利用Caco-2細(xì)胞模型研究新型Pim-1激酶抑制劑KY-C002的表觀滲透系數(shù)

馬 雁，徐紹輝，于坤宏，郭圣榮

原癌基因Pim-1是基因pim家族(現(xiàn)發(fā)現(xiàn)pim-1、pim-2、pim-3)中的一員，Pim-1激酶在調(diào)控細(xì)胞凋亡、分化、增殖以及腫瘤形成等方面發(fā)揮非常重要的作用。Pim-1蛋白作為新的抗腫瘤靶點(diǎn)，具有較高的選擇性，近年來越來越被關(guān)注[1-4]。化合物KY-C002(結(jié)構(gòu)見圖1)是雜芳基酰胺類化合物。Ge[5]首先合成并證實(shí)該化合物是一種優(yōu)良的Pim-1激酶抑制劑，可用于預(yù)防和治療癌癥、自身免疫疾病、過敏反應(yīng)等疾病，具有很好的臨床應(yīng)用價(jià)值。目前尚未有關(guān)于其生物藥劑學(xué)性質(zhì)的研究報(bào)道，對(duì)于其生物藥劑學(xué)性質(zhì)的研究是十分必要的。Caco-2細(xì)胞系來源于人類結(jié)腸癌細(xì)胞，在常規(guī)的細(xì)胞培養(yǎng)條件下，即可自發(fā)分化形成腸上皮細(xì)胞樣的細(xì)胞，廣泛應(yīng)用于小分子藥物口服吸收的體外篩選模型[6-8]。該文采用Caco-2細(xì)胞單層模型研究Pim-1激酶抑制劑KY-C002的表觀滲透系數(shù)及藥物濃度的影響，為進(jìn)一步開展Pim-1激酶抑制劑KY-C002的動(dòng)物在體腸吸收以及開發(fā)其口服制劑提供有價(jià)值的參考。

圖1 KY-C002的分子結(jié)構(gòu)圖

1 材料與方法

1.1主要儀器高效液相色譜儀購自美國Waters 公司；BSA124S萬分之一電子天平購自北京賽多利斯科學(xué)儀器有限公司；KQ5200型超聲清洗儀購自昆山市超聲儀器有限公司；MQS-30電熱恒溫水浴搖床購自上海市旻泉儀器有限公司；85-2型磁力攪拌器購自上海司樂儀器有限公司；L500型離心機(jī)購自湖南湘儀實(shí)驗(yàn)室儀器開發(fā)有限公司；HF151UV CO2培養(yǎng)箱購自香港力康生物醫(yī)療科技控股集團(tuán)；JB-CJ-IFX超凈工作臺(tái)購自吳江市萬里彩鋼凈化有限公司；XSP-37XBW型倒置顯微鏡購自上海光學(xué)儀器六廠；Millicell-ERS-2型細(xì)胞電阻儀購自美國Millipore公司；Multiskan MK3 酶標(biāo)儀購自芬蘭Thermo Labsystems 公司。

1.2主要試劑與細(xì)胞化合物KY-C002(自制)；乙腈(色譜純，批號(hào)：0000077519)購自美國J.T Baker公司；三氟乙酸(分析純，批號(hào)：STBF6924V)購自 美國Sigma公司； 24孔聚碳酸酯膜轉(zhuǎn)運(yùn)板和25 cm2細(xì)胞培養(yǎng)瓶購自美國 Corning costar 公司；DMEM培養(yǎng)基和胎牛血清購自美國Gibco公司；Caco-2細(xì)胞株購自中科院細(xì)胞庫。

1.3KY-C002含量分析的高效液相色譜法(highperformanceliquidchromatography,HPLC)的建立

1.3.1色譜條件 色譜柱： C18柱(4.6 mm×250 mm，粒徑5 μm)；波長301 nm；流速1 ml/min；流動(dòng)相：A相為0.1%三氟乙酸水溶液，B相為0.1%三氟乙酸乙腈溶液；0～ 8 min A相：95%～5%，B相：5%～95%； 8～10 min A相：5%，B相：95%相；10～12 min B相：100%。

1.3.2HPLC方法的建立 從系統(tǒng)適用性、專屬性、重復(fù)性、準(zhǔn)確度、線性等方面驗(yàn)證HPLC方法。

1.3.3溶液穩(wěn)定性 置于2～8 ℃、室溫和37 ℃條件下考察對(duì)照品溶液的穩(wěn)定性。

1.4Caco-2細(xì)胞單層膜模型的建立和評(píng)價(jià)[9-11]

1.4.1細(xì)胞培養(yǎng) 細(xì)胞培養(yǎng)和種板：復(fù)蘇凍存的Caco-2細(xì)胞，加入10 ml完全 DMEM-10 培養(yǎng)液，將得到的細(xì)胞懸浮液轉(zhuǎn)移至25 cm2細(xì)胞培養(yǎng)瓶中，放入5% CO237 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，隔天換液，當(dāng)細(xì)胞達(dá)到約80%匯合時(shí)進(jìn)行傳代。細(xì)胞培養(yǎng)至合適狀態(tài)時(shí)進(jìn)行種板，細(xì)胞接種到24孔Transwell板，接種密度6×104個(gè)/ml 。向Transwell板的單層膜基底端(basolateral side, BL 側(cè))加入0.3 ml 完全 DMEM-10 培養(yǎng)液(無細(xì)胞)，向孔板單層膜頂端(apical side, AP 側(cè))加入0.2 ml已經(jīng)充分混合的細(xì)胞懸液。2 d換AP側(cè)和BL端側(cè)； 3～7 d隔天換AP側(cè)和BL側(cè)液； 8～17 d每天AP側(cè)換液，隔天BL側(cè)換液； 18 d以后每天換AP側(cè)和BL側(cè)液。

1.4.2細(xì)胞單層模型評(píng)價(jià)

既然如此，對(duì)于人工智能，我們是否也可作如是觀？進(jìn)一步說，特別是當(dāng)人工智能發(fā)展到“類人”階段之時(shí)，其和人類的不同究竟還有多大？這種不同，是否必定比女性和男性的不同更大？如果我們不應(yīng)因女性和男性的差異而否認(rèn)女性的法律人格，那至少在邏輯上說，差異也不能成為否認(rèn)人工智能之法律人格的理由。

1.4.2.1顯微鏡觀察Caco-2細(xì)胞形態(tài) Caco-2細(xì)胞在培養(yǎng)至20 d左右，顯微鏡下觀察細(xì)胞生長情況，觀察細(xì)胞生長是否均勻，是否可以清楚地看見細(xì)胞之間的接觸，以此判斷細(xì)胞是否形成完整的細(xì)胞單層。

1.4.2.2測量Caco-2細(xì)胞單層膜跨膜電阻 將Millicell-ERS電阻儀電極放入 PBS(pH 7.2)內(nèi)平衡 24 h，然后置于與培養(yǎng)液類似的無Ca2+、Mg2+的Hank’s平衡鹽溶液內(nèi)平衡2 h。平衡后將電極置于 70%乙醇浸泡 15 min，再在空氣中干燥15 s后放入無菌無Ca2+、Mg2+的Hank’s平衡鹽溶液液中浸泡 15 min，打開電源，校正電壓與電阻，測量空白對(duì)照 Millicell 膜的跨膜電阻值，然后測Caco-2 細(xì)胞單層膜跨膜電阻值，樣品的實(shí)際電阻為樣品實(shí)測電阻減去空白電阻值。

1.4.2.3酚紅通透性實(shí)驗(yàn) 取電阻值≥ 250 Ω/cm2的 Caco-2 細(xì)胞單層膜[12]，用無Ca2+、Mg2+的Hank’s平衡鹽溶液小心沖洗3次，輕輕吸干孔內(nèi)無Ca2+、 Mg2+的Hank’s平衡鹽溶液，以清除細(xì)胞表面對(duì)測定有干擾的物質(zhì)。于 Caco-2 細(xì)胞AP側(cè)加入含5 mg/L酚紅的無Ca2+、 Mg2+的Hank’s平衡鹽溶液(pH 7.2) 300 μl，細(xì)胞BL 側(cè)加入不含酚紅的無Ca2+、Mg2+的Hank’s平衡鹽溶液400 μl。將培養(yǎng)板置37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱內(nèi)，于 30、60、90、120 min 于 BL 側(cè)取樣 200 μl，并加入 200 μl 不含酚紅的無Ca2+、Mg2+的Hank’s平衡鹽溶液。以酶聯(lián)免疫熒光分析儀于560 nm處測定 Caco-2 細(xì)胞單層膜BL側(cè)內(nèi)酚紅的累積透過量。 計(jì)算表觀滲透系數(shù)(apparent permeability coefficient Papp)，Papp=(dQ/dt)/(AC0)，其中 dQ/dt 為單位時(shí)間藥物轉(zhuǎn)運(yùn)量(mg/s)；A為轉(zhuǎn)運(yùn)膜的面積，此時(shí)A為0.6 cm2；C0為酚紅的初始濃度5 mg/ml。

1.5化合物KY-C002轉(zhuǎn)運(yùn)實(shí)驗(yàn)將化合物KY-C002溶解在純水中配制成100 μg/ml儲(chǔ)備液，以無Ca2+、 Mg2+的Hank’s平衡鹽溶液稀釋至所設(shè)計(jì)濃度。選取細(xì)胞跨膜電阻≥250 Ω/cm2的Caco-2細(xì)胞單層，根據(jù)實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)，分別在細(xì)胞兩側(cè)加入化合物KY-C002溶液和無Ca2+、 Mg2+的Hank’s平衡鹽溶液(AP側(cè)0.3 ml，BL側(cè)0.4 ml)，與恒溫?fù)u床上(37 ℃, 50 r/min)溫育?；衔锶芤旱臐舛确謩e為5、10、20 μg/ml。再按實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)時(shí)間點(diǎn)進(jìn)行取樣，單孔取點(diǎn)，每點(diǎn)平行3個(gè)孔。取得的樣品溶液過濾之后按照“KY-C002含量分析的HPLC方法”測定轉(zhuǎn)運(yùn)量，計(jì)算Papp和BL→AP 側(cè)跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)的表觀系數(shù)與AP→BL 側(cè)跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)的表觀系數(shù)的比值外排率(efflux ratio，ER)值。

2 結(jié)果

2.1建立KY-C002含量分析的HPLC方法本文中建立的HPLC方法適用于新型Pim-1激酶抑制劑KY-C002含量分析。具體結(jié)果如下。

2.1.1系統(tǒng)適用性 KY-C002：兩份對(duì)照品溶液各連續(xù)進(jìn)樣3針，響應(yīng)因子的RSD均為0.2%，均≤3.0%；兩份對(duì)照品溶液3針響應(yīng)因子平均值之比為99.3%，在97.0%～103.0%。酚紅：兩份對(duì)照品溶液各連續(xù)進(jìn)樣3針，響應(yīng)因子的RSD分別為0.4%、0.1%，均≤2.0%；兩份對(duì)照品溶液3針響應(yīng)因子平均值之比為100.2%，在97.0%～103.0%。

2.1.3重復(fù)性 KY-C002：平行配制6份供試品溶液含量的為99.7%，RSD為1.3%，≤3.0%。酚紅：平行配制6份供試品溶液含量的為99.2%，RSD為1.0%，≤3.0%。

2.1.4準(zhǔn)確度 KY-C002：40%濃度的回收率分別為101.5%、103.9%、99.9%；100%濃度的回收率分別為96.7%、100.2%、100.7%；200%濃度的回收率分別為100.5%、101.8%、101.6%；在95.0%～105.0%。酚紅：40%濃度的回收率分別為98.1%、98.0%、98.4%；100%濃度的回收率分別為99.3%、99.0%、97.6%；200%濃度的回收率分別為99.6%、99.3%、99.7%；在95.0%～105.0%。

2.1.5線性 KY-C002：對(duì)照品溶液在0.21～21.06 μg/ml范圍內(nèi)線性良好，線性方程為Y=47 690.597 1X-4 934.153 2，R=0.999 8，響應(yīng)因子的RSD%為1.9%。酚紅：對(duì)照品溶液在0.41～40.58 μg/ml范圍內(nèi)線性良好，線性方程為Y=15 036.130 7X-174.708 8，R=1.000 0，響應(yīng)因子的RSD%為0.8%。

2.1.6溶液穩(wěn)定性 樣品溶液保存在2～8 ℃條件下，至少1 d內(nèi)保持穩(wěn)定；對(duì)照品溶液保存在2～8 ℃條件下，至少1 d內(nèi)保持穩(wěn)定。

2.1.7化合物KY-C002的色譜行為圖 見圖2。

2.2Caco-2細(xì)胞單層膜模型的評(píng)價(jià)本實(shí)驗(yàn)室條件下建立的Caco-2 細(xì)胞單層膜模型可用于化合物KY-C002的跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)實(shí)驗(yàn)。

2.2.1顯微鏡觀察Caco-2細(xì)胞形態(tài) Caco-2細(xì)胞在24孔Transwell板上培養(yǎng)21 d左右，顯微鏡下觀察細(xì)胞生長情況，細(xì)胞生長均勻，在細(xì)胞之間形成接觸清晰可見的邊界線，其形態(tài)見圖3。

2.2.2Caco-2細(xì)胞單層膜跨膜電阻 本實(shí)驗(yàn)中細(xì)胞培養(yǎng)至19 d、20 d進(jìn)行電阻測定，連續(xù)兩天電阻值為(455 ± 40)Ω/cm2，均>250 Ω/cm2。

圖2 化合物KY-C002的HPLC色譜圖

注：tR=7.87 min；右側(cè)峰為KY-C002，左側(cè)為酚紅；A：空白溶劑色譜行為圖；B：KY-C002對(duì)照品色譜行為圖；C：細(xì)胞樣品色譜行為圖

圖3 培養(yǎng)20 d顯微鏡下Caco-2細(xì)胞形態(tài) ×40

2.2.3酚紅通透性實(shí)驗(yàn) 取酚紅標(biāo)準(zhǔn)試液5 mg/L 加入到24孔板的Millicell 膜中，于不同時(shí)間取樣(Millicell膜接收池)，酶標(biāo)儀測定其吸光度值，通過酚紅標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算酚紅透過量，計(jì)算Papp。酚紅在 Caco-2 細(xì)胞單層膜的Papp均<10-6cm/s，遠(yuǎn)低于沒有培養(yǎng)細(xì)胞的空白組，說明酚紅從 AP 側(cè)滲漏入 BL 側(cè)較少，膜的完整性良好。在實(shí)驗(yàn)中，也可用肉眼與空白對(duì)照觀察有無酚紅。 見表 1。

表1 酚紅透過試驗(yàn)不同時(shí)間的 Papp(cm/s)

2.3化合物KY-C002轉(zhuǎn)運(yùn)實(shí)驗(yàn)不同濃度Pim-1激酶抑制劑KY-C002的Papp、ER結(jié)果見圖4、表2。結(jié)果表明：① 在考察的濃度范圍內(nèi)，無論從AP側(cè)到BL側(cè)，還是從BL側(cè)到AP側(cè)Papp均與Pim-1激酶抑制劑KY-C002的濃度有關(guān)，不同濃度間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；濃度為10 μg/ml時(shí)的Papp大于5 μg/ml和20 μg/ml時(shí)的Papp。② 在考察的濃度范圍內(nèi)，從AP側(cè)到BL側(cè)Pim-1激酶抑制劑KY-C002的Papp均>10-6cm/s，表明該化合物吸收良好。

圖4 不同濃度Pim-1激酶抑制劑KY-C002的Papp

A：AP側(cè)→BL側(cè)；B：BL側(cè)→AP側(cè)；與5 μg/ml KY-C002比較：*P<0.05；與10 μg/ml KY-C-002比較：#P<0.05

表2 Pim-1激酶抑制劑KY-C002的Papp (n=3,±s)

3 討論

本研究建立了新型Pim-1激酶抑制劑KY-C002 的HPLC色譜檢測方法且完成方法學(xué)驗(yàn)證，結(jié)果表明該方法簡便、靈敏、可靠、專屬性良好，符合定量分析要求。

評(píng)估藥物口服吸收效果的常用方法是整體動(dòng)物實(shí)驗(yàn)，而用細(xì)胞模型進(jìn)行體外吸收特性評(píng)估具有以下優(yōu)點(diǎn)[13]：① 避免動(dòng)物的個(gè)體差異，體外重現(xiàn)性好；② 克服整體動(dòng)物吸收代謝耗藥量大的缺點(diǎn)，尤其適于對(duì)微量樣品的檢測；③ 檢測周期較短，可作為快速藥物篩選工具；④ 可以在分子水平對(duì)藥物分子的吸收、代謝和轉(zhuǎn)運(yùn)進(jìn)行研究。一般來說，連續(xù)2 d測得的電阻值> 250 Ω/cm2的 Caco-2 細(xì)胞單層膜可用于化合物的跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)實(shí)驗(yàn)[14]，本實(shí)驗(yàn)室條件下建立的Caco-2細(xì)胞模型適用于化合物的轉(zhuǎn)運(yùn)實(shí)驗(yàn)。

綜上所述，在考察濃度范圍內(nèi)，新型Pim-1激酶抑制劑KY-C002的Papp與濃度有關(guān)，化合物KY-C002的Papp>10-6cm/s，表明該化合物的吸收良好[14]，具有開發(fā)口服給藥劑型的可能性，為進(jìn)一步開展動(dòng)物體內(nèi)腸吸收實(shí)驗(yàn)提供了參考和基礎(chǔ)。

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