早期區(qū)域動(dòng)脈灌注微量低分子肝素改善高脂血癥性急性胰腺炎微循環(huán)的實(shí)驗(yàn)研究

呂賀賀，項(xiàng)和平，王 偉，李 賀，高 明

近年來(lái)，隨著人民生活水平的不斷提高，人們的飲食結(jié)構(gòu)及生活方式也發(fā)生了很大的變化，高脂血癥、肥胖、糖尿病的發(fā)病率呈逐年上升趨勢(shì)，其中由高脂血癥導(dǎo)致的高脂血癥性急性胰腺炎(hyperlipidemic acute pancreatitis， HLAP)的發(fā)病率也越來(lái)越高。臨床研究[1]表明高脂血癥性急性胰腺炎的發(fā)病率約占據(jù)了全部急性胰腺炎總數(shù)的1.3%～3.8%。HLAP并發(fā)癥多、進(jìn)展迅速、易反復(fù)發(fā)作、重癥化率及死亡率高,其診治具有自身特點(diǎn)[2-3]。但其發(fā)病機(jī)制仍不是十分明確，目前臨床治療效果差強(qiáng)人意，因此積極尋求快速有效的治療HLAP的治療方案已迫在眉睫。本課題組在前期的研究中發(fā)現(xiàn)高脂血癥性胰腺炎中胰腺微循環(huán)功能障礙與病情惡化具有相關(guān)性，推斷胰腺微循環(huán)障礙可能是高脂血癥性胰腺炎病情加重的重要環(huán)節(jié)之一。該文擬探討區(qū)域動(dòng)脈灌注微量低分子肝素(low molecular weight heparin，LMWH)對(duì)HLAP微循環(huán)變化的影響，從而更好地為臨床治療提供一定的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組 健康成年雄性倉(cāng)鼠共60只，清潔級(jí)，30～45 g，飼養(yǎng)在標(biāo)準(zhǔn)實(shí)驗(yàn)室條件下，在整個(gè)實(shí)驗(yàn)過(guò)程中保持飼養(yǎng)環(huán)境的晝夜節(jié)律。所有倉(cāng)鼠自由進(jìn)水，室內(nèi)光照遵循12 h明暗周期(7：30 am開(kāi)燈)，溫度恒定于23～25 ℃，濕度為(55±5)%。均使用相同的高脂飼料(20%豬油+10%膽固醇+1%甲基硫氧嘧啶+1%膽酸鈉+68.9%普通飼料)在同等條件下喂養(yǎng)，飼養(yǎng)4周后取所有動(dòng)物靜脈血檢測(cè)三酰甘油水平，并予以實(shí)驗(yàn)動(dòng)物行肝膽胰B超檢查，隨機(jī)抽出30只三酰甘油水平升高3倍以上且肝膽胰無(wú)病變者作為最終實(shí)驗(yàn)對(duì)象。30只倉(cāng)鼠隨機(jī)均分為3組：區(qū)域動(dòng)脈輸注生理鹽水組(LAI+saline組)、區(qū)域動(dòng)脈輸注低分子肝素組(LAI+LMWH組)、靜脈輸注低分子肝素組(IV+LMWH組)。剩余倉(cāng)鼠作為供體，為試驗(yàn)倉(cāng)鼠供血。所有倉(cāng)鼠每周進(jìn)行稱重，并由專人觀察體質(zhì)量變化情況。

1.1.2各組造模及給藥 ① LAI+saline組：造模成功后關(guān)腹，30 min后經(jīng)腹主動(dòng)脈灌注生理鹽水；② LAI+LMWH組：造模成功后關(guān)腹，30 min后經(jīng)腹主動(dòng)脈灌注等量LMWH；③ IV+LMWH組：造模成功后關(guān)腹，30 min后經(jīng)靜脈灌注等量LMWH。

1.1.3試劑與藥物 3.5%的?；悄懰徕c溶液試劑及生理鹽水(美國(guó)Sigma公司)；已配置的1%戊巴比妥鈉及丫啶橙靶向白細(xì)胞染料(上?；瘜W(xué)試劑公司)；高三酰甘油特質(zhì)高脂飼料(20%豬油+10%膽固醇+1%丙基硫氧嘧啶+1%膽酸鈉+68.9%普通飼料)；Pentax ISC-1000型激光共聚焦顯微鏡(中國(guó)科學(xué)技術(shù)大學(xué)生命科學(xué)實(shí)驗(yàn)中心)；LMWH(Alfa Wassermann公司)。

1.2實(shí)驗(yàn)方法各組倉(cāng)鼠在造模前均禁食12 h，自由飲水。最終篩選出高脂飼料喂養(yǎng)的倉(cāng)鼠后使用1%戊巴比妥鈉(0.3 mg/100 g)腹腔麻醉，平臥固定，備皮、消毒、鋪巾，經(jīng)上腹部劍突下橫行正中切口進(jìn)腹，切口約2～3 cm，顯露肝下間隙，暴露十二指腸，將十二指腸翻出體外。先找到肝總管，用無(wú)創(chuàng)血管夾夾閉近端，然后用密閉式靜脈留置針(24GA×0.75IN Y型)從十二指腸壁進(jìn)入胰膽管，向胰膽管內(nèi)推進(jìn)5 mm，見(jiàn)膽汁和胰液流出后，用細(xì)絲線在壺腹部乳頭開(kāi)口處結(jié)扎防止注射液回流；同時(shí)于膽總管上端用小動(dòng)脈夾鉗夾閉，防止注射液上行流入肝內(nèi)，將3.5%?；悄懰徕c溶液用微量注射泵恒速注入胰膽管內(nèi)，用量1 ml/kg體重，以0.2 ml/min的速度注射完畢，保持壓力8 min后除去血管夾，拔出針頭。造模完畢，暫時(shí)關(guān)閉腹腔防止體液丟失。實(shí)驗(yàn)過(guò)程中小鼠背部皮下注射生理鹽水補(bǔ)充血容量，維持中心靜脈壓(CVP)在0.532～0.798 kPa及心率(HR)、平均動(dòng)脈壓(MAP)波動(dòng)范圍在10%左右。術(shù)中胰腺出血、失血過(guò)多及死亡倉(cāng)鼠被剔除出實(shí)驗(yàn)過(guò)程。造模后30 min時(shí)，充分顯露腹主動(dòng)脈主干，從腹主動(dòng)脈插管至近肝動(dòng)脈處，結(jié)扎固定，LAI+LMWH組注入LMWH 20 IU/kg使全身肝素化，LAI+saline組以同樣的方法注入等量生理鹽水，IV+LMWH組經(jīng)靜脈輸注等量的LMWH，3組均經(jīng)外周靜脈注入吖啶橙靶向白細(xì)胞熒光染料(2 ml/kg)，注射完畢后以激光共聚焦顯微鏡熒光成像系統(tǒng)動(dòng)態(tài)觀察活體動(dòng)物模型胰腺微循環(huán)，檢測(cè)微循環(huán)血管平均直徑(microvascular diameter，MVD)、功能性毛細(xì)血管密度(functional capillary density，F(xiàn)CD)及微循環(huán)血流速度(microvessel flow velocity，MFV)、白細(xì)胞黏附水平，記錄數(shù)據(jù)。MVD：選取胰頭部正中邊長(zhǎng)為0.5 cm的正方形區(qū)域?yàn)檫x定視野，應(yīng)用圖像分析系統(tǒng)分別測(cè)量所選取視野里各10個(gè)微循環(huán)毛細(xì)血管直徑，最后求出平均值為微循環(huán)毛細(xì)血管直徑(μm)；FCD：應(yīng)用圖像分析系統(tǒng)計(jì)算視野內(nèi)功能性毛細(xì)血管密度(個(gè)/mm2)；MFV的測(cè)量：固定拍攝速度(capture speed)110 fps，回放速度(play speed)10 fps，回放錄像，在監(jiān)視器上找出目標(biāo)微血管，采用陰極射線管群點(diǎn)掃描法進(jìn)行速度測(cè)量(μm/s)；白細(xì)胞黏附：觀察后微靜脈血管內(nèi)皮壁上黏附白細(xì)胞，白細(xì)胞移動(dòng)緩慢超過(guò)30 s的定義為白細(xì)胞黏附，以每平方毫米血管壁黏附白細(xì)胞個(gè)數(shù)計(jì)算(個(gè)/mm2)。

1.3實(shí)驗(yàn)標(biāo)本的獲取及檢測(cè)置動(dòng)物于微循環(huán)觀察盒中，以鹽水棉棒輕柔，充分顯露模型倉(cāng)鼠胰體部(在胰體部選取和胰頭、胰尾等距兩點(diǎn)測(cè)定，測(cè)定時(shí)避開(kāi)大血管或血腫處，最后取平均值作為結(jié)果)，分別在4、6 h后于激光共聚焦微循環(huán)顯微鏡下，活體觀察吖啶橙靶向白細(xì)胞熒光染色后的胰腺微循環(huán)形態(tài)和血流動(dòng)力學(xué)特點(diǎn)，并檢測(cè)胰腺的MVD、FCD、MFV及白細(xì)胞黏附，根據(jù)不同染色時(shí)間、熒光強(qiáng)度、微循環(huán)血流速度對(duì)物鏡、激光功率、探測(cè)針孔、掃描速度各參數(shù)綜合調(diào)整選擇，獲得理想圖像，固定掃描步進(jìn)為5 pm，掃描深度100 pm，顯微鏡物鏡放大倍數(shù)分別選取×10、×20，活體熒光成像系統(tǒng)進(jìn)行圖像采集、錄像。試驗(yàn)后取胰腺組織100 mg，用 10%的甲醛固定，常規(guī)包埋切片，HE染色,在透視電鏡下觀察病理改變,由病理科醫(yī)師按 Schimidt法進(jìn)行胰腺組織病理學(xué)評(píng)分。

2 結(jié)果

2.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的基線數(shù)據(jù)各組倉(cāng)鼠喂養(yǎng)高脂飼料后藥物干預(yù)前的原始各觀察指標(biāo)的胰腺微循環(huán)變化情況，對(duì)比各組倉(cāng)鼠喂養(yǎng)高脂飼料后的數(shù)據(jù)變化，3組飼養(yǎng)后體質(zhì)量、血清(triglycerides,TG)、血清(amylase,AMS)及胰腺微循環(huán)各指標(biāo)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。見(jiàn)表1。

2.2造模后各觀察指標(biāo)變化情況與IV+LMWH 組及LAI+saline組相比，LAI+LMWH組大鼠的MVD、 FCD、MFV有明顯的上升趨勢(shì)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；LAI+LMWH組的白細(xì)胞黏附數(shù)較IV+LMWH 組及LAI+saline下降程度大，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；IV+LMWH組與LAI+saline組相比差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；與6 h時(shí)的LAI+LMWH組相比，4 h的LAI+LMWH組的MVD、FCD、MFV上升程度更明顯。見(jiàn)表2、圖1。

2.3血清三酰甘油和淀粉酶濃度測(cè)定及對(duì)比LAI+LMWH組血清TG水平較IV+LMWH組LAI+saline組顯著下降(P<0.000 1)；LAI+LMWH組血清AMS水平較IV+LMWH組和LAI+saline組明顯降低(P<0.000 1)。見(jiàn)表3。

2.4胰腺病理學(xué)評(píng)分LAI+LMWH組和IV+LMWH組胰腺病理學(xué)評(píng)分低于LAI+saline組，且LAI+LMWH組的下降程度較IV+LMWH組更大(P<0.000 1)。見(jiàn)表3。LAI+saline組胰腺組織中出現(xiàn)凝固性壞死、小葉結(jié)構(gòu)消失、間質(zhì)出血、水腫及中性粒細(xì)胞和單核細(xì)胞浸潤(rùn)的現(xiàn)象；IV+LMWH 組胰腺組織中出現(xiàn)的少量壞死灶、水腫及中性粒細(xì)胞和單核細(xì)胞浸潤(rùn)的炎癥表現(xiàn)；LAI+LMWH組胰腺組織中無(wú)明顯壞死及炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，僅見(jiàn)少量水腫癥狀。見(jiàn)圖2。

3 討論

急性胰腺炎在國(guó)內(nèi)發(fā)病率很高，近幾年HLAP發(fā)病率呈明顯上升趨勢(shì)[4]。高脂血癥性胰腺炎是繼膽源性胰腺炎和酒精源性胰腺炎后的又一胰腺炎的常見(jiàn)病種，其發(fā)病率占急性胰腺炎發(fā)病率的1.3%～3.8%[1]。高脂血癥根據(jù)Frederickson的脂蛋白電泳實(shí)驗(yàn)可分為Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ 5種類型，其中Ⅰ、Ⅴ型以三酰甘油升高為顯著特征，Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ以單純的膽固醇升高或合并輕微的三酰甘油升高為顯著特征，且Ⅰ、Ⅴ型高脂血癥并發(fā)急性胰腺炎的病例居多，因此可以肯定的是高三酰甘油血癥較高膽固醇血癥與急性胰腺炎的關(guān)系更為密切。其發(fā)病機(jī)制為普遍認(rèn)可的游離脂肪酸(free fatty acid，F(xiàn)FA)作用機(jī)制，該機(jī)制認(rèn)為三酰甘油在激素敏感性三酰甘油脂肪酶的作用下生成FFA，且FFA不易溶于水，釋放入血后與血漿清蛋白結(jié)合被輸送到全身各組織利用，一般而言在正常情況下1分子清蛋白可與10分子的FFA結(jié)合。但是，當(dāng)發(fā)生高三酰甘油血癥時(shí)，代謝生成的FFA遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過(guò)血漿清蛋白的結(jié)合能力，此時(shí)FFA大量過(guò)剩，就為導(dǎo)致胰腺炎的發(fā)生提供了物質(zhì)基礎(chǔ)。同時(shí)大量的FFA對(duì)胰腺的腺泡細(xì)胞和毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞有直接的細(xì)胞毒作用，其主要通過(guò)白介素(interleukin，IL)-1、IL-6、腫瘤壞死因子(TNF)等細(xì)胞因子的生物膜細(xì)胞毒作用損傷其生物膜，導(dǎo)致細(xì)胞乃至細(xì)胞器腫脹變形和細(xì)胞膜通透性的增高，最后誘發(fā)和加重胰腺的損傷。另外，血液中較高的三酰甘油及FFA加重了血液的黏稠度，同時(shí)激活血小板，使其數(shù)量大大增加，這時(shí)血液自身阻力增大，血流速度緩慢，大量血液淤積于胰腺微循環(huán)內(nèi)，血供受到嚴(yán)重影響。當(dāng)然還可刺激血管產(chǎn)生縮血管物質(zhì)血栓素A2(TXA2)，使得擴(kuò)血管物質(zhì)前列腺素I2明顯減少，導(dǎo)致血管收縮、血栓形成、胰腺微循環(huán)障礙，進(jìn)一步加重了胰腺的損傷。與此同時(shí)許多研究[5]顯示，HLAP的發(fā)生與氧化應(yīng)激有著一定的關(guān)聯(lián)[5]。在氧化應(yīng)激的過(guò)程中，由于活性物質(zhì)的大量產(chǎn)生，可啟動(dòng)炎癥網(wǎng)絡(luò)系統(tǒng)，加重胰腺腺泡細(xì)胞的水腫和壞死，從而引起相應(yīng)的組織功能障礙。

表1 各組倉(cāng)鼠喂養(yǎng)高脂飼料后的體重、血清TG、AMS及MVD、FCD、MFV、白細(xì)胞黏附數(shù)的基線水平±s)

表2 各組倉(cāng)鼠灌注LMWH和saline后MVD、FCD、MFV、白細(xì)胞黏附數(shù)比較±s)

表3 血清三酰甘油、淀粉酶水平及胰腺組織病理學(xué)評(píng)分±s)

圖1 胰腺微循環(huán)各指標(biāo)變化±s)與LAI+saline組比較：#P<0.05；與IV+LMWH組比較：+P<0.05；與6 h LAI+LMWH組比較：*P<0.05

圖2 各組實(shí)驗(yàn)動(dòng)物胰腺組織病理圖 HE×200

肝素作為一種抗凝藥物在臨床上已廣泛應(yīng)用，其主要用于治療和預(yù)防靜脈血栓以及防止血栓的再發(fā)。目前臨床上應(yīng)用的肝素主要有兩種：普通肝素和LMWH，而LMWH與普通肝素相比具有注射吸收好、半衰期長(zhǎng)、生物利用度高、出血副作用少、無(wú)需實(shí)驗(yàn)室監(jiān)測(cè)及抗血栓形成能力強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)。最新研究[6]表明LMWH能與血管內(nèi)皮細(xì)胞結(jié)合，保護(hù)血管內(nèi)皮細(xì)胞，維持血管內(nèi)皮細(xì)胞的完整性，促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞分泌纖溶酶原激活物，抑制血栓素的活化，從而發(fā)揮纖溶和抗血栓作用。范欽橋 等[7]研究發(fā)現(xiàn)LMWH還可通過(guò)抑制核轉(zhuǎn)錄因子( NF-κB )的活性，從而誘導(dǎo)胰腺腺泡細(xì)胞的凋亡，減輕胰腺炎癥程度。與此同時(shí)LMWH也可通過(guò)拮抗內(nèi)皮細(xì)胞分泌內(nèi)皮素-1，使微循環(huán)的穩(wěn)定性增加，抑制胰腺分泌和胰酶活性，維持微循環(huán)通暢。

目前，在我國(guó)大多數(shù)的藥物的給藥途徑多為靜脈輸注。但是，對(duì)于高脂血癥性胰腺炎而言，靜脈輸注LMWH雖有一定的治療效果，在藥物經(jīng)過(guò)體循環(huán)時(shí)，大部分被代謝及滅活，最后到達(dá)胰腺和胰腺周圍組織的有效藥物濃度大大減少[8]。對(duì)于高脂血癥性胰腺炎患者，由于存在嚴(yán)重的胰腺微循環(huán)障礙，胰腺血流量減少，血流速度降低，血管阻塞，毛細(xì)血管血栓形成等，最終導(dǎo)致靜脈輸注的藥物不能在胰腺組織內(nèi)達(dá)到較高的有效治療濃度[9]。相比而言，區(qū)域動(dòng)脈灌注治療可通過(guò)動(dòng)脈導(dǎo)管使得LMWH直接到達(dá)病變部位，避免血胰屏障的損害，從而使得藥物在胰腺內(nèi)達(dá)到較高的治療濃度。張世龍 等[10]研究發(fā)現(xiàn)，區(qū)域動(dòng)脈灌注LMWH對(duì)胰腺炎的微循環(huán)障礙改善程度較靜脈輸注效果更加顯著。顧鳳元 等[11]測(cè)得區(qū)域動(dòng)脈灌注時(shí)，抗生素在胰腺組織中的濃度是全身用藥的3～4倍。本研究顯示LAI+LMWH組與IV+LMWH組相比，LAI改善胰腺微循環(huán)障礙的效果更顯著。因此，這也進(jìn)一步說(shuō)明了區(qū)域動(dòng)脈灌注LMWH的優(yōu)越性。對(duì)于LMWH的使用時(shí)間及使用劑量，至今仍未有統(tǒng)一的結(jié)論，多數(shù)類似實(shí)驗(yàn)中，LMWH的使用時(shí)間一般選擇在造模后2 h或以后，而且劑量為300 IU/kg。而本實(shí)驗(yàn)中使用的LMWH(20 IU/kg)明顯低于該數(shù)值，但仍取得良好的治療效果，提示臨床上可以通過(guò)更改輸注方式提高藥物療效，減少藥物使用劑量，從而避免潛在的藥物副作用。

盡管LMWH治療HLAP微循環(huán)障礙的實(shí)驗(yàn)有很多，但在活體直接觀察胰腺微循環(huán)系統(tǒng)的報(bào)道相對(duì)較少，在本實(shí)驗(yàn)中利用激光共聚焦顯微鏡熒光成像技術(shù)動(dòng)態(tài)觀察活體動(dòng)物模型胰腺微循環(huán)系統(tǒng)，發(fā)現(xiàn)早期區(qū)域動(dòng)脈灌注LMWH對(duì)胰腺微循環(huán)障礙改善較靜脈輸注的效果更加顯著，胰腺病理?yè)p傷評(píng)分明顯降低，這也更好地為臨床應(yīng)用區(qū)域動(dòng)脈灌注微量LMWH治療HLAP提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

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