提高樣本數(shù)，明確是否在大樣本的研究中能夠得到相同的結(jié)果。本研究為今后的工作提供了一個(gè)方向，可以建立動(dòng)物模型，研究發(fā)生機(jī)制，使基因檢測(cè)與藥敏實(shí)驗(yàn)更好結(jié)合，對(duì)精準(zhǔn)醫(yī)療，尤其是急性白血病個(gè)體化治療提供依據(jù)，從而提高治療的有效率，有較高的臨床指導(dǎo)意義及應(yīng)用前景。

[1] Pastor W A,Aravind L,Rao A.TET onic shift:Biological reles of TET proteins in DNA demethylation and tasnscription [J].NatRev Mol Cell Biol,2013,14(6):341-56.

[2] Langemeijer S M,Aslanyan M G,Jansen J H.TET proteins in malignant hematopoiesis[J].Cell Cycle,2009,8(24):4044-8.

[3] An J, González-Avalos E,Chawla A,et al.Acute loss of TET function results in aggressive myeloid cancer in mice [J].Nat Commun,2015,6:10071.

[4] Viguié F, Aboura A, Bouscary D, et al.Common 4q24 deletion in four cases of hematopoietic malignancy: early stem cell involvement[J]. Leaukemia, 2005, 19(8):1411-5.

[5] Delhommeau F, Dupont S, Della Valle V, et al. Mutation in TET2 in myeloid cancers[J]. N Engl J Med, 2009, 360(22):2289-301.

[6] Tefferi A, Pardanani A, Lim K H, et al. TET2 mutations and their clinical correlates in polycythemia vera, essential thrombocythemia and myelofibrosis[J]. Leukemia, 2009, 23(5):905-11.

[7] Tefferi A, Lim K H, Abdel-Wahab O, et al. Detection of mutant TET2 in myeloid malignancies other than myeloproliferative neoplasms: CMML,MDS,MDS/MPN and AML[J].Leukemia, 2009, 23(7):1343-5.

[8] Euba B,Vizmanos J L, García-Granero M, et al. A meta-analysis of TET2 mutations shows a distinct distribution pattern in de novo acute myeloid leukemia and chronic myelomonocytic leukemia [J]. Leuk Lymphom, 2012,53(6):1230-3.

[9] Metzeler K H, Maharry K, Radmacher M D, et al.TET2 mutations improve the new European LeukemiaNet risk classification of acute myeloid leukemia: a Cancer and Leukemia Group B study[J]. J Clin Oncol, 2011, 29(10): 1373-81.

[10] Abdel-Wahab O，Mullally A，Hedvat C, et al. Genetic characterization of TET1, TET2, and TET3 alterations in myeloid malignancies [J]. Blood, 2009,114(1);144-7.

[11] Cher C Y, Leung G M, An C H, et al. Next-generation sequencing with a myeloid gene panel in core binging factor AML Showed KIT activation Loop and TET2 mutations predictive of outcome[J]. Blood Cancer J, 2016, 6(7):e442.

[12] Nibourel O, Kosmider O, Cheok M, et al. Incidence and prognostic value of TET2 alterations in de novo acute myeloid leukemia achieving complete remission [J]. Bood, 2010, 116(7):1132-5.

[13] 魏計(jì)鋒，陳廣華，仇惠英,等.急性髓系白血病患者TET2基因突變發(fā)生率及其臨床意義[J].中華血液學(xué)雜志,2011,32(5):304-7.

[14] O’Donnell M R, Abboud C N, Altman J, et al. NCCN clinical practice guidelines acute myeloid leukemia[J].J Natl Compr Canc Netw, 2012,10(8):984-1021.

[15] Kaufmann S H, Karp J E, Jones R J, et al. Topoisomerase Ⅱ levels and drug sensitivity in adult acute myelogenous leukemia[J].Blood,1994,83(2):517-30.

[16] Quiney C, Billard C, Faussat A M, et al. Hyperforin inhibits P-gp and BCRP activities in chronic lymphocytic leukaemia cells and myeloid cells[J]. Leuk Lymphoma, 2007,48(8):1587-99.

[17] Lugthart S, Cheok M H, den Boer M L, et al. Identification of genes associated with chemotherapy crossresistance and treatment response in childhood acute lymphoblastic leukemia[J]. Cancer Cell, 2005,7(4):375-86.